小分子RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α加重缺氧状态肾小管上皮细胞的生长抑制和坏死

目的 探讨沉默缺氧诱导因子1α （HIF-1α）对缺氧状态肾小管上皮细胞增殖、凋亡和坏死的影响。 方法 利用氯化钴模拟缺氧状态,并应用小分子RNA干扰（siRNA）技术沉默HIF-1α基因表达。将细胞分成5组,分别是正常培养组、缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组。用MTT试验检测细胞的生长抑制率;用TUNEL法、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（aspase）-3蛋白定量法检测细胞的凋亡率;检测细胞上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活力来测定细胞的坏死情况;用实时定量PCR法和Western印迹法检测细胞HIF-1α、HIF-2α、葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）、血管内皮生长因子（VEGF） mRNA和蛋白表达水平。 结果 （1）siRNA的细胞转染效率为95%～100%。在常氧条件下,终浓度100 nmol/L 的HIF-1α siRNA沉默HIF-1α基因的效率为70%;在缺氧条件下,HIF-1α siRNA沉默HIF-1α基因的效率达到97%。（2）HIF-1α siRNA组细胞的生长抑制率显著高于其它组（P < 0.05）;细胞凋亡率在缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组4组间的差异无统计学意义（P > 0.05）;HIF-1α siRNA组细胞培养液中LDH水平显著高于缺氧培养组、转染试剂组和阴性对照组（P < 0.05）。（3）HIF-1α siRNA组细胞的HIF-1α、Glut-1、VEGF mRNA和蛋白表达量显著低于缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组（P < 0.05）;而HIF-2α mRNA和蛋白表达在缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1α siRNA组4组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 siRNA沉默HIF-1α能显著抑制缺氧状态下肾小管上皮细胞Glut-1和VEGF表达,加重缺氧状态下肾小管上皮细胞的生长抑制和坏死。     

NAC对缺氧复氧后肾小管上皮细胞凋亡的干预作用

目的：研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞凋亡的表达及N-乙酰半胱胺酸（NAC）对其的影响。方法：选用人肾小管上皮细胞（HK2）建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度（1mmol／L、5mmol／L、10mmol／L）NAC干预组。流式细胞术检测细胞内氧化应激水平与细胞凋亡表达。结果：缺氧复氧后HK2细胞内氧化应激水平提高,HK2细胞凋亡细胞和死亡细胞数量增多,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,凋亡细胞和死亡细胞数量逐渐增多;NAC呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系减少凋亡细胞和坏死细胞的数量。结论：缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导HK2细胞凋亡和死亡;NAC可以通过抑制细胞内氧化应激减少细胞和坏死细胞的数量。     

缺氧诱导因子-1对肾微血管内皮细胞缺氧再复氧损伤免疫调节作用

目的探讨低氧诱导因子1(HIF1)在肾微血管内皮细胞(HGMECs)缺氧再复氧损伤中的免疫调节作用。方法建立HGMECs缺氧再复氧模型,应用特异性脯氨酰羟化酶抑制剂3,4DHB和环氧酶2阻断药物NS398预处理HGMECs,设对照、缺氧复氧、3,4DHB和NS398四组。采用逆转录聚合酶链反应、免疫印记和酶联免疫吸附试验等方法检测各组细胞HIF1α、血红素氧合酶1(HO1)的mRNA和蛋白的表达及上清中可溶性细胞间黏附因子1(sICAM1)的水平;将各组HGMECs与异体淋巴细胞混合培养(MELR),检测淋巴细胞增殖程度和MELR上清中白细胞介素2(IL2)的表达水平。结果与对照组相比,HGMECs经缺氧复氧损伤后HIF1α蛋白和HO1mRNA表达水平显著增高(P<0.01),上清中sICAM1(14.55±1.13vs7.90±1.61)ng、异体淋巴细胞增殖率(0.191±0.053vs0.069±0.032)和MELR上清中IL2(40.0±5.0vs18.0±3.0)pg水平均有显著增高(P<0.01)。与缺氧复氧组比较,3,4DHB干预组HIF1α蛋白和HO1mRNA表达水平显著增高(P<0.05),而淋巴细胞增殖率(0.079±0.038,P<0.01)及IL2(25.7±6.1pg,P<0.01)和sICAM1(8.71±1.32ng,P<0.01)水平则显著下调。与缺氧复氧组比较,NS398干预组HIF1α蛋白和HO1mRNA表达水平显著减低(P<0.01),而淋巴细胞增殖率(0.268±0.079)及IL2(51.0±11.0)pg和sICAM1(20.33±3.05)ng表达水平则显著增高(P<0.05)。结论缺氧复氧会对HGMECs造成免疫学损伤,HIF1α稳定表达可起到保护性作用。     

