富血小板血浆及带血管筋膜在组织工程骨血管化中的作用组织影像学观察

背景：富血小板血浆中的多种生长因子及带血管筋膜是否具有促进骨再生及血管化作用尚在争论之中。 目的：拟从组织影像学角度评价富血小板血浆及带血管筋膜对骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合的组织工程骨血管化作用效果。 设计、时间及地点：单一样本观察及动物同体对照实验，于2004-10/2007-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：11~12月龄健康杂种犬12 只，体质量20~25 kg，雌雄各半。 方法：①采用密度梯度离心法从犬骨髓中分离骨髓基质干细胞，体外贴壁培养扩增、成骨诱导培养。取杂种犬的股骨制备脱钙骨基质，并与骨髓基质干细胞复合。②将每只犬的背部分为4个区，A，B区，植入加富血小板血浆的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合体，C，D区，仅植入骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合体。A，C区植入物用背阔肌带血管肌筋膜包裹；B，D区植入物用背部不带血管的浅筋膜包裹。分别在4，8，12周各取4只，雌雄各半，麻醉后处死取标本。 主要观察指标：①采用倒置相差显微镜观察骨髓基质干细胞形态，四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线。②行改良钙钴法碱性磷酸酶染色，Von Kossa法、茜素红法，钙结节染色观察诱导成骨细胞形态特征。③应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察复合体的结构。④行大体标本、X射线数字影像及组织学观察评价。 结果：①诱导成骨分化的骨髓基质干细胞分泌的碱性磷酸酶及钙结节染色均呈阳性。②骨髓基质干细胞和成骨诱导细胞的生长曲线呈典型的S形。③同种异体脱钙骨基质与骨髓基质干细胞复合培养后，细胞上架率高，生长状态好，增殖迅速，能分泌大量细胞外基质。④各时间点A，B，C区在成骨的骨量、骨光学密度、血管化程度等方面均明显优于D组（P < 0.05）。 结论：经组织影像学观察证实，富血小板血浆和带血管肌筋膜均能促进组织工程骨的成骨和血管化，且两者具有协同作用。     

犬同种异体脱钙骨基质复合细胞片层的体外培养与观察

背景：如何构建具有类似天然骨结构组织工程骨的问题是组织工程学发展的一个难题。细胞片层技术的出现,为其提供了新的途径。 目的：观察细胞片层与脱钙骨基质的生物相容性及其在脱钙骨基质上的生长情况。 设计、时间及地点：体外观察性实验,于2009-06/2009-09在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：利用温度感应培养基制备犬骨髓基质细胞片层;脱脂、脱钙、脱非胶原蛋白方法制备犬脱钙骨基质。 方法：将温度感应技术制备刮取的细胞片层铺盖于脱钙骨基质表面,用含体积分数为10%胎牛血清及成骨诱导剂的DMEM培养液浸没培养。 主要观察指标：扫描电镜下观察脱钙骨基质的结构及细胞片层在脱钙骨基质上的附着、生长情况。计算脱钙骨基质孔隙率和孔径大小。 结果：扫描电镜下观察可见脱钙骨基质呈三维立体网孔结构。材料孔隙率约为75%。平均孔隙直径为(250.11±98.89) µm,成正态性分布。扫描电镜下观察细胞片层在脱钙骨基质上的附着、生长状况良好,增殖迅速。 结论：细胞片层与脱钙骨基质有较好的生物相容性,脱钙骨基质/细胞片层复合体能够应用于组织工程骨,为构建类似骨结构组织工程骨起到促进作用。 关键词：脱钙骨基质;细胞片层;组织工程;犬;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.043     

