补体片段C3f对人胚肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原及转化生长因子p1的影响

目的 观察补体片段C3f对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)表达和分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原及转化生长因子(TGF)-β1的影响.方法 将人工合成的17肽片断C3f加入培养基中刺激MRC-5细胞,通过细胞免疫组化和ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1细胞内、外表达情况.结果 随着C3f浓度的增加,MRC-5细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1的表达量逐渐降低,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).MRC-5胞质中TGF-β1的表达量随C3f浓度增加降低趋势,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 C3f能够抑制MRC-5细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原和TGF-β1的形成,减轻肺组织的纤维化程度.     

TGF-β1对皮肤成纤维细胞的P—ERK表达的影响

目的 探讨TGF-β1刺激后对皮肤成纤维细胞中磷酸化ERK表达的影响及相互关系.方法 以原代培养人正常皮肤成纤维细胞为研究对象.细胞分2组：浓度组：10 ng/ml、5 ng/ml、1.0 ng/ml、0 ng/ml.时间组：给予10 ng/ml的TGF-β1刺激不同时间,分别在0、15、30、60、120 min的时间点提取蛋白.采用Western blotting法检测成纤维细胞中磷酸化ERK蛋白的表达变化.结果 浓度组及时间组p-ERK蛋白表达与对照组相比均有差异（P〈0.05）,随着TGF-β1剂量增加和作用时间延长,其磷酸化ERK蛋白表达水平逐渐增强,在TGF-β1 5 ng/ml时p-ERK水平达作用最强,在作用60 min时p-ERK达高峰.结论 随着TGF-β1浓度增加及作用时间延长,大剂量TGF-β1时可上调体外培养成纤维细胞内的ERK信号蛋白活性.TGF-β1诱导的成纤维细胞的p-ERK水平增高可能是依赖ERK通路激活的,但ERK通路与TGF-β/Smad通路存在交互作用的机制,目前还无定论.     

人瘢痕组织成纤维细胞的培养

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是皮肤伤口愈合过程中瘢痕组织过度增生性病变.近年来,国内外很多学者运用成纤维细胞培养技术,在体外控制条件下研究瘢痕组织来源的成纤维细胞生长增殖、胶原合成、形态结构及其影响调控因素,而这一系列研究的基础就是怎样快速、优质、高效地成功培养出瘢痕成纤维细胞.我们经过多年的实践摸索出一套稳定的原代细胞培养方法,现将人瘢痕成纤维细胞培养方法报告如下.     

曲安奈德联合直流电场对兔耳增生性瘢痕治疗的初步探究

目的:探讨曲安奈德联合直流电场治疗兔耳增生性瘢痕的疗效。方法:选取28只家兔,随机分为4组,制作瘢痕模型~([1]),术后5周开始处置,A组局部注射生理盐水,B组局部注射曲安奈德,C组每周外加直流电场的作用,D组曲安奈德和直流电场联合应用。术后11周切取标本,HE染色,计数成纤维细胞密度,观察成纤维细胞的排列,计算瘢痕相对增生厚度。结果:大体形态学变化:联合组治疗6周后,瘢痕颜色接近兔耳正常肤色,表面光滑,触感柔软。组织学变化:与其它三组相比,联合组胶原纤维和成纤维细胞平行排列,成纤维细胞数量减少。瘢痕增生指数:联合组HI值最低。结论:局部注射曲安奈德与直流电场联合应用对兔耳增生性瘢痕有明显疗效。     

