CyclinD1mRNA反义寡脱氧核苷酸导入对颊癌细胞株BcaCD885生物学行为的影响

目的 研究CyclinD1 mRNA反义寡脱氧核苷酸导入对颊癌细胞株BcaCD885生物学行为的影响,验证CyclinD1在口腔黏膜癌变中的作用.方法 采用差示PCR技术检测颊癌细胞株BcaCD885中CyclinD1 编码基因的扩增,并以脂质体为载体,将CyclinD1 mRNA的反义寡核苷酸序列转染肿瘤细胞,观察转...     

人颊癌BcaCD885细胞Fas表达水平与移植瘤形成和增殖的关系

目的 :研究Fas表达水平与人颊癌BcaCD885细胞移植瘤形成、增殖及凋亡的关系 ,探讨其相关机制。方法 :用脂质体将真核表达重组质粒pBK -Fas导入人颊癌BcaCD885细胞。转染 72h后 ,收集转染及未转染细胞 ,每组细胞分别接种 10只裸鼠。观察移植瘤形成及增殖状况 ,绘制肿瘤生长曲线。实验结束采集肿瘤标本 ,称重 ,计算肿瘤生长抑制率。同时以RT -PCR检测两组移植瘤细胞FasmRNA表达 ,流式细胞仪检测移植瘤细胞凋亡、增殖和Fas蛋白表达。结果 :Fas转染组移植瘤形成时间平均延长 3 .4d ,各观察点移植瘤体积均小于未转染组 ,二者差异有显著性 (P <0 .0 1)。RT -PCR和流式细胞术检测显示 ,Fas转染上调FasmRNA表达 ,提高Fas蛋白阳性表达率、阳性表达强度和细胞凋亡指数 ,但不影响肿瘤细胞增殖指数。结论 :Fas基因转染抑制移植瘤形成和增殖与提高Fas表达、增加肿瘤细胞凋亡有关。     

反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞凋亡的影响

目的 探讨反义bel-2寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide,ODN）对BcaCD885细胞凋亡的影响。方法 以脂质体 Lepofection为载体,一过性转染20μmol/L反义及正义bel-2 ODN于BcaCD885细胞后,通过细胞形态观察及流式细胞术（FCM）分析,从形态学及细胞学水平对凋亡细胞进行检测。结果 20μmol/L反义bel-2 ODN转染组,细胞出现了凋亡形态学改变,FCM检测凋亡率与对照组间存在显著差异（P<0.05）。而 20μmol/L正义bell-2ODN转染组与对照组相似,在形态学上未见明显的凋亡细胞出现,FCM检测两者凋亡率不存在显著差异（P<0.05）。结论 反义 bel-2 ODN能促进 BcaCD885细胞凋亡。     

硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸对BcaCD885颊癌细胞凋亡及热敏感性的影响

目的　探讨硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸(AS-sODN)对BcaCD885颊癌细胞凋亡及热敏感性的影响。方法　以脂质体Lipofectin为载体,转染AS-sODN于BcaCD885细胞内,倒置显微镜观察细胞形态学改变,TUNEL原位末端标记检测细胞凋亡,流式细胞技术(FCM)测定细胞凋亡率及Bcl-xL蛋白表达水平;转染AS-sODN于BcaCD885 细胞内,再以43℃,40 min加热细胞,FCM检测细胞凋亡率。结果　AS-sODN转染后,BcaCD885颊癌细胞出现皱缩、呈浮起状,TUNEL原位末端标记阳性,Bcl-xL蛋白表达明显下降(P<0·05),热诱导细胞凋亡率明显提高(P< 0·05)。结论　硫代反义Bcl-xL寡脱氧核苷酸能诱导BcaCD885颊癌细胞凋亡并能提高其热敏感性。     