重组人骨形态发生蛋白2及制动因素对兔肌腱端重建的影响*

背景：骨-肌腱结合结构的重建可能类似于软骨内成骨,只有形成坚固的止点,重建的韧带才能够真正发挥其生理功能。重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)可使未分化间质细胞、成纤维细胞、成肌细胞及骨髓的基质细胞逆转分化为骨系细胞。 目的：观察rhBMP-2和制动因素对肌腱止点结构重建的影响。 方法：新西兰白兔建立肌腱止点结构重建模型后,随机分成3组。向rhBMP-2短期制动组和rhBMP-2长期制动组实验兔靠近胫骨隧道入口的屈趾总腱内注入重组人骨形态发生蛋白2溶液20 µL,模型组不予注射。术后rhBMP-2短期制动组术肢石膏固定1周后拆除;rhBMP-2长期制动组和模型组兔术肢全程石膏固定。各组分别于手术后2,4,8周通过免疫组化法和RT-PCR测定隧道入口部肌腱中的Ⅰ,Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素的表达。 结果与结论：rhBMP-2可使肌腱止点结构重建兔Ⅰ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素表达水平随时间的延长而增加,而Ⅱ型胶原在术后增加至4周时表达至峰值,8周表达有所下降。注射rhBMP-2未对腱重建兔Ⅰ型胶原mRNA表达产生明显变化;而注射rhBMP-2可使Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达显著增加(P < 0.05),减少制动时间也能使Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素mRNA表达显著增加(P < 0.05)。rhBMP-2能促进Ⅰ,Ⅱ型胶原、骨碱性磷酸酶和骨钙素的表达,并具有诱导肌腱内异位软骨成骨的作用,使肌腱端结构重建成为可能;长时间制动阻碍肌腱附着点的重建。 关键词：肌腱止点;重组人骨形态发生蛋白2;胶原;碱性磷酸酶;骨钙素;肌肉肌腱;组织工程     

双相沉降法重构同种异体脱钙颗粒骨/Ⅰ型胶原的制备及细胞相容性

背景：同种异体脱钙颗粒骨的重构塑型是目前材料开发的热点研究，但至今仍未找到理想的方法。 目的：采用双相沉降法用Ⅰ型胶原将同种异体脱钙颗粒骨黏合制备成重构同种异体骨，并体外考察其与骨髓间充质干细胞的生物相容性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2007-09/12在山西省医用组织库完成。 材料：成年健康Wistar大鼠18只。Ⅰ型胶原为美国Sigma公司生产。 方法：取10只大鼠四肢骨，制备同种异体脱钙颗粒骨，用双相沉降法将Ⅰ型胶原和同种异体脱钙颗粒骨制备成凝胶样复合体；取8只大鼠股骨，分离培养骨髓间充质干细胞；取第5代细胞，分别与同种异体脱钙颗粒骨/Ⅰ型胶原、同种异体脱钙颗粒骨共培养，另以单纯骨髓间充质干细胞为空白对照组。 主要观察指标：双色流式细胞仪分析细胞表型特征。复合培养第7天倒置显微镜观察细胞的黏附和生长状况。复合培养第5天扫描电镜观察同种异体脱钙颗粒骨/Ⅰ型胶原的表面结构和细胞生长情况。共培养第4，7天时收集并计数细胞量，用全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶含量。 结果：①细胞呈CD45-CD90+CD44+CD71+，符合骨髓间充质干细胞表面抗原特征。②共育7 d时，倒置显微镜观察各组细胞形态无明显差异，生长状态良好。③共育4，7 d时，活细胞数和碱性磷酸酶活性测定结果显示，同种异体脱钙颗粒骨/Ⅰ型胶原组显著高于同种异体脱钙颗粒组和空白对照组（P < 0.01）。④扫描电镜观察重构同种异体骨由胶原联结成团块状，表面粗糙。同种异体脱钙颗粒骨/Ⅰ型胶原组共育5 d时，细胞紧密贴附于材料表面，有长突起伸入材料内部；同种异体脱钙颗粒组细胞贴附较少。 结论：双相沉降法制备的重构同种异体骨（同种异体脱钙颗粒骨/I型胶原）具有良好的细胞相容性。     

