牙龈卟啉单胞菌侵入对人血管内皮细胞分泌MCP-1影响的研究

目的　通过研究牙龈卟啉单胞菌（porphyrmonas gingivalis,P.g）侵入对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）分泌单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的影响,了解P.g对其趋化功能的影响。方法　建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法（ELISA）研究P.g381和P.g33277菌株侵入HUVEC 6、24 h后的培养上清液中MCP-1浓度。结果　ELISA结果显示当P.g381侵入HUVEC 6、24 h和P.g33277侵入HUVEC 6 h时,HUVEC分泌的MCP-1水平升高（P＜0.01）;P.g33277侵入HUVEC 24 h时,HUVEC分泌的MCP-1水平恢复最初水平（P=0.46）;P.g381诱导HUVEC表达MCP-1的水平高于P.g33277（P＜0.01）。结论　P.g侵入HUVEC后可促进其表达MCP-1,从而上调其趋化功能,在牙周炎与心血管疾病的相关性中可能发挥作用。     

牙龈卟啉单胞菌感染对血管内皮细胞LOX-1mRNA表达的影响

目的 研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)感染对血管内皮细胞(vein endothelial cell,VEC)血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)mRN...     

牙龈卟啉单胞菌感染对人脐静脉内皮细胞表达IL-8影响的研究

目的 研究牙龈卟啉单胞菌(porphyrmonas gingivalis,P.g)感染时人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcell,HUVEC)表达趋化因子白介素-8(interleukin-8,IL-8)的变化,了解P.g对其趋化功能的影响。方法 建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法(ELISA)研究P.g381和P.g33277菌株感染HUVEC 6、24 h后的培养上清液中IL-8的浓度。结果 ELISA结果显示当P.g381感染HUVEC 6、24 h和P.g33277感染HUVEC 6、24 h时,HUVEC分泌IL-8的水平明显升高(P<0.01);感染24 h时P.g381促进HUVEC表达IL-8的水平高于P.g33277(P<0.01)。结论 P.g侵入HUVEC后可促进其表达IL-8,从而上调其趋化功能,可能与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展相关。     

牙龈卟啉单胞菌感染对血管内皮细胞与单核细胞黏附的影响

目的：研究Pg感染对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与单核细胞黏附的影响。方法：建立Pg感染HUVEC细胞株EA．hy926的体外模型,虎红染色法观察Pg381和Pg33277菌株感染HUVEC 6 h和24 h后,HUVEC与人单核细胞株THP-1细胞黏附量的变化。结果：培养6 h时Pg381感染组的THP-1细胞黏附量相对值为0．210±0．025,高于Pg33277感染组（0．078±0．024,P＜0．05）和空白对照组（0．062±0．022,P＜0．05）,Pg33277感染组和空白对照组无差异。24 h时3组间无差异（P＞0．05）。结论：Pg381感染HUVEC后能显著促进其与单核细胞的黏附。     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞表达IL-8和MCP-1 mRNA的影响

目的：在转录水平上观察牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）表达白细胞介素-8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响。方法：厌氧培养Pg，原代培养HUVECs，RNA抽提，逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和mRNA比色定量法检测IL-8和MCP-1基因表达。结果：HUVECs基础表达IL-8和MCP-1mRNA,Pg以剂量依赖的方式增强IL-8和MCP-1mRNA的表达，Pg感染后1hIL-8mRNA开始增高，3h达到高峰，并持续到5h。而MCP-1的mRNA从Pg感染后1h开始增高，3h达到高峰，5h出现下降趋势。结论：Pg在转录水平上增强UHUVECs表达IL-8和MCP-1，这种上调作用可能是牙周病早期基因水平调控炎症细胞募集的重要因素，可能是牙周疾病的炎症反应和免疫反应中主要调控机制之一。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人脐静脉内皮细胞表达趋化因子RANTES和分形素的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）和分形素的影响。方法 应用不同质量浓度（200、500、1 000 ng·mL^-1）的Pg-LPS分别处理HUVEC 1、6、12、24 h,利用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）及酶联免疫吸附（ELISA）法检测RANTES及分形素mRNA及蛋白质的表达变化。结果 在Pg-LPS与HUVEC共同培养1、6和12 h时,除培养时间为12 h、Pg-LPS质量浓度为200 ng·mL^-1组的RANTES mRNA和1 h、200 ng·mL^-1组RANTES蛋白表达与对照组无明显差异外,其余各实验组RANTES蛋白和mRNA表达量及分形素mRNA表达量均高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;6 h时,二者mRNA表达量达到峰值,分别为对照组的4.88倍和6.20倍;刺激6 h后,RANTES蛋白和mRNA表达量及分形素的mRNA表达量均降低,24 h时,仅Pg-LPS质量浓度为500 ng·mL-1组与对照组相比有统计学差异（P<0.05）;分形素蛋白的表达量则仅在Pg-LPS浓度为1 000 ng·mL-1刺激6、12 h时与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。结论 Pg-LPS感染具有上调HUVEC表达趋化因子RANTES和分形素的作用,可能在牙周炎促进动脉粥样硬化发生、发展的过程中起一定作用。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对THP-1源性巨噬细胞CD36和LOX-1表达的影响