反义bcl-2寡脱氧核苷酸对BcaCD885细胞内源性bcl-2表达的阻断作用

目的　探讨与 bcl-2翻译起始部位碱基互补的反义 bcl-2寡脱氧核苷酸 ( oligodeoxynucleotide,ODN)对 Bca-CD885细胞内源性 bcl-2表达的阻断作用。方法　以脂质体 Lepofectin为载体 ,一过性转染 2 0 μmol/L 反义及正义 bcl-2 ODN于 Bca CD885细胞中 ,FCM-抗体观测转染后 2 4h、3 6h、48h细胞内 bcl-2基因蛋白表达变化 ,RT-PCR技术检测转染后 2 4h bcl-2 m RNA的表达变化。结果　转染反义 bcl-2 ODN后 2 4h、3 6h、48h Bca CD885细胞内 bcl-2基因蛋白表达与对照组相比都明显下降 ( P<0 .0 5 ) ,而正义组与对照组无差异 ( P>0 .0 5 ) ;正反义组 bcl-2m RNA与对照组相比无明显变化 ( P>0 .0 5 )。结论　反义 bcl-2 ODN能在蛋白翻译水平特异性抑制颊癌细胞内源性 bcl-2蛋白表达     

转染Bax基因提高BcaCD885颊癌细胞热敏感性的研究

目的：探讨Bax基因对BcaCD885颊癌细胞热敏感性的影响。方法：采用脂质体Lipofectamine 2000转染人Bax-α基因重组质粒pORF-hBax-α于人颊癌细胞株BcaCD885细胞中，再对细胞进行43℃ 40min水浴加温处理，用流式细胞仪检测BcaCD885细胞的凋亡率及Bax蛋白的表达水平；用RT-PCR技术检测BcaCD885细胞的Bax mRNA的表达水平。结果：Lipofectamine 2000能将人Bax-α基因重组质粒pORF-hBax-α导人BcaCD885颊癌细胞中，Bax-α基因重组质粒pORF-hBax-α能在BcaCD885颊癌细胞中表达，提高BcaCD885颊癌细胞内Bax蛋白质及mRNA的水平，促进热诱导BcaCD885颊癌细胞凋亡的发生。结论：转染Bax基因于BcaCD885颊癌细胞内，能提高细胞对热杀伤的敏感性。     

趋化因子SDF-1及其受体CXCR4对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨SDF-1/CXCR4生物轴对口腔鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响.方法 采用MTT法检测细胞的增殖能力.通过趋化实验观察细胞的侵袭迁移能力.结果 口腔鳞状细胞癌细胞在SDF-1作用下增殖反应明显增强,CXCR4抗体可明显抑制肿瘤细胞的增殖(P＜0.05).趋化实验显示SDF-1可诱导口腔鳞状细胞癌细胞发生明显迁移,经50μg/ml CXCR4抗体孵育后,SDF-1介导Tca8113细胞的这种侵袭能力明显减弱(P＜0.05).结论 CXCR 4/SDF-1受体配体系统可介导口腔鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移,在癌细胞向颈部淋巴结转移中发挥着重要作用.干扰SDF-1/CXCR4的相互作用有可能成为治疗口腔鳞状细胞癌的新方法.     

苯并蒽诱导金黄地鼠颊黏膜癌变的重要致病基因筛选

目的 利用基因芯片和生物信息学分析技术探讨口腔黏膜癌变发生发展的不同阶段基因表达谱的改变,并筛选癌变的重要致病基因.方法 用9,10-二甲基1,2苯并蒽(9,10-dimethylen-1,2-benzanthracene,DMBA)诱导建立金黄地鼠颊鳞状细胞癌模型,分别提取并纯化正常颊黏膜、癌前病变和鳞状细胞癌组织的总RNA并合成用Cy3荧光标记的cRNA,分别与含有41 000条基因-表达序列标签(expressed sequence tags,EST)的Agilent大鼠全基因表达谱芯片杂交,以Ratio≥2和≤0.5为阈值确定癌变3个不同阶段的差异表达基因并分析相关生物信息,然后用Gene Spring10.0软件行Venn图分析,筛选出在口腔颊黏膜癌变发生发展的3个不同阶段均持续表达异常的基因,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)对部分差异表达基因行验证分析.结果 金黄地鼠颊黏膜自正常黏膜到鳞状细胞癌的过程中,共有5255条差异表达基因,其中表达上调2896条,下调2359条.癌变的3个不同发展阶段均持续表达异常的基因共有22条,其中表达上调3条,下调19条.对上调基因Eaf-2和下调基因Ecg-2行RT-PCR验证结果与芯片结果相符.结论 口腔黏膜癌变涉及众多基因表达的改变;癌变的不同阶段均持续表达异常的基因可能为癌变的重要致病基因,对以上基因的探讨将对研究口腔黏膜癌变发生发展的分子机制和靶向治疗具有重要作用.     