含重组人骨形态发生蛋白2骨修复材料的体内成骨实验

背景：以往的骨修复材料都优先考虑生物材料对骨缺损的骨传导作用，而含重组人骨形态发生蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的骨修复材料(骨优导)修复骨缺损的作用机制为骨诱导（诱导成骨）作用。 目的：采用两种动物模型观察骨修复材料(骨优导)的体内成骨活性。 设计：分组对比，多角度评估观察实验。 材料：rhBMP-2和载体材料制备的骨修复材料(骨优导)由杭州华东医药集团投资有限公司提供。 方法：①小鼠肌袋异位成骨实验：ICR小鼠72只随机分为rhBMP-2材料5，10，20，40，80，160，250 μg组、空白对照组和假手术组9组，后腿外侧肌肉间隙陷窝分别植入相应剂量的骨优导或空白材料，或做假手术。②犬桡骨骨缺损修复实验：30只犬随机分为rhBMP-2材料1，2，4 mg组、空白对照组、造模组5组，制备桡骨2 cm骨缺损模型，分别植入相应剂量的骨优导或空白材料，造模组不处理。 主要观察指标：①小鼠植入材料当天和植入后21 d拍X射线片观察，21 d后取材，测定新骨的湿重，干重，灰份含量、钙含量。②犬植入后当天、植入后1，2，3个月拍X射线片观察，并对骨愈合情况进行量化后评分。 结果：植入骨修复材料(骨优导)的小鼠在植入后21 d解剖发现植入部位有大量新骨形成，而新骨的干重、湿重、灰分含量、钙含量都和植入的rhBMP-2剂量成线形正比。在犬桡骨骨缺损模型中观察到植入骨优导后1个月，植入区域有明显的新骨形成，植入3个月后愈合良好，两个对照组均未能愈合。量化评分显示rhBMP-2可加速骨缺损修复。 结论：骨修复材料(骨优导)有较强的诱导成骨活性和修复骨缺损作用，具有很好的临床应用前景。     

不同比例脱钙骨基质颗粒和骨水泥复合物修复兔股骨骨缺损

背景：新近研究表明骨水泥诱导成骨能力较差、在体内降解过慢，其单独应用的效果并不理想。因此，需要对其进行改型，希望研制出一种能克服上述缺点的新型材料运用于临床。 目的：观察脱钙骨基质颗粒、丙烯酸树脂骨水泥复合物填充修复股骨骨缺损的能力，从而确定该复合材料的最佳配方。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-05/09在重庆医科大学动物实验中心完成。 材料：将脱钙骨基质颗粒和丙烯酸树脂骨水泥按不同质量比例(2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4)构成复合材料。 方法：在新西兰大白兔双侧股骨制备骨缺损填充模型，将各比例复合材料植入骨缺损处，以单纯丙烯酸树脂骨水泥材料作为对照。 主要观察指标：对复合材料和单纯材料进行扫描电镜观察及生物力学测试。在术后4，8，12周时进行大体标本观察、组织病理学、X射线片观察，比较其修复填充骨缺损的能力。 结果：脱钙骨基质颗粒与丙烯酸树脂骨水泥质量比在3∶7~6∶4的范围内，复合材料中存在较多100 μm 以上的裂隙，当质量比小于3∶7时，材料内部的大部分间隙< 100μm，质量比大于6∶4时两种材料不能有效地凝固在一起。随质量比的增加，材料抗压极限强度递减，各组数据经方差分析，差异具有显著性意义(P < 0.05)。在各时间点大体标本观察、组织病理学、X射线片观察显示骨缺损填充部位均有不同程度新骨形成。12周时脱钙骨基质颗粒与丙烯酸树脂骨水泥质量比在4∶6时骨结合率最高。 结论：随着脱钙骨基质颗粒质量比的增加，孔隙越丰富而材料力学强度逐渐降低。脱钙骨基质颗粒与丙烯酸树脂骨水泥质量比为4∶6时修复低承重部位松质骨的骨缺损效果较好。     