脂多糖对增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响

目的探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对皮肤成纤维细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响,以了解LPS在增生性瘢痕形成中的生物学作用。方法取正常皮肤按黄勇等方法行成纤维细胞培养后,分为1个对照组及6个实验组。实验组分别与终浓度为0.005、0.010、0.050、0.100、0.500和1.000μg/ml大肠杆菌LPS(E.coli055:B5)培养,对照组为DMEM培养。分别通过MTT比色法及细胞计数法观察各组1～9d吸光度(A)值和细胞数量的变化;并对刺激后细胞进行传代,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及胶原酶mRNA的表达,并以同一个体相同代数的瘢痕组织成纤维细胞作对照。结果与对照组比较,0.005～0.500μg/ml组A值增加,于5～9d差异有统计学意义(P<0.05);1.000μg/ml组A值降低,于3～9d差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,0.005～0.500μg/ml组细胞数量显著增加,于1～6d差异有统计学意义(P<0.05);1.000μg/ml组细胞数量显著降低,于2～9d差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,0.005～0.500μg/ml组促进细胞胶原合成,且0.100μg/ml组作用达高峰(P<0.05),1.000μg/mlLPS抑制细胞胶原合成(P<0.05)。LPS刺激浓度在0.005~0.100μg/ml时,促进正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达,抑制胶原酶mRNA表达,且呈一定的剂量依赖性;当LPS刺激浓度为0.500μg/ml,上述作用下降;而当LPS刺激浓度到达1.000μg/ml时,抑制正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达,促进胶原酶mRNA表达。LPS刺激浓度在0.100μg/ml时,成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达与同一个体增生性瘢痕组织成纤维细胞近似。结论 LPS对正常人皮肤成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的直接调节可能是其参与增生性瘢痕形成的重要机制。     

脂多糖对增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞增殖及I、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响

目的探讨脂多糖（hpopolysaccharide,LPS）对皮肤成纤维细胞增殖和I、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响．以了解LPS在增生性瘢痕形成中的生物学作用。方法取正常皮肤按黄勇等方法行成纤维细胞培养后,分为1个对照组及6个实验组。实验组分别与终浓度为O．005、0．010、O．050、0．100、0．500和1．000μg／ml大肠杆菌LPS（E．coli055：B5）培养,对照组为DMEM培养。分别通过MTT比色法及细胞计数法观察各组1—9d吸光度（A）值和细胞数量的变化;并对刺激后细胞进行传代,用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）法测定成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA及胶原酶mRNA的表达,并以同一个体相同代数的瘢痕组织成纤维细胞作对照。结果与对照组比较,0．005～0．500μg/ml组A值增加,于5～9d差异有统计学意义（P〈0．05）;1．000μg／ml组A值降低,于3～9d差异有统计学意义（P〈0．05）。与对照组比较,0．005～O．500μg／ml组细胞数量显著增加,于1～6d差异有统计学意义（P〈O．05）;1．000μg／ml组细胞数量显著降低,于2～9d差异有统计学意义（P〈0．05）。与对照组比较,0．005～O．500μg／ml组促进细胞胶原合成,且O．100μg/ml组作用达高峰（P〈O．05）,1．000μg／mlLPS抑制细胞胶原合成（p〈O．05）。LPS刺激浓度在0．005～0．100μg/ml时,促进正常皮肤成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA表达,抑制胶原酶mRNA表达,且呈一定的剂量依赖性;当LPS刺激浓度为O．500μg／m1,上述作用下降;而当LPS刺激浓度到达1．000μg／ml时,抑制正常皮肤成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA表达,促进胶原酶mRNA表达。LPS刺激浓度在0．100μg／ml时．成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达与同一个体增生性瘢痕组织成纤维细胞近似。结论LPS对正常人皮肤成纤维细胞增殖及I、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的直接调节可能是其参与增生性瘢痕形成的重要机制。     

脂多糖对增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响

目的探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对皮肤成纤维细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达的影响,以了解LPS在增生性瘢痕形成中的生物学作用。方法取正常皮肤按黄勇等方法行成纤维细胞培养后,分为1个对照组及6个实验组。实验组分别与终浓度为0.005、0.010、0.050、0.100、0.500和1.000μg/ml大肠杆菌LPS(E.coli055:B5)培养,对照组为DMEM培养。分别通过MTT比色法及细胞计数法观察各组1～9d吸光度(A)值和细胞数量的变化;并对刺激后细胞进行传代,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA及胶原酶mRNA的表达,并以同一个体相同代数的瘢痕组织成纤维细胞作对照。结果与对照组比较,0.005～0.500μg/ml组A值增加,于5～9d差异有统计学意义(P<0.05);1.000μg/ml组A值降低,于3～9d差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,0.005～0.500μg/ml组细胞数量显著增加,于1～6d差异有统计学意义(P<0.05);1.000μg/ml组细胞数量显著降低,于2～9d差异有统...     