参附注射液对肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的改善作用及机制探讨

目的：探讨参附注射液（SF）对肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的改善作用及机制。方法：将人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞分为5组：正常对照组、单纯缺氧再复氧模型组、低浓度参附组（1%）、中浓度参附组（2%）、高浓度参附组（5%）。观察各组细胞在缺氧4h再复氧8h刺激下的反应。用流式细胞仪碘化丙啶（PI）染色法和TUNEL检测细胞凋亡比例,激光共聚焦显微镜检测经Fluo-3AM标记的细胞内钙浓度,ELISA检测细胞培养液中MCP-1的浓度。结果：经流式细胞仪检测,缺氧再复氧刺激后细胞凋亡率达（32.97±1.19）%,明显高于正常对照组（P〈0.01）,SF可显著降低细胞凋亡率,并呈剂量依赖性（P〈0.01）,5%SF组凋亡率最低,与单纯模型组相比有统计学差异（P〈0.01）;TUNEL检测的细胞凋亡率变化趋势与流式细胞术一致;缺氧再复氧刺激后细胞内钙荧光值升高,达140.18±3.62,SF可降低胞内荧光值,并呈剂量依赖性（P〈0.01）,5%SF组荧光值最低61.77±4.82,与单纯模型组相比有统计学差异（P〈0.01）;HK-2细胞正常情况下分泌少量的MCP-1（12.04±0.44）pg/ml,在缺氧再复氧刺激下分泌量增加至（27.12±3.83）pg/ml。SF有抑制肾小管上皮细胞分泌MCP-1的作用（P〈0.05）,但未观察到剂量依赖性（P〉0.05）。结论：参附注射液通过降低缺氧再复氧诱导的肾小管上皮细胞的凋亡率、钙超载及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的分泌发挥改善肾缺血再灌注损伤的作用。     

N-乙酰半胱氨酸对碘海醇诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对碘海醇引起人肾小管上皮细胞（HK-2）损伤的保护作用及机制。 方法 将体外培养的HK-2细胞分为4组：对照组、碘海醇组、NAC组、NAC预处理＋碘海醇共作用组。用细胞增殖/毒性检测法（CCK-8）测定细胞存活率;核染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;二氯二氢荧光素双醋酸盐（DCFH-DA）荧光结合流式细胞法检测细胞内活性氧（ROS）的产生;免疫荧光（IF）、Western印迹法检测相关信号转导途径。 结果 碘海醇呈剂量和时间依赖性诱导HK-2细胞凋亡,降低细胞存活率。碘海醇使细胞内ROS升高至对照组的1.3倍。NAC（5、10、15 mmol/L）预处理与碘海醇共作用后, HK-2细胞存活率分别增至104%、118%、130%,与碘海醇组（63%）差异有统计学意义（P < 0.05）;凋亡率分别降为13.51%、13.46%、12.23%,与碘海醇组（24.41%）差异亦有统计学意义（P < 0.05）;活性氧分别降为对照组的1.05、0.93、0.86倍,与碘海醇组（对照组的1.3倍）差异亦有统计学意义（P < 0.05）。碘海醇作用于HK-2细胞,引起p53磷酸化,上调Bax,下调Bcl-2的表达,促进线粒体内细胞色素C（CytC）释放到胞质,进而引起半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3活化,导致细胞凋亡。NAC降低细胞内ROS浓度,下调Bax表达,上调Bcl-2表达,减少caspase-3活化,从而减轻细胞损伤。 结论 碘海醇增加细胞内ROS生成,引起p53磷酸化,进而影响Bcl-2家族蛋白表达,促进CytC从线粒体释放和激活caspase-3信号通路,导致细胞凋亡。NAC通过清除氧自由基,降低细胞内ROS浓度,进而减轻碘海醇诱导的氧化应激所致细胞损伤及凋亡。     