脱细胞天然骨基质与诱导性成骨细胞的体外相容性

摘要 背景：前期工作表明TritonX-100处理的脱细胞骨基质已满足组织学和免疫学方面的修复要求。如果细胞能在材料表面很好地生长,将利于进一步进行体内动物实验。 目的：采用细胞培养法在体外评估脱细胞骨基质与诱导后成骨细胞的生物相容性。 方法：第3代骨髓基质干细胞经成骨诱导分化培养液诱导分化为成骨细胞,接种于TritonX-100处理的脱细胞骨基质及羟基磷灰石表面,检测成骨细胞的碱性磷酸酶表达并用扫描电镜观察材料表面的细胞生长情况。 结果与结论：碱性磷酸酶活性分析均表明,TritonX-100处理的脱细胞骨基质在培养48 h之后比羟基磷灰石更利于诱导成骨细胞生长;扫描电镜下可见,成骨细胞在脱细胞骨基质表面呈现立体生长方式,细胞呈球形,并且聚集成簇。体外实验结果显示成骨细胞与脱细胞天然骨基质有较好的生物相容性。 关键词：天然脱细胞骨基质;骨髓基质干细胞;成骨细胞;体外培养;生物相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.013     

生长因子在脱钙骨基质上附着方法及存在的问题

摘要 背景：脱钙骨基质作为一种生物衍生骨组织工程支架材料,以其优良成骨性能受到越来越多的关注,然而脱钙骨固有的诱导蛋白较少,骨诱导活性有限。与生长因子复合后诱导骨组织生长的作用明显增强,有利于骨损伤及骨缺损患者的康复。 目的：综述生长因子在脱钙骨基质上的附着方法、研究进展及存在的主要问题。 方法：由第一作者检索PubMed数据库和万方数据库,英文关键词为“Demineralized bone”,“Growth factor”,“Combination”。中文关键词为“脱钙骨”,“生长因子”,“附着”。纳入脱钙骨、生长因子在医学上应用研究的相关文献以及生长因子与脱钙骨附着方法方面的相关文献。 结果与结论：脱钙骨具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性,并且易于与周围骨融合,支持新骨组织的生长。将生长因子固定于脱钙骨上,能使生长因子准确、均匀到达骨缺损处,促进骨组织生长,更有利于骨移植和骨缺损患者的康复。目前脱钙骨基质与生长因子的复合方法仍存在结合不牢固,生长因子释放不稳定等问题,因此还需进一步加强对生长因子与脱钙骨基质复合方法的研究和探索。 关键词：脱钙骨基质;生长因子;附着;生物材料;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.039     

同种异体脱钙骨基质的组织工程学特性

摘要 背景：由骨衍生的支架材料无论形态学和力学特征,具有合成材料无可比拟的优势,脱钙骨基质具有和自体骨最接近的三维结构,同时以Ⅰ型胶原为主,胶原是细胞黏附和生长的良好支架。 目的：从组织工程学角度研究同种异体脱钙骨基质的生物学特性,探讨其作为软骨组织工程支架材料的可行性。 方法：据Urist描述的方法制备青紫蓝兔同种异体脱钙骨基质,扫描电镜观察脱钙骨基质的超微结构,测定其孔径、孔隙率和降解率,测定同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞的黏附率,兔体内植入法评价同种异体脱钙骨基质的组织相容性。 结果与结论：脱钙骨基质呈多孔海绵状三维结构,孔径在210~320 μm之间,孔隙率为92%,体外降解12周降解率达90%以上,脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(51.50±2.30)%,(94.13±2.14)%和(87.24± 1.75)%。兔体内植入6周后脱钙骨基质周围界面未引起明显的炎症和排斥反应,并形成软骨样结构和少量骨组织。说明脱钙骨基质具有适宜的三维多孔结构,降解时间和软骨形成时间同步,同种异体脱钙骨基质与种子细胞黏附率高,与细胞组织相容性好,能满足软骨组织工程对支架材料的要求,是理想的软骨组织工程的支架材料。     