大鼠颊黏膜鳞状细胞癌单克隆细胞系Rca-B的建立及其生物学特性研究

目的：建立大鼠颊黏膜鳞癌单克隆细胞系，并观察其生物学特性，为口腔癌的研究提供大鼠来源的恶性肿瘤细胞系、移植瘤和转移动物模型。方法：将4-硝基喹啉-1-氧化物诱发的SD大鼠颊黏膜鳞癌组织标本进行体外传代培养，利用有限稀释法获得单克隆细胞。光学和电子显微镜观察该细胞的形态变化，细胞计数和四唑盐比色法观察细胞的增殖能力，染色体分析确定细胞核型特点，流式细胞仪检测其细胞周期；动物实验观察细胞裸鼠皮下接种成瘤率及实验性肺转移能力。结果：成功得到单克隆细胞系，细胞形态和生物学观察结果表明，该细胞系符合鳞癌细胞的基本特征，65代细胞群体倍增时间为25．44h，平板克隆形成率为56．30％。细胞周期分布S期占20．13％；染色体为四倍体核型。角质蛋白和波形蛋白免疫组织化学染色均为阳性。细胞系裸鼠皮下接种成瘤为16／16；细胞系行裸鼠尾静脉注射后，其实验性肺转移为10／10；该单克隆细胞系SD大鼠同种异体皮下接种不能成瘤。结论：成功建立SD大鼠颊黏膜鳞癌细胞系Rca—B，细胞系具有高转移鳞癌细胞的典型生物学特征；该细胞系是研究口腔鳞癌分子发生机制和防治策略的又一理想模型。     

阻断内源性bcl-2蛋白表达提高BcaCD885颊癌细胞热敏感性的研究

目的：探讨与bcl—2翻译起始部位碱基互补的反义bcl—2寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucletide，ODN)对BcaCD885颊癌细胞热敏感性的影响。方法：以脂质体Lepofectin加为载体，转染20μM反义bcl—2 ODN于BcaCD885细胞内，阻断内源性bcl—2蛋白表达，再以43℃40min加热后，以流式细胞术—抗体及DNA分析对bcl—2蛋白、bax蛋白和细胞凋亡进行检测。结果：反义bcl—2 ODN阻断BcaCD885细胞内源性bcl—2蛋白表达后，bax／bcl—2升高，细胞凋亡率明显提高。结论：阻断BcaCD885细胞内源性bcl—2蛋白表达能提高其热敏感性。     

CCND1、ORAOV1、ERCC1在舌鳞状细胞癌中的表达和临床意义

目的:通过观察 CCND1、ORAOV1、ERCC1在舌鳞状细胞癌中的表达情况,探讨CCND1、ORAOV1、ERCC1与舌癌发生、发展的相关性。方法:应用免疫组织化学染色方法检测38例舌鳞状细胞癌组织芯片及4例正常舌组织芯片中CCND1,ORAOV1,ERCC1蛋白表达情况,并分析其与临床病理特征的关系。结果:舌癌组织中CCND1蛋白的阳性表达率明显高于正常舌组织(P<0.05),但其过表达水平与正常舌组织相比无统计学差异;CCND1阳性表达率及过表达水平与患者年龄、性别、肿瘤组织学分级及肿瘤有无淋巴结转移之间无明显相关。ORAOV1在舌癌组织中的表达明显升高(P<0.05),且与肿瘤有无淋巴结转移之间显著相关(P<0.05);ORAOV1在舌癌中的过表达水平与对照组相比无明显差异,但随着肿瘤分化程度的降低ORAOV1的过表达水平显著上升(P<0.05)。ERCC1蛋白在舌鳞状细胞癌组织中的阳性表达率及过表达水平均明显低于正常舌组织(P<0.05),并均与肿瘤有无淋巴结转移之间显著相关(P<0.05);且与高、中分化组相比,低分化组ERCC1蛋白过表达水平上升,但无统计学差异。结论:在舌鳞状细胞癌组织中CCND1和ORAOV1显著高表达,ERCC1表达显著降低,三者的检测对早期诊断舌癌具有指导意义。     