目的该文以THP-1源性巨噬细胞为研究对象,研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.g-LPS)对巨噬细胞内胆固醇代谢关键分子CD36、LOX-1表达的影响。方法以160 nmol/L佛波酯(PMA)诱导THP-1单核细胞48 h,使其分化为巨噬细胞。建立P.g-LPS与THP-1源性巨噬细胞共孵育的体外模型,在负荷50μg/m L低密度脂蛋白(LDL)的条件下,分别用浓度为0.1、1.0、10.0μg/m L P.g-LPS与巨噬细胞共孵育48 h;1μg/m L P.g-LPS与巨噬细胞共孵育24、48和72 h。采用实时荧光定量PCR和Western blot方法探讨巨噬细胞胆固醇代谢关键分子CD36和LOX-1表达变化。结果与空白对照组相比,随着P.g-LPS浓度的增加和1μg/m L P.g-LPS孵育时间的延长,巨噬细胞内CD36 mRNA和蛋白表达均逐渐下降;LOX-1mRNA和蛋白表达无明显变化。结论 P.g-LPS可促进巨噬细胞CD36的表达,对LOX-1表达无影响,从而可能对巨噬细胞脂质代谢产生影响。     

NF-κB/IκB�ź�ͨ·������߲����������Ⱦ�յ�Ѫ����Ƥϸ��ICAM-1�������о�

目的探讨核转录因子一KB（NF—KB）／抑制因子KB（IKB）信号通路在调控牙龈卟啉单胞菌（Pgingivalis）感染诱导血管内皮细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）高表达过程中的作用。方法本研究于2008年3月至2011年1月在中国医科大学中心实验室及中国医科大学口腔医学院中心实验室进行。已知P．gingivalis感染血管内皮细胞可诱导其ICAM-1基因和蛋白表达增高。采用Real-timePCR和Westernblot法检测P．gingivalis感染后血管内皮细胞ICAM-1mRNA和蛋白表达;应用5、10、20μmol／L的蛋白酶体抑制剂MGl32分别预处理血管内皮细胞15、30、60min,再将细胞与P．gingivalis共同培养8h,观察细胞ICAM-1mRNA和蛋白表达的变化,分析NF—KB／IKB信号通路对ICAM-1表达的调控作用。结果10txmol／LMGl32预处理30rain,Pgirtgivalis感染的血管内皮细胞ICAM—lmRNA表达具有下降趋势;20p~mol／LMGl32预处理15min,P．gingivalis感染的血管内皮细胞ICAM-1表达即开始下降,预处理时间延长至30、60min,ICAM-1表达下降更趋明显。结论阻断NF—KB／IKB信号通路可抑制P．gingivalis感染诱导的血管内皮细胞ICAM-1表达。     

牙龈卟啉单胞菌入侵血管内皮细胞的实验研究

目的:体外观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖的影响,观察Pg对HUVEC的入侵能力,从而探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)发病机制中的作用提供依据。方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1:10,1:100PgATCC33277分别干预HUVEC 4h、8h、12h、24h,未受Pg ATCC33277干预的HUVEC作为阴性对照组,倒置显微镜下观察HUVEC形态,CCK-8法测定HUVEC细胞的增殖情况,透射电镜下观察Pg ATCC33277对HUVEC的入侵情况。结果:在24h内,与对照组相比,受Pg ATCC33277感染的HUVEC的细胞形态未见明显影响,仍呈典型的"铺路石"单层贴壁生长,Pg ATCC33277对HUVEC细胞增殖未见明显影响,透射电镜下观察发现Pg ATCC33277可以黏附HUVEC细胞膜表面,入侵HUVEC,直接定植或以空泡的形式存在于细胞的胞质中。结论:Pg可以入侵内皮细胞,以在细胞内定植的方式逃避宿主的防御反应,内皮细胞的形态和增殖未见明显改变,从而形成第二次慢性感染过程,进一步影响内皮细胞正常功能的发挥。     