透明质酸钠复合重组人骨形态发生蛋白2注射剂对下颌骨量的扩增作用

背景：对牙槽骨骨量需要扩增的患者而言，固态的支架材料并不太适用。寻找具有流动性和黏附能力、不占体积的材料是目前研究热点。 目的：观察透明质酸钠(sodium hyaluronate，SH)复合重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP-2)注射剂对兔下颌骨量的扩增作用。 方法：60只兔按随机区组设计分为4组：rhBMP-2-SH组、rhBMP-2组、SH组分别于双侧下颌骨膜下置入rhBMP-2-SH复合物0.2 mL、rhBMP-2 0.5 mg、SH 0.2 mL。空白对照组双侧均切开后不作处理即关闭伤口。术后第2，4，8周分批处死动物。处死前作99Tcm-MDP骨显像；处死后切取标本作苏木精-伊红染色观察、胶原I免疫组化、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量检测。 结果与结论：①rhBMP-2-SH组99Tcm-MDP骨显像下颌骨感兴趣区计数比值于2，8周时高于其他各组(P < 0.05)，4周时明显高于其他各组(P < 0.01)。②组织学观察rhBMP-2-SH组于术后2周即有新生骨小梁生成，至8周钙化成板层骨块，并且4周时可见透明软骨细胞出现，胶原Ⅰ免疫组化只在2周骨基质中呈强阳性表达。③rhBMP-2-SH组碱性磷酸酶活性指数明显高于其他各组(P < 0.01)；并随着时间延长而逐渐增高(P < 0.01)。④rhBMP-2-SH组骨钙素含量于4周及8周时明显高于其他各组(P < 0.01)，并随着时间延长而逐渐增高(P < 0.01)。提示rhBMP-2-SH注射剂能于兔下颌骨表面稳定地形成新骨从而达到骨量扩增效应。成骨方式为混合型成骨方式，以膜内成骨为主。 关键词：骨形态发生蛋白；透明质酸钠；注射型；载体；骨量扩增 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.12.005     

仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原的制备及其细胞相容性

摘要 背景：目前骨组织工程常用的支架材料主要有无机材料、有机高分子材料及天然衍生材料等，上述材料各有优缺点，为了充分发挥各类材料的优势，弥补其不足，目前多采用联合材料制备复合支架。 目的：制备新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原，并观察其对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响。 方法：制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料，扫描电镜观察支架材料表面微观形貌；采用真空吸附法将骨形态发生蛋白7多肽与支架材料复合，高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7多肽在体外的释放规律；将骨髓间充质干细胞接种到复合骨形态发生蛋白7多肽的仿生支架材料上，以未复合多肽的支架材料作为对照，检测支架材料表面细胞增殖、黏附率、生长形态及碱性磷酸酶活性。 结果与结论：壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料呈多孔状，孔径10~100 µm；骨形态发生蛋白7多肽可以从支架材料中缓慢释出；在复合多肽的仿生支架材料表面，骨髓间充质干细胞的黏附及向成骨细胞方向分化能力均明显强于对照组(P < 0.05)，而增殖能力与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)。说明新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原是一种理想的骨组织工程支架材料，具有良好的细胞相容性。 关键词：支架材料；骨形态发生蛋白7多肽；壳聚糖；胶原；纳米羟基磷灰石；骨组织工程；细胞相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.08.014     

聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙复合支架材料的细胞相容性

背景：实践证明,有机和无机材料单独应用都不是理想的支架材料。聚乳酸具有良好的生物相容性、生物降解性和生物吸收性,聚乳酸类复合材料将成为21世纪最重要的生物复合材料之一。 目的：观察复合支架材料聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙对成骨细胞黏附、增殖、分化的影响。 方法：取新生24 h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养。通过倒置相差显微镜、苏木 精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色对获得的细胞进行生物学特性的观察与鉴定。然后将第3代细胞与聚乳酸/壳聚糖纤维、聚乳酸-壳聚糖纤维/硅酸钙、聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙三种支架材料体外复合培养。培养3,6,9 d后,采用倒置相差显微镜观察材料周边的细胞形态,通过碱性磷酸酶活性测定法和MTT法观察3种支架材料对细胞分化、增殖的影响。 结果与结论：三种材料均有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,而聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙复合支架材料较聚乳酸/壳聚糖纤维、聚乳酸-壳聚糖纤维/硅酸钙支架材料促进成骨细胞的分化增殖效果更好,证实其生物相容性好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。 关键词：复合支架;细胞相容性;生物材料;成骨细胞;组织工程支架材料;骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.08.016     