二氧化硅刺激矽肺肺泡巨噬细胞上清介导的人胚肺成纤维细胞Ⅲ型胶原和Ⅲ型前胶原的表达

目的 探讨经SiO2刺激的肺泡巨噬细胞(AM)通过人胚肺成纤维细胞(HELF)对Ⅲ型胶原(CⅢ)和Ⅲ型前胶原(pCⅢ)表达的影响及抗TGF-β1抗体的干预作用.方法 收集矽肺患者AM,将其分为加入SiO2粉尘悬液的处理组和仅加入无血清培养液的对照组.培养18 h后获取培养上清.将原代培养的HELF分为:(1)处理组:加入经SiO2刺激的AM上清;(2)对照组:加入未经SiO2刺激的AM上清;(3)空白对照组:仅加入含体积分数为3%胎牛血清的DMEM;(4)处理组+抗转化生长因子β1(TGF-β1)抗体干预组:在处理组的基础上加上抗TGF-β1抗体(10 μg/ml);(5)对照组+抗TGF-β1抗体干预组:在对照组的基础上加上抗TGF-β1抗体(10 μg/ml).前3组分别培养6、12、18、24、36、48 h,后2组分别培养18、24、36 h,用免疫细胞化学法检测HELF中pCⅢ的表达,用免疫印迹(Western blot)法检测HELF条件培养上清中CⅢ的表达.结果 与对照组(0.1212±0.0079、0.1414±0.0058、0.1620±0.0081、0.1965±0.0103、0.1715±0.0116)相比,处理组12、18、24、36和48 h pCⅢ表达(0.1423±0.0107,0.1624±0.0011,0.1925±0.0056,0.2421±0.0097,0.2102±0.0103)明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).与对照组(0.2296±0.0121、0.2778±0.0116、0.3367±0.0269、0.3722±0.0214)相比,处理组12、18、24、36、48 hCⅢ含量(0.2559±0.0061、0.3249±0.0110、0.4171±0.0193、0.5441±0.0452、0.4751±0.0252)明显增高,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).与同期相对应的非干预组相比,18、24、36 h抗TGF-β1抗体干预组CⅢ和pCⅢ均明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).结论 SiO2经AM的介导,诱导HELF高表达CⅢ和pCⅢ,部分效应是通过TGF-β1起作用.

Abstract：

Objective To study the effects of supernatant of alveolar macrophages (AM) exposed to SiO2 on the expression of type Ⅲ collagen and type Ⅲ procollagen in human lung fibroblasts (HELF) and the intervention effects of anti-TGF-β1 antibody Methods AMs collected from a silicotic by bronchoalveolar lavage were divided into 2 parts, one part was exposed to SiO2 and other part served as control. The supernatant was obtained from AMs cultured for 18 h. HELF were divided into (1) exposure group, which was added with supernatant from AMs exposed to SiO2; (2) control group, which was added with the supernatant from AMs not exposed to SiO2; (3) blank control group, which was added with DMEM; (4) exposure group plus anti-TGF-β1antibody (10μg/ml); (5) control group plus anti-TGF-β1 antibody (10 μg/ml). (1)-(3) groups were cultured for 6, 12, 18, 24, 36, 48h, respectively. (4)-(5) groups were cultured for 18, 24, 36, respectively.Immunocytochemical test and Western blot assay were used to detect pC Ⅲ expression levels in HELF and C Ⅲ expression levels in the supernatant of HELF culture, respectively. Results The pC Ⅲ expression levels of exposure group were 0.1423 ±0.0107,0.1624±0.0011,0.1925 ±0.0050,0.2421 ±0.0097 and 0.2103 ±0.0103,respectively, which were significantly higher than those (0.1212±0.0079、0.1414±0.0058、0.1620±0.0081、0.1965±0.0103 、0.1715±0.0116) of control group (P＜0.05 or P＜0.01). The C Ⅲ levels of exposure group were (0.2559±0.0061、0.3249±0.0110、0.4171±0.0193、0.5441 ±0.0452、0.4751±0.0252), respectively, which were significantly higher than control group (0.2296±0.0121、0.2778±0.0116、0.3367±0.0269、0.3722±0.0214). The pC Ⅲ and C Ⅲ expression levels of exposure plus anti-TGF-β1 antibody group were significantly lower than those of control plus anti-TGF-β1 antibody group (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion AMs exposed to SiO2 can induce the elevated pC Ⅲ and C Ⅲ expression levels in HELF by TGF-β 1 to some extent.     