缺氧预适应抑制内皮细胞冷缺氧/温复氧损伤

目的 研究缺氧预适应对内皮细胞冷缺氧／温复氧损伤的作用及可能机制。方法 培养的内皮细胞ECV-304分成4组，A组，对照组；B组，冷缺氧／温复氧（A／R）组95％N2／5％a=）2缺氧装置中用4℃UW液保存24h；C组，缺氧预适应组（APC），内皮细胞在缺氧前遭受4个循环短时间缺氧／复氧；D组，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）抑制组：缺氧预适应前，细胞培养液中加入5μmol／L的HIF-1α抑制剂NS398，余同C组。缺氧结束后，各组37℃5％CO2 95％空气中复氧6h。分别以逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法、Western blot法检测各组HIF-1α mRNA和蛋白表达，内皮细胞保护作用通过细胞存活率（台盼蓝拒染法）、LDH释出率及ICAM-1的表达判定。结果 缺氧预适应明显上调HIF-1α mRNA和蛋白表达，显著抑制冷保存内皮细胞缺氧／复氧损伤，表现为更高的细胞存活率，更少的LDH释出和ICAM-1的表达。而HIF-1α抑制剂可逆转这种保护作用。结论 缺氧预适应能有效地抑制冷保存内皮细胞缺氧／复氧损伤，这种细胞保护作用可能是通过HIF-1α介导的。     

小檗碱预先给药对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 探讨小檗碱预先给药对缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡的影响.方法 培养人肾小管上皮细胞(HK-2),以1×106个/ml密度接种于培养皿(2 ml/皿)和96孔培养板(200μl/孔),采用随机数字表法,将其分为4组(n=30):正常对照组(C组)、小檗碱组(B组)、缺氧/复氧组(H/R组)和缺氧/复氧+小檗碱组(H/R+B组).B组和H/R+B组加入10 μmol/L小檗碱孵育2h,随后H/R组和H/R+B组进行缺氧24h复氧3h.测定细胞活力、细胞凋亡率、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、caspase-3、活化caspase-3、细胞色素c、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和C/EBP同源蛋白(CHOP)表达,并计算Bax表达与Bcl-2表达的比值(Bax/Bcl-2).结果 与C组比较,H/R组和H/R+B组细胞活力、SOD活性和caspase-3表达降低,细胞凋亡率、MDA浓度和Bax/Bcl-2升高,活化caspase-3、细胞色素c、GRP78和CHOP表达上调(P＜0.05),B组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与H/R组比较,H/R+B组细胞活力、SOD活性和caspase-3表达升高,细胞凋亡率、MDA浓度和Bax /Bcl-2降低,活化caspase-3、细胞色素c、GRP78和CHOP表达下调(P＜0.05).结论 小檗碱预先给药可抑制缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡,其机制与抑制线粒体应激通路和内质网应激通路有关.     

Apocynin对缺氧复氧后肾小管上皮细胞MCP-1表达的干预作用

目的：研究缺氧复氧后肾小管上皮细胞单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达及Apocynin对其影响。方法：选用人肾小管上皮细胞（HK-2）建立缺氧复氧损伤模型,设正常对照组、单纯缺氧复氧组、不同浓度（0.05、0.25、0．5mmol／L）Apocynin干预组。流式细胞术检测细胞内氧化应激水平,流式细胞术检测MCP-1蛋白表达、RT-PCR法测定细胞MCP-1 mRNA表达。结果：缺氧复氧后HK-2细胞内氧化应激水平提高,细胞MCP-1蛋白和mRNA表达上调,且随缺氧时间的延长,细胞内氧化应激水平逐渐升高,MCP-1蛋白和mRNA表达逐渐增强;Apocynin呈剂量关系抑制细胞内氧化应激水平,同时呈剂量关系抑制MCP-1蛋白和mRNA表达的上调。结论：缺氧复氧诱导细胞内氧化应激的产生,诱导MCP-1表达上调;Apocynin可以通过抑制细胞内氧化应激抑制MCP-1的上调。     