正畸力作用下大鼠牙周组织中CCR1及其相关配体的表达

目的 研究正畸力加力后CC类趋化因子受体1（CCR1）及其相关配体（CCL3、CCL5、CCL7）的mRNA在大鼠牙周组织中的表达变化规律,以探讨CCR1在正畸牙移动的作用.方法 将35只8周龄体重（220±25）g雄性SD大鼠随机分为7组,每组5只,空白对照组大鼠不安装实验装置,其余大鼠安装实验装置.安装实验装置大鼠随机选择一侧上颌第一磨牙为实验牙,对侧第一磨牙作为对照牙,采用镍钛拉簧建立大鼠正畸牙移动模型,力值50 g.实验动物分别于加力后0h、12h、1d、3d、7d、14 d处死,取大鼠上颌第一磨牙周围牙周组织应用实时荧光定量PCR法进行研究.结果 大鼠牙齿加力后,观察到牙周组织内CCR1及其配体的mRNA表达量呈现一定的时间规律：加力后12 h,CCR1、CCL3、CCL5、CCL7的mRNA表达均开始上升,CCR1 mRNA表达在3d达高峰（F=1.745,P=0.021）,CCL3、CCL5mRNA表达在1d达高峰（F=19.976,PCCL3 =0.019; F=17.114,PCCL5=0.008）,CCL7表达差异无统计学意义.CCR1及其配体的mRNA转录水平在加力时7d均下降至与对照组基本一致.结论 正畸力作用下,大鼠牙周组织中CCR1及其相关配体mRNA表达出现一过性变化,呈现短时上调规律,推测CCR1及其相关配体表达与正畸牙移动过程及牙周骨改建可能相关.     

牙龈卟啉单胞菌侵入对血管内皮细胞E选择素表达的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（P.g）ATCC33277和W83侵入对血管内皮细胞E选择素转录和翻译的影响。方法：建立体外P.g侵入血管内皮细胞模型,反转录-聚合酶链式反应检测E选择素基因表达;蛋白质印迹技术检测E选择素膜蛋白表达的变化;采用SAS8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析,P〈0.05为差异有统计学意义。结果：P.gATCC33277和W83侵入后4h即上调E选择素基因表达（P〈0.05）,8h显著回落（P〈0.05）,24h恢复至基线水平;E选择素基因在P.gATCC33277/W83侵入后4h、8h、24h和TNFα处理0.5h后的相对表达水平分别为对照组的294.0%/326.4%、179.3%/224.6%、126.7%/128.3%和365.5%。P.g侵入后4h即诱导E选择素蛋白表达（P〈0.05）,8h达高峰（P〈0.05）,24h有持续高表达（P〈0.05）;E选择素蛋白相对表达水平分别为对照组的295.4%/343.6%、386.3%/394.3%、238.7%/296.4%和413.8%。P.gW83诱导血管内皮细胞E选择素表达的能力强于ATCC33277（P〈0.05）。结论：P.g侵入可造成血管内皮细胞E选择素高表达的动脉粥样硬化样改变,在动脉粥样硬化炎症病理反应中有重要意义。     

牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞茵(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据.方法 应用厌氧罐培养Pg ATCC33277,用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1:10、1:100、1:1000的Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度.结果 在24 h内,Pg MOI 1:10、1:100均能促进HUVEC NO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);Pg MOI 1:1000干预HUVEC后,12 h内可促进HUVEC NO的生成,但与阴性对照组相比差异无统计学意义,24 h时HUVEC NO的生成降低[(57.83±9.09)mmol/L],与其他各组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Pg对内皮细胞NO的生成有影响.Pg MOI 1:10、1:100能够促进内皮细胞NO的生成,Pg MOI 1:1000则抑制内皮细胞NO的生成.     

