葡萄球菌肠毒素B基因的PCR快速检测法

目的 建立快速检测葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 ①根据SEB基因的序列,设计PCR引物特异性扩增靶基因片段.通过对1株产SEB金黄色葡萄球菌和9株对照菌株进行PCR检测,评价该方法的特异性;通过对产SEB金黄色葡萄球菌菌株做10倍系列稀释后进行PCR检测,评价该方法的敏感性;②分析30株金黄色葡萄球菌SEB基因的携带情况.结果 ①建立PCR方法快速检测SEB基因,扩增产物长度为494 bp.PCR反应体系中有26 CFU的产SEB金黄色葡萄球菌即可检出SEB基因;②30株分离的金黄色葡萄球菌中有2株携带有SEB基因.结论 PCR法可以快速、敏感地检测SEB基因,为金黄色葡萄球菌食物中毒诊断提供依据.     

镉对人肝癌细胞增殖及凋亡影响

目的 研究镉对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法 体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721分别以0、40、80、160μmol/L的CdCl2处理0～48 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,分光光度法检测半胱天冬酶Caspase-3酶活性的变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(western blot)法测Caspase-3 mRNA和蛋白表达的变化。结果 随着镉处理浓度的增加,氯化镉对细胞活力的抑制作用明显增强,40、80、160μmol/L氯化镉处理SMMC-7721细胞,其抑制率分别为33.94%、48.04%和68.54%,均明显高于0μmol/L氯化镉处理组,差异均有统计学意义(P<0.01);40、80、160μmol/L镉处理组细胞的凋亡百分率分别为(25.77±4.66)%、(34.97±9.25)%和(55.14±5.67)%,与0μmol/L镉处理组比较明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01);镉处理SMMC-7721细胞24和48 h,Caspase-3相对酶活性均随着镉浓度的增加而明显增强;40μmol/L镉处理SMMC-7721细胞,12、24和48 h可明显上调细胞中Caspase-3基因及蛋白的表达,Caspase-3基因mRNA表达水平分别为对照组的4.1、3.7和3.9倍,Caspase-3蛋白表达分别为对照组的5.8、6.0和7.2倍。结论 镉能明显抑制人肝癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,Caspase-3基因在镉诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中起着重要的作用。     

胶体金免疫层析法检测葡萄球菌B型肠毒素

目的通过优化制备中各关键步骤的实验条件,建立快速检测葡萄球菌B型肠毒素的胶体金免疫层析法。方法采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备直径16nm的胶体金溶液,葡萄球菌B型肠毒素多克隆抗体制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果用柠檬酸三钠还原法制备的16nm胶体金溶液呈亮红色,其颗粒大小比较均一。胶体金标记抗体蛋白的最低稳定量为15μg／mL,最适稳定量为18μg／mL,标记的最适pH为7．8。此方法检测限为0．2μg/mL,准确度为94．9％。结论制备了葡萄球菌B型肠毒素胶体金免疫试纸条,该方法简便、快速,而且灵敏度高、稳定性强,适用于食品中葡萄球菌B型肠毒素的快速检测。     

葡萄球菌肠毒素A、B检测的免疫芯片技术研究

目的:建立用于葡萄球菌肠毒素A、B检测的免疫芯片技术方法。方法:采用双抗体夹心法原理进行免疫芯片的技术研究,对影响免疫芯片检测结果的实验条件进行了优化。结果:实现了在同一张芯片上同时检测葡萄球菌肠毒素A、B,按优化后的条件检测SEA、SEB,最低检测限均为1 ng/m l。结论:对葡萄球菌肠毒素A、B进行了免疫芯片的制作,可以实现待测物的测定。     

PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E基因的研究

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的PCR方法,实现同一台PCR仪、同一PCR反应条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE,用于金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法:根据已公布的SEA、SEB、SEC、SEE编码的基因序列,设计4对引物,优化反应条件,建立检测方法,对特异性和敏感性进行分析,并对扩增产物进行测序鉴定。结果:方法特异性分析表明能很好区分各种肠毒素基因型,灵敏度达0.8-1.0×102 CFU/ml。结论:建立了一种在同一台PCR仪、同一PCR条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE的方法,可用于金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断和肠毒素的分型检测。     

葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、原核表达和鉴定

目的克隆葡萄球菌肠毒索A(SEA)基因,构建其原核表达系统,鉴定重组蛋白(rSEA)免疫原性。方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建pET32a-SEA表达质粒,转化入E.coli BL21DE3宿主菌,通过IPTG诱导表达,分离、纯化及Western印迹法鉴定。结果PCR获得SEA基因片段,DNA测序结果与已报道的SEA基因序列(GenBank No:L22566,AP004828)一致,构建了pET32a-SEA表达质粒,并成功地诱导、纯化了rSEA蛋白,rSEA表达量约为细菌总蛋白的40%。结论成功克隆了SEA全长基因,构建了rSEA原核表达系统,为进一步研制SEA的单克隆抗体及诊断试剂盒奠定了基础。     