脯氨酸羟化酶2 siRNA对抗霉素诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 探讨是否脯氨酸羟化酶2 (PHD2) siRNA 通过减少缺氧诱导因子(HIF)1的降解而减轻缺氧引起的肾小管上皮细胞凋亡。方法 构建针对人PHD2的表达质粒,将其转染到培养的人肾小管上皮细胞系(HKC)中。用RT-PCR方法观察其对PHD2表达的抑制作用。Western印迹观察HIF-1α的表达。培养的HKC细胞分为对照组、模型组和siRNA组、siRNA组经PHD2 siRNA转染后与模型组同时用抗霉素诱导,用Western印迹方法观察3组细胞HIF-1α的表达,用流式细胞仪观察3组细胞的凋亡情况。 结果 经PHD2 siRNA转染的HKC细胞PHD2 mRNA表达明显下调(P < 0.01),HIF-1α蛋白表达明显上调(P < 0.05)。经抗霉素处理后,模型组和siRNA组HIF-1α蛋白表达均明显高于对照组(P < 0.01),但siRNA组HIF-1α蛋白表达高于模型组(P < 0.05。与模型组相比,siRNA组细胞凋亡明显减轻(P < 0.05)。 结论 通过RNA干扰技术抑制PHD2的表达可以增强HKC细胞HIF-1的蛋白表达,从而增强其在缺氧条件下的抗凋亡能力。     

RNA结合蛋白FOX1对缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞氧化应激的影响

目的:探究RNA结合蛋白FOX1(RBFOX1)在人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)模型中对细胞氧化应激及核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路的影响。方法:构建HK-2细胞缺氧/复氧(缺氧16 h,复氧4 h)模型,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测RB...     

血红素加氧酶1对白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 探讨血红素加氧酶1（HO-1）对白蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响及其可能机制。 方法 体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）为正常对照。白蛋白对照组加去脂的小牛血清白蛋白（BSA）30 g/L共同培养。干预组先加钴卟啉（Cobalt protoporphyrin IX,CoPP,血红素加氧酶1诱导剂）5 μmol/L,0.5 h后再加入BSA 30 g/L,作用24 h。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测CoPP对BSA抑制NRK-52E细胞增殖的影响。细胞免疫荧光染色检测细胞凋亡率。RT-PCR法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax mRNA表达情况。 结果 与正常对照组比较,BSA对细胞增殖具有抑制作用并诱导细胞凋亡,差异有统计学意义（P < 0.05）,而CoPP对BSA引起的细胞毒性作用具有保护作用（P < 0.05）;BSA对照组HO-1 mRNA表达增加（0.44±0.06比0.39±0.05,P < 0.05),差异有统计学意义（P < 0.05）。CoPP预处理后,HO-1 mRNA表达（0.50±0.06）较BSA对照组增加（P < 0.05）。BSA可上调Bax mRNA表达(0.87±0.04比0.67±0.03,P < 0.05）及下调Bcl-2 mRNA的表达（0.25±0.04比0.42±0.02,P < 0.05),当加入CoPP预处理后可抑制上述改变（Bax mRNA：0.75±0.07,Bcl-2 mRNA：0.36±0.03,均P < 0.05）。 结论 BSA可显著增加细胞的凋亡率并直接调控凋亡相关蛋白mRNA的表达,CoPP可抑制上述BSA的作用。HO-1对BSA所致肾小管上皮细胞凋亡具有保护作用,可以抑制细胞凋亡。     

甲状旁腺激素对人近曲小管上皮细胞转分化及分泌结缔组织生长因子的影响

目的 探讨甲状旁腺激素（PTH）对人近曲小管上皮细胞系HK-2细胞分泌结缔组织生长因子（CTGF）及细胞转分化的影响。 方法 应用实时定量PCR和Western印迹观察PTH诱导HK-2细胞CTGF mRNA和蛋白表达情况，从转录水平探讨PTH对CTGF基因启动子活性的调控作用。应用免疫荧光技术检测PTH作用下HK-2细胞中α平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）的表达。 结果 HK-2细胞有基础水平的CTGF mRNA和蛋白表达，PTH刺激后其表达量显著增加。PTH最佳刺激浓度是10－10 mol/L，最佳刺激时间是72 h。10－10 mol/L PTH干预HK-2细胞12 h后，荧光素酶活性较对照组显著升高（1.888±0.078比0.989±0.030，P ＜ 0.01）；光镜下可见细胞由立方形铺路石样转变为梭形，随作用时间延长转分化现象更显著。PTH刺激HK-2细胞12 h后，免疫荧光检测可见细胞质中有α-SMA表达；PTH刺激24 h后，α-SMA表达明显增多，与CTGF mRNA和蛋白表达的时间效应一致。 结论 PTH可上调HK-2细胞CTGF表达，并具有促进HK-2细胞转分化的作用。     