口腔鳞癌细胞分泌的胞外体对其生物学行为的影响

目的:研究口腔鳞状细胞癌细胞细胞株(OSC-4)分泌的胞外体对细胞生物学行为的影响。方法:培养 OSC-4,从其上清培养液中分离提纯胞外体(exosome, EXO),CD9标记,将提取的胞外体作用于OSC-4,MTT检测胞外体对 OSC-4增殖能力的影响,细胞划痕实验检测胞外体对OSC-4迁移能力的影响,transwill小室侵袭实验检测胞外体对OSC-4侵袭能力的影响。结果:细胞上清液提取物免疫金标结果可见金标记的CD9,即分离提纯物为胞外体;MTT检测结果显示胞外体作用后的OSC-4的增殖能力增强(P＜0.05),细胞划痕实验结果显示其迁移能力增强和transwill小室侵袭实验结果显示其侵袭能力也增强(P＜0.05)。结论:OSC-4分泌的胞外体可以促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、浸润能力。     

c-fos调控p16/CyclinD1信号途径并促进口腔鳞状细胞癌增殖和迁移

目的:探讨c-fos对口腔鳞状细胞癌增殖和迁移的影响及作用机制.方法:免疫组化法分别检测口腔鳞状细胞癌组织标本和正常口腔黏膜组织标本(n=60)中的CyclinD1、p16和c-fos.根据不同处理将HN6和SCC9细胞分为空白对照组、siRNA-scramble组、siRNA-c-fos组.检测各组细胞中CyclinD1和p16 mRNA和蛋白表达量的变化,以及细胞增殖和迁移能力的变化.结果:与正常组比较,病例组中c-fos和CyclinD1表达增加,p16表达降低;与空白对照组相比,siRNA-c-fos组HN6和SCC9细胞中CyclinD1表达显著降低,p16表达明显上升,细胞的增殖能力和迁移能力都显著下降.结论:c-fos可以通过p16/CyclinD1信号途径增强口腔鳞状细胞癌增殖和迁移.     

pEGFP—N1-Snail真核表达质粒的构建与表达

目的：构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,并进行鉴定,转染SCC25肿瘤上皮细胞,检测其表达。方法：利用RT—PCR方法从SCC9肿瘤上皮细胞中提取Snail基因片段,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T—Snail重组质粒,挑选阳性克隆,PCR鉴定后送测序。重组质粒双酶切后与pEGFP—N1真核表达载体连接,构建pEGFP—N1-Snail真核表达质粒,进行测序、酶切鉴定,表明质粒构建成功。分别抽提pEGFP—N1及pEGFP—N1-Snail质粒,用脂质体2000转染SCC25肿瘤上皮细胞,RT．PCR检测Snail在该细胞中表达。结果：本实验成功构建了pEGFP—N1—Snail真核表达质粒,并在SCC25肿瘤上皮细胞中表达。结论：本实验结果为进一步研究Snail作为转录抑制因子诱导上皮间质转化提供实验基础。     

口腔鳞癌中Rb/cyclinD1/p16通路表达及其病理意义

目的：探讨口腔鳞癌(OSCC)中Rb／cyclinD1／p16通路表达及其病理意义。方法：使用免疫组化方法在37例OSCC标本中检测Rb、cyclinD1、p16蛋白表达,并与患者临床病理参数进行相关性分析。结果：Rb、p16、cyclinD1阳性表达率分别为76％、49％和57％;Rb和p16表达呈负相关(P=0．02);cyclinD1表达与肿瘤大小(P=0．02)和淋巴结转移(P=0．01)呈正相关;p16表达与年龄呈负相关(P=0．02)。结论：1)OSCC中和Rb和p16之间可能存在的调控机制;2）p16缺失是OSCC发生中的早期事件;3)cyclinD1对肿瘤的生长作用大于对肿瘤的发生作用,与OSCC的增殖和淋巴结转移关系密切,并可能作为标志物对OSCC的预后和转移作出评估。     