黄瓜香提取物对大鼠肝纤维化拮抗作用

目的 研究黄瓜香对大鼠肝纤维化拮抗作用。方法 将48只大鼠随机分为正常对照组、模型组、生理盐水组和黄瓜香干预组,全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP),苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏显微结构,免疫组织学染色检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子β₁(TGF-β₁)。结果 黄瓜香干预组ALT,AST和ALP分别为(70.8±12.3),(112.3±26.4)和(169.1±21.2)U/L,与模型组比较,明显降低(P<0.01);黄瓜香干预组肝Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA及TGF-β₁表达与正常对照比较差异无统计学意义(P>0.05),而与模型组比较,表达则明显增强,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 黄瓜香提取物可干预肝纤维化过程,明显减少纤维化组织面积。     

接尘工人血清转化生长因子-β1的含量

目的探讨转化生长因子-β1在尘肺病发生中表达水平的变化。方法采用双抗体夹心ELISA法测定尘肺组、接尘组和对照组血清中(TGF-β1)含量。结果水泥生产场所中的粉尘浓度最高达97.2 mg/m3,各测试点的粉尘浓度平均值均超过容许限值,尘肺组TGF-β1水平(61.72 ng/ml)高于接尘组(30.61 ng/ml)和对照组(21.23 ng/ml),差异有统计学意义(P0.01),接尘组与对照组差异无统计学意义(P0.05)。结论血清中TGF-β1与尘肺发生有关,可以作为尘肺的生物学检测指标。     

成肌细胞介导的hIGF-1基因转移促骨折愈合实验研究

目的观察携带外源人胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,hIGF-1)基因的成肌细胞体内局部注射对小鼠胫骨骨折愈合的影响。方法将42只8周龄雄性C57小鼠随机分成两组,建立左胫骨骨折的动物模型。分别在实验组和对照组骨折周围肌肉组织中多点注射0.3ml转基因成肌细胞悬液和等量生理盐水,术后于第2、3、4周每组各处死7只,行HE染色,观察形成骨痂面积的大小和组成成分的变化;术后第2、4周免疫组织化学染色分析外源性细胞在体内有无存活并表达hIGF-1;术后2、4周行X线摄片以观察骨折愈合情况并采用透射电镜观察骨痂生长情况。结果各实验组转基因成肌细胞BrdU免疫组化染色阳性;各实验组hIGF-1免疫组化染色阳性;所有实验组外骨痂中小梁骨占骨痂总面积的百分比均高于对照组,其中第3、4周经F检验两组的差异具有显著性(p<0.05);X线显示第4周实验组有较多骨痂形成,经秩和检验与对照组有显著差异(p<0.05);电镜显示实验组骨生成细胞的数量、活跃程度和胶原纤维的数量、分布均优于对照组。结论局部注射转hIGF-1基因的成肌细胞对小鼠胫骨骨折愈合有一定的促进作用。     