右美托咪定激活Akt通路对缺氧复氧肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 观察右美托咪定对缺氧复氧诱导肾小管上皮细胞凋亡的作用,并探讨其作用机制。方法 将人肾小管上皮细胞分五组干预：对照组(C组),常氧环境中培养28 h;缺氧复氧组(HR组),低氧环境中培养24 h后常氧环境中培养4 h;右美托咪定处理组(D组),复制缺氧复氧模型前以右美托咪定处理2 h;Akt阻断剂Uprosertib处理组(U组),复制缺氧复氧模型前以Akt阻断剂Uprosertib处理1 h;右美托咪定复合Akt阻断剂Uprosertib处理组(DU组),复制缺氧复氧模型前先以Akt阻断剂Uprosertib处理1 h,再以右美托咪定处理2 h。采用Ellsa法检测细胞上清中TNF-ɑ、IL-6、IL-1β浓度,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、p-Akt蛋白含量。结果 与C组比较,HR组、D组、U组和DU组TNF-ɑ、IL-6、IL-1β浓度、细胞凋亡率、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白含量明显升高(P<0.05),细胞存活率、Bcl-2、p-Akt蛋白含量明显降低(P<0.05)。与HR组比较,D组和DU组TNF-ɑ、IL-6、IL-1β浓度、细胞凋亡率、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白含量明显降低(P<0.05),细胞存活率、Bcl-2、p-Akt蛋白含量明显升高(P<0.05);U组TNF-ɑ、IL-6、IL-1β浓度、细胞凋亡率、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白含量明显升高(P<0.05),细胞存活率、Bcl-2、p-Akt蛋白含量明显降低(P<0.05)。与D组比较,U组和DU组TNF-ɑ、IL-6、IL-1β浓度、细胞凋亡率、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白含量明显升高(P<0.05),细胞存活率、Bcl-2、p-Akt蛋白含量明显降低(P<0.05)。与U组比较,DU组TNF-ɑ、IL-6、IL-1β浓度、细胞凋亡率、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白含量明显降低(P<0.05),细胞存活率、Bcl-2、p-Akt蛋白含量明显升高(P<0.05)。结论 右美托咪定可通过激活Akt信号通路,抑制缺氧复氧造成的肾小管上皮细胞凋亡,发挥保护作用。     

甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞细胞外基质合成与降解的影响

目的 研究甲状旁腺素（PTH）对人肾小管上皮细胞（HK-2）合成分泌Ⅲ型胶原、纤连蛋白以及对纤溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、基质金属蛋白酶1（MMP-1）、金属蛋白酶1组织抑制剂（TIMP-1）基因表达的影响,以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用。 方法 HK-2细胞培养于含5％ FBS的DMEM-F12培养液中,加入终浓度为0、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L PTH的培养液刺激HK-2细胞48 h,或10-8 mol/L PTH刺激HK-2细胞不同时间（0、12、24、48、72 h）。应用半定量RT-PCR法检测细胞中Ⅲ型胶原、纤连蛋白、PAI-1、MMP-1、TIMP-1基因的表达;Western印迹法检测HK-2细胞中Ⅲ型胶原的蛋白表达;ELISA法检测细胞培养上清液中纤连蛋白的含量。 结果 PTH 呈剂量和时间依赖性促进HK-2细胞中Ⅲ型胶原、纤连蛋白、PAI-1、TIMP-1 mRNA的表达,抑制MMP-1 mRNA的表达,MMP-1/TIMP-1 比值降低。PTH呈剂量和时间依赖性增加HK-2细胞中Ⅲ型胶原的蛋白表达及细胞培养上清液中纤连蛋白的含量。 结论 PTH通过促进HK-2细胞中PAI-1、TIMP-1的基因表达,抑制MMP-1的基因表达,导致细胞外基质合成增加而降解减少。     