复合硫酸钙-脱钙骨基质人工骨聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的理化性能*★

背景：临床研究表明，聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的生物活性较差，不太适合单独用于经皮椎体成形。 目的：探索一种能满足经皮椎体成形填充材料理化要求的具备生物活性的多孔复合材料。 方法：将碳酸氢钠、硫酸钙-脱钙骨基质颗粒粉末和聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥按不同质量比例(1∶40∶60，0∶40∶60， 1∶0∶100)混合构成A、B、C 3种复合材料。检测各种复合物凝固时间、聚合温度、抗稀散性及成型材料的抗压性，以扫描电镜观察其超微结构。 结果与结论：A、B组与C组材料的凝固时间、聚合温度、抗压强度比较差异有显著性意义，但均符合经皮椎体成形填充材料基本要求，抗稀散性均良好。扫描电镜示A组结合较B、C组材料疏松，材料内部孔隙较多。提示复合材料A具有良好的理化性能，能满足作为经皮椎体成形填充材料的基本条件，且具备较好的孔隙结构，可以进一步研究其组织相容性、可降解性、骨传导性及骨诱导性等生物学性能。     

Effects of the blood coagulation vitamin K as an inhibitor of arterial calcification

INTRODUCTION: The transformation of smooth muscle cells (VSMCs) in the vessel wall to osteoblast like cells is known to precede arterial calcification which may cause bleeding complications. The vitamin K-dependent protein MGP has been identified as an inhibitor of this process by binding BMP-2, a growth factor known to trigger the transformation. In this study, we determined if the vitamin K-dependent Gla region in MGP by itself can inhibit the growth factor activity of BMP-2 and if menaquinone-4 (MK4) regulates gene expression in VSMCs. MATERIALS AND METHODS: A synthetic gamma-carboxyglutamic acid (Gla) containing peptide covering the Gla region in human MGP was used to test its ability to inhibit BMP-2 induced transformation of mouse pro-myoblast C2C12 cells into osteoblasts. MK4 was tested by microarray analysis as a gene regulatory molecule in VSMCs. RESULTS AND CONCLUSIONS: The results show that the Gla - but not the Glu-peptide inhibited the transformation which provide evidence that the Gla region in MGP is directly involved in the BMP-2/MGP interaction and emphasizes the importance of the vitamin K-dependent modification of MGP. From the data obtained from the microarray analysis, we focused on two quantitatively altered cDNAs representing proteins known to be associated with vessel wall calcification. DT-diaphorase of the vitamin K-cycle, showed increased gene expression with a 4.8-fold higher specific activity in MK4 treated cells. Osteoprotegrin gene expression was down regulated and osteoprotegrin protein secretion from the MK4 treated cells was lowered to 1.8-fold. These findings suggest that MK4 acts as an anti-calcification component in the vessel wall.     

中药接骨Ⅰ号治疗超声透入桡骨骨折愈合过程中骨形态发生蛋白7的表达*

背景：将低强度脉冲超声波与中药相结合,即中药超声透入疗法,在动物实验和临床中用于骨折的治疗并取得了确切的疗效,然而其促进骨折愈合机制的研究却少有报道。 目的：观察中药超声透入对新西兰大白兔桡骨中段骨缺损愈合过程中骨形态发生蛋白7表达的影响。 方法：84只兔构建双侧桡骨中段骨缺损的骨折模型,建模成功后随机分成3组：中药组给予以接骨Ⅰ号为耦合剂的低强度脉冲超声透入治疗,超声组每日于骨折部位予以普通超声耦合剂的低强度脉冲超声治疗,对照组行假刺激。分别于术后第3,6,9,12,15天取骨痂行采用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测骨形态发生7 mRNA表达和平均吸光度值变化,第4和6周行X射线片检查以观察不同治疗方法对骨缺损愈合的疗效。 结果与结论：X射线检测结果显示中药组骨折愈合效果最好。中药组骨形态发生蛋白7 mRNA表达和平均吸光度值均高于超声组和对照组(P < 0.05),在术后第9和12天最较明显(P < 0.01)。结果证实,中药低强度脉冲超声透入疗法能促进兔桡骨骨折的修复、缩短骨折修复时间,其修复作用与促进骨形态发生蛋白7表达有关。     