大鼠心肌缺氧缺血再灌注损伤及心肌重塑的相关研究

目的观察窒息大鼠心肌缺氧缺血再灌注损伤后,心肌组织基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）、转化生长因子-β1（transforming growth factor—β1,TGF—β1）的表达与损伤修复及窒息后心肌重塑的相关性。方法模拟大鼠常压窒息模型,制作缺氧缺血再灌注损伤大鼠动物模型。将60只7d--10dWistar鼠,随机分成窒息组（n=45）和对照组（D组,n=15,不窒息处理）。窒息组根据窒息后复氧时间不同分为A,B,C组（分别为复氧后1d,7d,14d）,每组各15只。快速定量检测血清心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ,cTnⅠ）,Masson染色测定胶原组织容积测算（collagen volume fraction,CVF）,同时利用HE染色观察心肌组织病理学改变,免疫组化法测定心肌组织基质金属蛋白酶-3,-9的活性;免疫组化法进行定性及半定量分析心肌转化生长因子-β1的表达。结果血清心肌肌钙蛋白Ⅰ呈一过性增高,A组明显高于D组（P〈0．01）;B,C组下降,与D组比较,差异无显著意义（P〉0．05）。心肌组织基质金属蛋白酶-3活性呈驼峰样增高,与D组比较,A,B,C组均升高,以B组升高最显著（P〈0．05）。基质金属蛋白酶9活性A,B,C组呈逐渐升高趋势,与D组比较,差异有显著意义（P〈0．05）。窒息后,A,B,C组胶原组织容积测算值逐渐升高,A组与D组比较,差异无显著意义（P〉0．05）;B,C组与D组比较,差异有显著意义（P〈0．01）,且C组最高。A,B,C组转化生长因子-β1表达,随窒息时间延长而升高明显,A组与D组比较,差异无显著意义（P〉0．05）;B,C组与D组比较,差异有显著意义（P〈0．01）。胶原组织容积与转化生长因子-β1表达呈正相关（r=0．574,P〈0．01）;基质金属蛋白酶-3,-9与胶原组织容积呈正相关（r=0．482,0．679;P〈0．05）。结论新生鼠窒息后造成缺氧缺血再灌注损伤,心肌组织基质金属蛋白酶-3,-9激活,转化生长因子-β1表达增强,继发胶原组织容积增高。基质金属蛋白酶-3,-9与转化生长因子-β1,可能参与心肌与缺氧缺血再灌注损伤的自我修复损伤后心肌重塑。     

关节腔内注射IGF-1修复关节软骨缺损及预防骨关节炎的实验研究

目的探讨关节腔内注射胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对修复关节软骨缺损及预防骨关节炎的作用。方法20只雄性成年新西兰大白兔随机分成A、B、C、D4组,每组5只,A、B、C三组分别在膝关节滑车处钻孔造成关节软骨全层缺损,以右膝为实验侧,术后向关节腔内注射1mg/ml的IGF-10.1ml,每周1次;左膝为对照侧,与实验组同一时间注射等量生理盐水;D组为正常对照组,不作任何处理。于术后1、4、8周分别取材进行大体观察,HE和Safranin O染色评分,同时运用免疫组织化学方法观察IGF-1及IGF-1R的表达情况。结果各组实验侧软骨缺损处组织的修复情况均优于对照侧,并且实验侧在各组软骨缺损周围的正常软骨未发生明显退变,而对照侧周围软骨在4、8周时发生了不同程度的退变,周围软骨中IGF-1的表达实验侧与正常组比较无统计学意义(p>0·05),而对照侧4、8周与正常组比较差异有显著性(p<0·01);IGF-1R的表达在各组实验侧和对照侧与正常组比较均无统计学意义(p>0·05)。结论IGF-1在关节软骨缺损早期即行关节腔内注射可有效的促进关节软骨缺损的修复,并延缓周围软骨的退变,从而预防骨关节炎(osteoarthritis,OA)的发生。     

葡多酚对大鼠肝脏TNF-α与TGF-β_1mRNA异常表达的抑制作用

目的: 研究葡多酚(GPC)对N-亚硝基化合物引发的大鼠肝细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA与转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA异常表达的抑制作用。 方法:将大鼠随机分为正常对照组、阳性对照组和2个GPC实验组,每组10只,雌雄各半。后3组给口服50 mg/kg bw亚硝酸钠诱发突变,2个GPC实验组经口分别给予GPC100 mg/kg bw和10 mg/kg bw,喂养8 w,体内灌注固定肝组织,用原位杂交技术检测肝细胞TNF-αmRNA与TGF-β1 mRNA的表达水平。 结果: 阳性对照组TNF-αmRNA与TGF-β1 mRNA表达的阳性细胞率分别为30.23%和19.47 %,高剂量GPC组则为11.94 %和6.96 %,低剂量GPC组分别为18.16%和14.03%,与阳性对照组之间的差别均有显著性意义(P<0.05)。结论: 葡多酚对N-亚硝基化合物引发的大鼠肝细胞TNF-αmRNA与TGF-β1 mRNA的异常表达均有抑制作用。