表面活性蛋白A在脂多糖诱导的人肾小管上皮细胞中的表达

目的 研究表面活性蛋白A（SP-A）及其亚型在人肾组织和人肾小管上皮细胞（HK-2）的表达和分布,同时分析脂多糖（LPS）对HK-2细胞中SP-A亚型的 mRNA和蛋白表达的影响。 方法 收集10例人的肾组织,以5例人的肺组织作为对照,同时培养HK-2细胞。免疫组化法检测SP-A在人肾组织的表达部位;RT-PCR法检测SP-A mRNA在人肾组织和HK-2细胞中的表达;限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）和测序的方法分析SP-A亚型在HK-2细胞的表达;实时定量PCR法比较SP-A mRNA在人肾组织和在人肺组织中的相对含量;Western印迹法检测人肾组织和HK-2细胞中SP-A蛋白的表达;Western印迹和ELISA法检测人的尿液和HK-2细胞培养上清液中SP-A的分泌量。RT-PCR和Western印迹检测LPS在不同浓度（0、0.1、1、2、5、10 mg/L）作用8 h及5 mg/L LPS在不同时间（0、2、4、8、16、24 h）作用HK-2细胞后,SP-A mRNA和蛋白表达的变化情况。 结果 免疫组化结果显示SP-A主要表达在肾皮质的远曲和近曲小管的肾小管上皮细胞。RFLP和测序的方法均证实HK-2细胞可同时表达SP-A1和SP-A2亚型。实时定量PCR证实SP-A mRNA在人肾组织的表达量仅为肺组织的30%（n = 5）。Western印迹检测到人肾组织和HK-2细胞可表达SP-A蛋白。同时在人的尿液和HK-2细胞培养上清液中也检测到SP-A的分泌,其分泌量分别为（106.614±72.772） nmol/L（n = 30）和（85.533± 58.622） nmol/L（n = 10）。应用1、2、5、10 mg/L的 LPS刺激HK-2细胞8 h后,SP-A1和SP-A2 mRNA及SP-A蛋白表达较0、0.1 mg/L显著升高（P < 0.05）;同时,应用5 mg/L的LPS作用HK-2细胞4、8、16、24 h后, SP-A1和SP-A2 mRNA及SP-A蛋白表达较LPS作用0、2 h显著升高（P < 0.05）。 结论 HK-2细胞能同时表达SP-A1和SP-A2亚型,能产生和分泌SP-A蛋白。SP-A1和SP-A2可能在肾脏的天然免疫和炎性反应调节方面起重要作用。     

乙醛脱氢酶2介导乙醇预处理减轻肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤的作用

目的 研究乙醛脱氢酶2 (ALDH2)介导乙醇预处理减轻小鼠肾小管上皮细胞(TEC)缺血再灌注(IR)损伤的作用.方法 取C57BL/6J小鼠的TEC,进行原代培养.小鼠TEC经乙醇预处理3h后,建立体外模拟IR的模型,检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,观察乙醇预处理减轻TEC的IR损伤的作用.采用已构建的ALDH2的小干扰RNA(ALDH2-siRNA)转染TEC,转染48 h后采用蛋白质印迹法验证ALDH2蛋白的变化情况,检测ALDH酶活性的改变,然后进行乙醇预处理和模拟IR操作,最后检测TEC的LDH漏出率,分析ALDH2在乙醇预处理减轻TEC的IR损伤中的作用.结果 乙醇预处理显著降低了IR后小鼠TEC的LDH漏出率,验证了乙醇预处理减轻小鼠TEC的IR损伤的作用;转染ALDH2-siRNA后,TEC的ALDH2蛋白含量下降82.1％,ALDH酶活性下降了67.3％.在下调ALDH2表达之后,乙醇预处理减轻TEC的IR损伤的作用几乎消失.结论 乙醇预处理可以减轻小鼠TEC的IR损伤,ALDH2酶在此效应中发挥了重要作用.     