nm23-H1基因对BcaCD885细胞侵袭、粘附和运动力影响的研究

目的：通过nm23-H1的转化及导入BcaCD885细胞株，建立稳定、高效、低毒的转染方法，观察nm23-H1对BcaCD885细胞株侵袭转移能力的影响。方法：（1）利用基因转化技术，制备高纯度的nm23-H1真核表达质粒；（2）利用阳离子脂质体介导的转染技术，完成转染方法的建立；（3）利用免疫组化技术，检测转染前后的NDPKA的表达；（4）利用transwell小室和冲刷实验，观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化。结果：（1）使用重组的pCMV-N-B 的真核表达载体，将nm23-H1转染口腔癌,细胞并获得稳定表达；（2）发现BcaCD885细胞株nm23-H1基因的转染前后表达水平有明显差异；（3）转染后的BcaCD885细胞侵袭、粘附、趋化运动能力均显著降低。结论：nm23-H1对BcaCD885细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用。     

口腔鳞癌内源性脂肪酸合成活性测定

目的了解口腔鳞癌及一些口腔正常组织的内源性脂肪酸合成活性.方法切取口腔鳞癌患者新鲜手术标本的癌组织、癌周组织及正常口腔组织块,剪成细块,与[U-14C]乙酸钠孵育2.5h,提取脂质,液体闪烁计数14C的掺入量.结果癌组织14C的掺入量为395cpm/mg±146cpm/mg湿组织,癌旁为22cpm/mg±10cpm/mg湿组织,口腔粘膜为176cpm/mg±64cpm/mg湿组织,骨骼肌为7cpm/mg±2cpm/mg湿组织,腮腺为94cpm/mg±18cpm/mg湿组织,脂肪为16cpm/mg±5cpm/mg湿组织,淋巴结为125cpm/mg±47cpm/mg湿组织.结论口腔鳞癌组织的内源性脂肪酸合成活性显著高于癌周及口腔其它正常组织.     

EMS1基因扩增与口腔黏膜癌变的相关研究

目的 了解EMS1基因扩增是否参与口腔黏膜癌变。方法采用显微解剖技术分别获取正常口腔黏膜上皮，口腔白斑患者的单纯增生，轻、中、重度异常增生上皮和原发性口腔鳞癌组织标本78例，应用差示PCR反应检测EMS1基因扩增。结果①分别有20．0％的口腔白斑组织，57．6％的口腔鳞癌组织观察到EMS1扩增；②在口腔黏膜癌变进程中，EMS1扩增开始于中度异常增生黏膜，在伴有淋巴结转移的口腔鳞癌组织中其扩增率有显著增高(P=0．015)。结论EMS1基因扩增与口腔黏膜癌变的演进相平行，似是口腔黏膜癌变的早期分子事件。     

XIAP、XAF1在正常口腔黏膜角化细胞和Tca8113细胞中的表达与定位

目的 明确人正常口腔黏膜角化细胞（hNOK）和舌鳞癌细胞系Tca8113细胞中X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）与XIAP相关因子1（XAF1）的表达与定位情况。方法 对hNOK和Tca8113细胞进行体外培养，间接免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜检测细胞中XIAP和XAF1蛋白的表达与亚细胞定位。结果 在hNOK中XIAP微弱表达，主要分布于胞质和核周区域，而Tca8113细胞中XIAP呈高强度表达，胞质和胞核中均有分布。在hNOK中XAF1主要分布于胞核内，而Tca8113细胞中XAF1均匀分布于胞质与胞核。结论 在口腔黏膜癌变过程中，XIAP可能通过过度表达发挥重要的抗凋亡作用，而XAF1不能有效拮抗XIAP的作用。     

口腔白斑和鳞癌组织中ems1基因扩增的临床意义

目的:探讨em s1基因在口腔白斑和口腔鳞癌组织中扩增的临床意义。方法:采用显微解剖和差示PCR方法在15例正常口腔黏膜组织,30例口腔白斑组织和33例口腔鳞癌组织中检测em s1扩增,Logistic回归分析其与患者临床病理参数之间的相关关系。结果:em s1扩增与口腔鳞癌原发肿瘤大小T分级(P=0.025)、分化程度(P=0.043)、淋巴结状态(P=0.015)、临床分期(P=0.038)有显著相关性。结论:有em s1扩增的口腔鳞癌患者其预后可能较差,提示em s1扩增对OSCC预后有一定的预测价值。