缺氧条件下缺氧诱导因子-1α对人舌鳞癌细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法采用RT—PCR技术半定量检测人Tca8113细胞常氧和缺氧培养0．5、1、3、6、12和24h HIF-1α、VEGF基因的表达。结果缺氧条件下HIF—1α基因的表达呈先升后降的趋势，在缺氧6、12h表达显著高于常氧组（P〈0．05）；VEGF的表达在缺氧培养0．5、1、3、12及24h均高于常氧组（P〈0．05）；VEGF基因的表达在缺氧初始阶段随HIF—1α基因表达的增强而升高，但Spearman相关分析显示两者在缺氧24h内相关性不明显（rs=0．5750，P〉0．05）。结论缺氧条件下Tca8113细胞中VEGF的高表达受HIF—1α的调控和影响，是多种因素作用的结果。     

白细胞介素22对人牙周膜成纤维细胞核因子κB受体活化因子配体、骨保护素表达的影响

目的探讨白细胞介素22（IL-22）对人牙周膜成纤维细胞（hPDLF）表达核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、骨保护素（OPG）的影响;并进一步研究IL-22是否与牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）具有协同刺激作用。 方法酶消化法结合组织块法原代培养hPDLF,免疫细胞化学染色法鉴定其来源;取第3~ 5代细胞给予不同浓度（0、5、10、25、50、100 ng/mL）IL-22刺激,培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒（CCK-8）进行细胞毒性实验;采用5、10、25 ng/mL IL-22作用于hPDLF 72 h,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测RANKL、OPG mRNA的表达;随后选择最佳刺激浓度10 ng/mL IL-22,与1 μg/mL Pg-LPS分别或协同刺激hPDLF 72 h,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测RANKL、OPG mRNA和蛋白水平的表达。采用单因素方差分析对数据进行统计分析。 结果50、100 ng/mL IL-22刺激hPDLF后,细胞活力明显下降（F_{24 h}= 15.17,F_{48 h}= 76.37,F_{72 h}= 24.409,P<0.05）;5、10、25 ng/mL IL-22均可上调hPDLF RANKL mRNA表达（F= 32.88,P<0.05）,但是对OPG mRNA表达无明显影响（F= 0.719,P= 0.555）;10 ng/mL组和25 ng/mL组上调RANKL mRNA表达较5 ng/mL组显著（P<0.05）;1 μg/mL Pg-LPS亦可显著上调hPDLF RANKL mRNA和蛋白水平的表达;而10 ng/mL IL-22与1 μg/mL Pg-LPS协同作用下RANKL mRNA和蛋白表达可进一步显著上调（F_mRNA= 36.67,F_蛋白= 41.24,P<0.05）,但是对OPG的表达无明显影响（F_mRNA= 0.652,P= 0.593;F_蛋白= 1.271,P= 0.313）。 结论IL-22可通过影响hPDLF表达RANKL/OPG参与牙周炎骨破坏,并且与Pg-LPS具有协同作用。     

血管内皮细胞对牙周组织细胞迁移的影响

目的: 通过血管内皮细胞与牙周组织细胞的复合培养模拟牙周组织再生环境, 研究血管内皮细胞对牙周组织细胞迁移的影响, 为明确血管内皮细胞在牙周组织再生过程中的作用奠定基础。方法: 应用原代培养的血管内皮细胞, 在Transwell嵌套中实现与人牙周膜成纤维细胞、牙龈成纤维细胞间的复合培养。分别以Transwell嵌套滤膜下腔面24 h的细胞数量检测垂直迁移能力, 以划痕实验后0、8、16和24 h计数划痕区域的细胞数量检测水平迁移能力, 以玻片试验及计算机辅助图像处理软件计算实验第1、4和7天细胞覆盖创面的面积检测覆盖创面能力, 并均与单独培养的2种牙周组织细胞作为对照。采用SPSS13.0软件包对实验结果进行统计学分析。结果: 血管内皮细胞存在时, 2种牙周细胞在垂直和水平方向的迁移量均显著高于单独培养组(P<0.01), 且牙周膜成纤维细胞垂直向的迁移量显著高于牙龈成纤维细胞(P<0.01), 但其水平迁移量在实验24 h时则显著低于牙龈成纤维细胞(P<0.01);在血管内皮细胞共存条件下, 2种牙周细胞创面覆盖能力在实验第7天高于对照组, 且牙周膜成纤维细胞的创面覆盖能力的增加显著高于牙龈成纤维细胞(P<0.01)。结论: 血管内皮细胞对牙周膜、牙龈成纤维细胞的迁移和创面覆盖有明显促进作用, 且血管内皮细胞对牙周膜成纤维细胞的垂直向迁移和创面覆盖能力的促进作用更为明显。