Numb基因在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用

目的 探讨Numb在大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的作用。 方法 重组人转化生长因子β1（TGF-β1）刺激大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞),不同浓度TGF-β1 （0、1、5、10、15、20 μg/L）作用48 h与TGF-β1 10 μg/L作用不同时间(0、24、48、72 h)后,采用RT-PCR、Western印迹和免疫荧光染色分别检测NRK52E细胞内E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Numb 的表达。采用RNA干扰技术下调Numb表达,Western印迹观察改变Numb水平对E-cadherin、α-SMA蛋白水平的影响。 结果 TGF-β1以剂量及时间依赖的方式诱导NRK52E细胞E-cadherin 蛋白表达下调,α-SMA 蛋白表达增高。Numb蛋白的表达随TGF-β1浓度的增加而增高,在5、10、15和20 μg/L时分别为0 μg/L时的1.33倍（P = 0.024)、1.39倍（P = 0.035）、1.45倍（P = 0.025）和1.51倍（P = 0.000)。而Numb蛋白和mRNA的表达亦随TGF-β1作用时间的延长而增高,作用24 h、48 h、72 h,Numb蛋白分别为0 h的1.48倍（P = 0.046)、1.54倍（P = 0.011）、1.79倍（P = 0.028）,Numb mRNA分别为0 h的1.56倍（P = 0.012)、1.82倍（P = 0.008）、1.82倍（P = 0.002）;同时Numb的分布也发生了改变,大量聚集在胞质中。下调Numb表达可以显著抑制TGF-β1诱导的α-SMA表达上调（为Numb表达正常时的18.1%,P = 0.004）、E-cadherin表达下调（为Numb表达正常时的2.19倍,P = 0.004）。 结论 Numb可以促进肾小管上皮细胞发生转分化。     

法舒地尔对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 观察法舒地尔对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响并探讨其机制。 方法 将实验性Wistar大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组、法舒地尔治疗组。3个月后处死动物,PAS染色法观察肾小球病理变化,Masson染色法观察肾间质病理变化;免疫组化观察肾脏皮质ROCKⅠ、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E钙黏蛋白（E-cadherin）的变化和β连环蛋白（β-catenin)的细胞定位改变;Western印迹法观察肾脏皮质p-MYPT1、α-SMA、E-cadherin、胞膜β-catenin蛋白的变化;实时定量PCR法观察ROCKⅠ、E-cadherin和总β-catenin的mRNA变化。 结果 法舒地尔治疗可改善肾间质纤维化状况。与正常对照组相比,糖尿病组大鼠肾皮质内p-MYPT1、α-SMA蛋白表达增强（均P < 0.01）;E-cadherin、胞膜β-catenin的蛋白表达减弱（均P < 0.01）;ROCK1、总β-catenin mRNA表达增强（均P < 0.01）;E-cadherin mRNA表达减弱（P < 0.01）。与糖尿病组相比,治疗组p-MYPT1、α-SMA蛋白表达减弱 （均P < 0.01）;E-cadherin、胞膜β-catenin的蛋白表达增强（均P < 0.05）;ROCK1、β-catenin mRNA表达减弱（均P < 0.01）;E-cadherin mRNA表达增强（P < 0.01）。 结论 法舒地尔可能通过抑制Rho激酶活性减轻糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化和肾间质纤维化,该作用可能与法舒地尔恢复肾小管上皮细胞的黏附特性与紧密连接复合体有关。     

应用原代培养的小鼠肾小管上皮细胞建立体外模拟缺血再灌注损伤模型

目的 原代培养小鼠肾小管上皮细胞(TEC),建立小鼠TEC体外模拟缺血再灌注(IR)的模型.方法 切取C57BL/6J小鼠肾脏外侧髓质,用Ⅰ型胶原酶消化后进行原代培养,采用免疫组织化学法进行鉴定.将贴壁生长的TEC用石蜡油覆盖模拟缺血过程,60 min后更换全培养基模拟再灌注过程.在更换培养基后不同时间点收集细胞,抽提RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6 mRNA的表达;在再灌注后24 h收集细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附试验检测各细胞因子蛋白的表达.结果 经过原代培养的小鼠TEC呈上皮细胞特有的“铺路石”状,细胞胞浆内高表达细胞骨架蛋白18.与对照组相比,IR组TEC在更换培养基后TNF-α、IL-1β和IL-6的转录水平均明显增高.TNF-α mRNA表达量在更换培养基后0.5h达峰,约为对照组的(24.45±6.51)倍(P＜0.01),随后逐渐下降;在更换培养基后IL-1β mRNA表达量呈逐渐上升的趋势,更换培养基后6h约为对照组的(15.27±4.29)倍(P＜0.05);IL-6 mRNA表达量在更换培养基后3h达峰,约为对照组的(11.19±4.55)倍(P＜0.01).与对照组相比,IR组TEC在更换培养基后24 h,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达均明显增高.结论 小鼠肾脏外侧髓质经分离、消化后可获得高纯度的原代培养TEC;应用石蜡油可以成功建立小鼠TEC体外模拟IR的模型.