对近年来本市分离的金黄色葡萄球菌进行肠毒素检测与分析

目的:了解分离于四类不同样品的97株金黄色葡萄球菌携带肠毒素的情况。方法:采用mini VI-DAS酶联荧光免疫分析仪对此97株金黄色葡萄球菌进行肠毒素的检测。结果:97株菌中,有39株菌能产肠毒素,阳性率为40.2%,其中,分离自即食类食品的25株被测菌中,有17株肠毒素阳性,阳性率达68.0%。结论:食品样品中分离的金黄色葡萄球菌产肠毒素的阳性率较高,具有引发急性胃肠炎等食物中毒的潜在危害。     

沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体内外肿瘤血管的影响

目的观察沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体内外肿瘤血管的影响。方法体外实验：将不同浓度的沙利度胺作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,采用ELISA方法测定细胞株VEGF分泌量变化。体内实验：首先建立肝癌细胞株SMMC-7721的荷瘤小鼠模型,应用免疫组化测定瘤体组织中微血管密度,ELISA法测定小鼠外周血VEGF表达。结果体外实验中随着沙利度胺药物浓度增加,VEGF含量逐渐下降：沙利度胺浓度从0μg／ml升至400μg／ml,VEGF值由（83．21±8．32）pg／ml降至（33．59±10．98）pg／ml;体内实验：成功建立了肝癌细胞株SMMC-7721的荷瘤小鼠模型,沙利度胺组小鼠外周血VEGF含量为（32．17±12．11）pg／ml,对照组为（69．35±17．56）pg／ml,在沙利度胺瘤体中微血管密度值为13．17±3．15,对照组为18．34±2．25,均有显著性差异（P〈0．01）。结论沙利度胺能抑制SMMC-7721细胞株及荷瘤鼠肿瘤血管的形成。     

Wnt3a对小鼠beta细胞株增殖的影响

目的 分析wnt3a蛋白对小鼠胰腺beta细胞株增殖的影响. 方法 培养MIN6细胞株,并用不同浓度的wnt3a蛋白或者相同浓度wnt3a蛋白在不同时间点刺激M1N6细胞,用Western blot的方法检测MIN6细胞内的信号分子.改变.培养MIN6细胞株,并用wnt3a蛋白刺激,分别在第0、1、2、3、4 d分裂并数细胞个数,比较有wnt3a刺激组与无wnt3a刺激组细胞个数有无区别. 结果不同浓度wnt3a刺激,对于MIN6细胞内beta-catenin以及Pitx2的表达有影响,当wnt3a浓度为1:8时,beta-catenin以及Pitx2的表达最高.用1:8的wnt3a蛋白浓度刺激MIN6细胞,分别设置0 min、10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h.结果 显示6 h时,beta-catenin表达量最高.比较控制组与wnt3a刺激组细胞增殖的区别,wnt3a蛋白刺激组细胞增殖程度明显高于控制组. 结论 wnt3a可以促进胰腺beta细胞的增殖,表明wnt信号通路对于胰腺beta细胞有重要的调控作用.     

杨梅素对人肺腺癌细胞增殖的影响及其机制

目的研究杨梅素(myricetin,Myr)对人肺腺癌(A549)细胞增殖的影响及其作用机制。方法以人肺腺癌系A549细胞为离体研究对象,通过噻唑蓝(MTT)法研究不同浓度的Myr对A549细胞生长的抑制作用并测定其半数抑制浓度(IC50);采用Westernblot法检测Myr对蛋白激酶B(Akt)磷酸化水平的影响。结果Myr对A549细胞具有明显的增殖抑制作用,随着Myr浓度的增加,细胞的存活率明显降低。Myr作用72h的IC50值为41.7μg/ml。32μg/ml杨梅素无血清作用A54912h即可显著抑制AktSer473的磷酸化水平。结论Myr能够剂量依赖性抑制A549细胞增殖,Akt的活性下调可能是Myr体外诱导人A549肺腺癌细胞增殖抑制作用的分子靶点。     