Bone healing in rabbit calvarial critical-sized defects filled with stem cells and growth factors combined with granular or solid scaffolds

Purpose

In pediatric neurosurgery, decompressive craniectomy and correction of congenital cranial anomalies can result in major cranial defects. Corrective cranioplasty for the repair of these critical-sized defects is not only a cosmetic issue. The limited availability of suitable autogenous bone and the morbidity of donor site harvesting have driven the search for new approaches with biodegradable and bioactive materials. This study aimed to assess the healing of rabbit calvarial critical-sized defects filled with osteogenic material, either with bioactive glass scaffolds or tricalcium phosphate granules in various combinations with adipose stem cells or bone marrow stem cells, BMP-2, BMP-7, or VEGF to enhance osteogenesis.

Methods

Eighty-two bicortical full thickness critical-sized calvarial defects were operated. Five defects were left empty as negative control defects. The remaining 77 defects were filled with solid bioactive glass scaffolds or tricalcium phosphate granules seeded with adipose or bone marrow derived stem cells in combination with BMP-2, BMP-7, or VEGF. The defects were allowed to heal for 6 weeks before histologic and micro-CT analyses.

Results

Micro-CT examination at the 6-week post-operative time point revealed that defects filled with stem cell-seeded tricalcium phosphate granules resulted in new bone formation of 6.0 %, whereas defects with bioactive glass scaffolds with stem cells showed new bone formation of 0.5 to 1.7 %, depending on the growth factor used.

Conclusions

This study suggests that tricalcium phosphate granules combined with stem cells have osteogenic potential superior to solid bioactive glass scaffolds with stem cells and growth factors.

     

完全脱钙松质骨的生物学特性*★

背景：脱钙松质骨被认为是一种“理想”的软骨组织工程支架材料已被广泛应用，但对其某些生物学特征目前仍不是十分清楚。 目的：体外观察脱钙骨基质的降解性能、孔隙率以及骨髓间充质干细胞和脱钙骨基质的黏附性。 设计、时间及地点：体外观察实验，分别于2005-01-08/04-15在兰州大学骨科研究所和2007-08-01/11-15在桂林医学院中心实验室进行。 材料：取青紫兰兔四肢骨干骺端及椎体松质骨，采用Urist提供的方法制作脱钙骨基质。 方法：将脱钙骨基质置于磷酸盐缓冲溶液中测定其降解率；用液体置换法测其孔隙率；用细胞计量法测定生长良好的浓度为1× 108 L-1的第3代骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的黏附率。 主要观察指标：脱钙骨基质的降解率、孔隙率及骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的黏附率。 结果：脱钙骨基质的降解随时间的延长逐渐加速，完全降解需要10~12周；所测孔隙率为(77.15±3.44)%；浓度为1×108 L-1的第3代骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质具有较高的黏附率(平均为71.25%)。 结论：脱钙骨基质的降解曲线和骨髓间充质干细胞的增殖曲线相一致，具备良好的孔隙率和黏附率，提示脱钙骨基质可能为软骨组织工程比较理想的生物支架材料。 关键词：脱钙骨基质；降解率；孔隙率；黏附率；骨髓间充质干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.011     

脉冲电刺激对改性纳米羟基磷灰石/聚丙交酯-乙交酯复合材料表面

背景：目前,骨组织工程的研究主要集中在成骨细胞特性研究和骨修复材料研制两大领域,而对细胞与细胞外材料的相互作用,尤其是调节和促进两者间相互作用的相关研究尚未给予足够的重视。 目的：在低聚乳酸接枝纳米羟基磷灰石/聚丙交酯-乙交酯(Hydroxyapatite nanocrystals surface-grafted with L-lactic acid oligomer/ Poly(lactide-co-glycolide), op-HA/PLGA)复合材料上接种成骨细胞,观察脉冲电场刺激对成骨细胞增殖和成骨相关基因表达的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-05/2009-01在中国科学院长春应用化学研究所高分子物理与化学国家重点实验室完成。 材料：op-HA和PLGA由中科院长春应用化学研究所制备。 方法：实验分为PLGA无电刺激组、op-HA/PLGA无电刺激组、PLGA电刺激组和op-HA/PLGA电刺激组。将op-HA/PLGA和PLGA氯仿溶液分别于盖玻片表面铺成薄膜,并接种兔成骨细胞,体外培养7 d。电刺激组刺激电压为2 V,频率为1 Hz,占空比为20%,每天刺激1 h。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞周期,Real-time PCR检测骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白的表达。 结果：脉冲电刺激组op-HA/PLGA上生长的成骨细胞S期细胞百分比明显高于其他组(P < 0.05)。op-HA/PLGA与PLGA比较能上调骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白3种基因表达量,并且施加脉冲电刺激组骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨连接蛋白3种基因表达量高于未加电刺激组。 结论：op-HA/PLGA复合材料是一种很好的骨修复材料,脉冲电刺激能促进成骨细胞在材料上的增殖能力,提高成骨活性相关基因的表达水平。     

TGF-beta1 increases tyrosine hydroxylase expression by a mechanism blocked by BMP-2 in human neuroblastoma SH-SY5Y cells

Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were used to study the effects of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) and bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) on neuronal differentiation and acquisition of a catecholaminergic phenotype. SH-SY5Y cells express the intracellular factors activated through the receptors of the TGFbeta superfamily members, Smad1 and Smad4, as in basal conditions or after differentiation with 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) or retinoic acid (RA). TGF-beta1 and BMP-2 induce differentiation in SH-SY5Y cells by different pathways: the effect of TGF-beta1 is potentiated by TPA and the effect of BMP-2 is blocked by RA. Cell differentiation due to TGF-beta1 treatment is accompanied by an increase in tyrosine hydroxylase (TH) expression, more pronounced in the presence of TPA or RA and counteracted by BMP-2. BMP-2 and RA both induce noncatecholaminergic cell differentiation, and together they may induce choline acetyltransferase expression in serum-cultured cells. In conclusion, our results suggest that TGF-beta1 and BMP-2 may contribute, in opposite ways, to regulation of the neuronal catecholaminergic phenotype.     

Increased expression of TF in BMP-7-treated human mononuclear cells depends on activation of select MAPK signaling pathways

Bone morphogenetic protein (BMP)-7 regulates atherosclerotic plaque calcification, and it contributes to increased thrombogenicity of lipid-rich lesions by enhancement of TF expression in monocytes/macrophages by unknown mechanism. Since Erk1/2, JNK and p38 mitogen activated protein kinases (MAPKs) regulate TF expression, we studied involvement of MAPK pathways in BMP-7-induced activation of TF in human mononuclear cells (MNCs). Whole blood from healthy volunteers was treated with BMP-7, MNCs were isolated, and TF expression was assessed by western blot (WB) and In-Cell Western assay. Phosphorylation and nuclear translocation of Smad1/5/8 in response to BMP-7 stimulation of MNCs was evaluated by WB and confocal microscopy. Activation of MAPKs was judged by measuring the levels of phoshorylated Erk1/2, JNK, and p38 in the lysates of MNCs. The impact of Erk1/2 and p38 activation was studied by use of PD98059 and SB203580 inhibitors, respectively. Stimulation of whole blood with BMP-7 increased the levels of TF in the lysates of MNCs by 7-fold as compared to 12-fold after LPS stimulation. It was followed by elevation in TF fuctional activity. It was accompanied by elevated levels of phosphorylated Smad 1/5/8 and nuclear translocation of Smad1/5/8 proteins. Treatment of whole blood with BMP-7 led to a phosphorylation of Erk1/2, JNK and p38 MAPKs. BMP-7-induced TF expression was partially inhibited by Erk1/2 inhibitor, whereas TF expression was completely abolished by p38 inhibitor. BMP-7-dependent activation of TF in human MNCs by BMP-7 is accompanied by activation of canonic Smad1/5/8 signaling pathway and depends on activation of Erk1/2 and p38.