芜菁汁对正常肝细胞及肝癌细胞株的影响

许多研究表明 ,某些蔬菜特别是十字花科蔬菜对致突变的活性有抑制作用 [1 ,2 ]。流行病学和动物资料表明 ,花椰菜、甘蓝、花菜等十字花科蔬菜具有肿瘤化学预防作用 [3]。芜菁 ( Brassica rapa Linn)属十字花科芸苔属蔬菜 ,其块根肥大、扁圆如盘 ,俗称盘菜。盘菜为温州特产 ,其块根肉质 ,洁白 ,脆嫩 ,营养丰富 ,颇受消费者喜爱。研究表明 ,温州产芜菁块根汁及叶汁对 6 0 Co-γ引起的辐射损伤均具有明显的防护和修复效应[4 ,5] ;对环磷酰胺引起的突变有明显的抑制作用 [6 ] 。本研究观察芜菁块根汁对 L-0 2细胞与 SMMC-772 1细胞生长的影…     

超抗原SEB对直肠腺癌TIL扩增的研究

目的 观测超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）对直肠腺癌肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的激活扩增作用。方法 以SEB和细胞因子IL-2分别刺激扩增人中分化直肠腺癌TIL，比较分析TIL细胞数的变化，IL-2和TNF-α分泌的变化。结果 SEB对直肠腺癌TIL有较强大的刺激作用。无论在细胞数量的增加，还是在促进细胞因子的分泌方面，SEB均显示了其对TIL强大的刺激功效。和IL-2相比，SEB对直肠腺癌TIL的刺激更为迅速，早期SEB的刺激作用较IL-2强大，后期则较IL-2弱。结论SEB是一种良好的TIL激活剂。     

选择性COX-2抑制剂对大肠癌细胞生长的影响

目的　观察塞来昔布对大肠癌细胞株HT -2 9细胞增殖和凋亡的影响 ,为治疗结肠癌寻找安全有效的化疗药物。方法　采用噻唑蓝 (MTT)比色法 ,流式细胞仪 (FCM)、吖啶橙 /溴化乙啶染色结合荧光显微镜等技术 ,研究塞来昔布对HT -2 9细胞增殖和凋亡的影响。结果　MTT比色法显示体外塞来昔布抑制HT -2 9细胞生长 ,呈浓度和时间依赖性。FCM结果显示典型的亚二倍体“凋亡峰” ,凋亡率在 ( 7 3 1± 2 3 7) %～ ( 4 8 3± 2 86) %;使G0 /G1 期细胞比例升高 ,S期和G2 /M期比例下降 ,呈一定剂量依赖关系。荧光显微镜下见典型的凋亡形态学改变 :细胞体积缩小、细胞核固缩、凋亡小体形成等。凋亡比例呈剂量和时间依赖。结论　体外塞来昔布抑制HT -2 9细胞增殖 ,并诱导细胞凋亡。这种作用可能与阻止细胞周期进展有关     

芬太尼对MCF-7细胞增殖和细胞周期影响研究

目的　探讨芬太尼对MCF -7细胞增殖和细胞周期的影响及其机制。方法　MCF -7细胞在不同浓度芬太尼、纳洛酮和两药联合干预后 ,采用MTT法检测细胞增殖活性 ;流式细胞术检测细胞周期 ;免疫细胞化学染色SP法检测p5 3、p2 1/WAF1的表达。结果　芬太尼浓度≥ 0 1μmol/L时 ,细胞增殖活性较对照组显著下降 (P <0 0 5 ) ,其效应与时间和浓度均呈正相关 (P <0 0 1) ,72h半数抑制浓度 (IC50 )为 0 81± 0 0 2 μmol/L。随着芬太尼浓度增加 ,G0 /G1期比例逐渐增加 ,(S +G2 /M )期比例逐渐减少。芬太尼组浓度≥ 0 1μmol/L时 ,细胞增殖活性较对照组显著下降 (P <0 0 5 ) ,较纳洛酮和芬太尼联合给药组差异无显著性。给予芬太尼 10 μmol/L后胞核内p5 3、p2 1/WAF1AOD显著增加 (P <0 0 5 )。结论　芬太尼浓度和时间依赖性抑制MCF -7细胞增殖 ,主要是将细胞阻滞在G1期 ;其机制可能是上调野生型p5 3和p2 1/WAF1的表达。     

沉默CDK6对人卵巢癌细胞增殖和粘附的影响

目的探讨沉默周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)基因对人卵巢癌HO-8910细胞增殖和粘附能力的影响。方法设计合成5条特异性CDK6 shRNA转染HO-8910细胞,检测转染前后细胞内CDK6 mRNA的表达变化;选出抑制作用最强的CDK6-shRNA转染HO-8910细胞,用MTT法检测转染前后HO-8910细胞增殖和粘附能力的变化。结果CDK6 shRNA-608表达载体明显抑制了HO-8910细胞中CDK6基因mRNA的表达,转染48 h后,细胞的增殖能力和粘附能力明显下降,与无关序列组和空白对照组比,差异显著(P<0.05)。结论沉默CDK6基因可抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖和粘附能力。     

雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病细胞SUP-B15的增殖、凋亡与自噬的影响

目的探讨雷帕霉素(RAPA)对人急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞的增殖、自噬与凋亡的影响。方法常规方法复苏、传代培养SUP-B15细胞,设置空白对照组(正常培养)、雷帕霉素处理组。处理24、48、72 h后收集细胞,采用MTT比色法检测细胞的活性和增殖能力;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;吖啶橙单染及透射电镜观察细胞自噬现象。结果 MTT检测结果显示,RAPA对SUP-B15细胞增殖有较强抑制作用(IC50=18.174 nmol/L),且抑制作用随药物剂量增加和作用时间延长而增强;流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,不同浓度RA-PA作用可诱导SUP-B15细胞凋亡,作用48、72 h细胞凋亡较24 h时明显;RAPA作用48 h时的细胞凋亡随药物浓度增大而增多,72 h时高剂量药物(50、100 nmol/L)引起的细胞凋亡较低剂量药物(10、20 nmol/L)少;吖啶橙单染荧光显微镜观察显示,与空白对照组相比,雷帕霉素处理组细胞胞质中出现较多红色斑点的酸性膜泡(即自噬小体),且随药物浓度增大红色斑点增多;透射电镜观察结果显示,雷帕霉素处理组细胞胞质内可见较多自噬小体和自噬溶酶体,线粒体内嵴明显紊乱,细胞核不规则,染色质边缘化。结论雷帕霉素对SUP-B15细胞生长有较强的抑制作用;雷帕霉素可诱导SUP-B15细胞发生自噬和凋亡,且自噬的发生先于凋亡出现,一定强度的自噬活性可诱导细胞凋亡增加。     

丙戊酸钠对人肝癌SMMC-7221细胞的放疗增敏作用研究

目的 探讨丙戊酸钠(VPA)对肝癌SMMC-7221细胞的放疗增敏作用及其机制探究。方法 MTT法检测VPA对肝癌SMMC-7221细胞的抑制率,筛选出VPA的半数抑制浓度(IC₅₀)。流式细胞仪(FCM)分析肝癌SMMC-7221细胞周期及细胞凋亡率。结果 MTT结果显示VPA作用SMMC-7221细胞24、48、72 h后IC₅₀分别为41.26、9.04、2.87 mmol/L。FCM结果显示VPA+IR抑制SMMC-7221细胞的增殖,增加凋亡水平和诱导G₀/G₁期阻滞。结论 VPA作为放疗增敏剂,增加了SMMC-7221细胞的杀伤作用,其机制与细胞凋亡和细胞周期阻滞相关。     

五味子乙素降低PM2.5抑制HTR细胞增殖的作用研究

目的:探索五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是否可以降低PM2.5对人早孕胎盘绒毛膜外滋养层(human trophoblast HTR-8/SVneo,HTR)细胞增殖的抑制作用.方法:体外实验以HTR细胞为载体,利用MTS细胞增殖实验检测不同浓度的细颗粒物(PM2.5)、Sch B单独给药以及PM...     

OC-3-VGH卵巢癌细胞简捷培养方法的研究

目的：探索简捷细胞培养方法并观察该方法对癌细胞特性的影响。方法：将复苏的OC-3-VGH卵巢癌细胞株不经洗涤直接移至细胞培养瓶,加入10ml RPMI-1640培养液,放入培养箱,余同传统方法,观察细胞生长情况;取细胞悬液,以细胞数4×10^6／ml,0.2ml／只接种至BALB／c雌性裸小鼠皮下,2个月后处死,取肿瘤组织制片,并与传统培养方法结果进行比较。结果：两种方法培养的细胞均生长活跃,皮下接种7d左右,裸鼠长出肿瘤,组织学检查未见明显差异。结论：改良细胞培养方法减少了传统方法的繁琐步骤,方便细胞培养。     

防龋剂氟化物对牙髓细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响

用四氮唑溴盐（ＭＴＴ）染色法和以对硝基苯磷酸脂（ＰＮＰＰ）为底物检测不同浓度ＮａＦ对大鼠牙髓细胞的影响。实验结果显示１０ｐｐｍＦ－开始对牙髓细胞增殖产生抑制（Ｐ＜０．０１）；５０ｐｐｍ影响最大，细胞形态发生改变，圆缩死亡细胞明显增多。Ｆ－抑制细胞碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性，浓度增高，抑制增强。提示一定浓度Ｆ－对牙髓细胞某些功能活动具有抑制作用，且随浓度增高而增强