IL-18对肾小管上皮细胞表型转化的影响

目的：研究IL-18对体外培养肾小管上皮细胞表型转化的影响，以明确IL-18在慢性肾脏疾病中的可能作用机制。方法：应用体外细胞培养技术培养人肾小管上皮细胞侏（HK-2）。应用RT-PCR技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA水平，用免疫细胞化学方法（ICC）及Western blot技术分别检测IL-18对HK-2细胞表达仪-SMA蛋白的影响。结果：（1）IL-18可促进HK-2细胞表达α-SMA、TGF-β1 mRNA，且两者之间呈正相关（P〈0．05）。（2）IL-18增加α-SMA阳性HK-2细胞百分数（P〈0．05）。（3）IL-18使HK-2细胞α-SMA蛋白表达水平增加。结论：IL-18可剂量和时间依赖性地促进肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，促进肾间质纤维化。     

Lck对肾小管上皮细胞的IL-12信号传递功能研究

目的 研究lck途径激活后对小鼠肾小管上皮细胞的信号传递功能的影响。方法 应用IL-12、IL-2刺激小管皮细胞,通过原位杂交检测lckmRNA在小管上皮细胞的表达;采用lck抑制剂PP1,阻抑小管上皮细胞,通过原位杂交检测lckmRNA在小管上皮细胞的表达;采用lck抑制剂PP1,阻抑小管上皮细胞的lck激酶,通过免疫印迹和放射自显影方法检测lck对小鼠上皮细胞的信号传递功能的影响。结果 lck激酶激活可调控小管上皮细胞的lck/c-Jun信号传递途径;小管上皮细胞中lck途径激活介导的细胞炎症作用与IL-12的c-Jun表达作用有关。结论 lck在IL-12的信号传递中发挥重要的作用。     

大鼠原代肾小管上皮细胞上IL-18Rα、β链的表达

目的:检测培养的大鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubularepithelialcells,RTECs)是否表达IL-18Rα和IL-18RβmRNA。方法:以肾小管节段贴块法进行原代RTECs的培养。用免疫细胞化学染色法鉴定细胞的类型,用RT-PCR检测RTECs中IL-18RαmRNA及IL-18RβmRNA的表达。结果:免疫细胞化学染色法证实,原代培养的细胞均为RTECs,并表达IL-18RαmRNA和IL18RβmRNA。结论:在RTECs中有IL-18RαmRNA和IL-18RβmRNA的表达,为探讨IL-18R在肾间质纤维化中提供了实验依据的作用。     

IFN-γ对培养的人近端肾小管上皮细胞表达PD-L1的影响

目的　了解培养的人近端肾小管上皮细胞株HK2细胞程序性死亡配体 (PD L1)的表达及其影响因素。方法　RT PCR、流式细胞计数和免疫细胞化学染色法。结果　正常的HK2细胞表达少量PD L1mRNA和蛋白,2 0 0ng mLIFN γ刺激2 4h后其表达升高,并持续至72h ;不同质量浓度的IFN γ(5 0、10 0、2 0 0ng mL)刺激HK2细胞2 4h后,PD L1表达呈剂量依赖性升高,与对照组比较差异显著(P <0 .0 1)。结论　IFN γ刺激培养的HK2细胞表达PD L1升高,推测HK2细胞上表达的PD L1有可能和T细胞上的受体PD 1结合,影响肾小管间质的发病。     

不同常规培养液对人肾小管上皮细胞的影响

目的： 通过4种常规培养液对人肾小管上皮细胞株（HKC）的培养及其细胞表型特征的观察,探讨目前肾小管上皮细胞体外培养存在的有关问题。方法： 采用DMEM（含10%新生牛血清）、DMEM/F12（含5%新生牛血清）、DMEM/F12（含5%胎牛血清）和keratinocyte-SFM（含rEGF和BPE）完全培养液分别进行HKC细胞的体外培养。应用细胞免疫荧光或Western blotting法分别检测传6代细胞cytoketatin-18、E-cadherin、α-SMA和vimentin的表达。结果： HKC细胞经过DMEM（10%新生牛血清）和DMEM/F12（含5%新生牛血清）完全培养液培养3代后,α-SMA和vimentin分别转为强阳性表达,而cytoketatin-18、E-cadherin则分别转为阴性或弱阳性;keratinocyte-SFM完全培养液则具有逆转HKC细胞的cytoketatin-18、E-cadherin阴性转化作用,与此相反,DMEM/F12（含5%胎牛血清）可使这种cytoketatin-18、E-cadherin阳性的HKC细胞发生cytoketatin-18阴性转化。结论： 不论是含血清还是无血清培养液培养的肾小管上皮细胞,均具有体外研究的局限性。     

IL-31对小鼠肺泡上皮细胞趋化因子表达的影响

目的体外分离培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,探讨IL-31对肺泡上皮细胞表达趋化因子的影响。方法酶消化法分离及免疫吸附法纯化小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,透射电子显微镜观察细胞形态及结构,免疫荧光技术检测细胞SP-A的表达。用100 ng/ml IL-31作用小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞24 h后提取细胞RNA,PCR芯片检测小鼠肺泡上皮细胞趋化因子及其受体的表达。结果透射电镜观察发现细胞内存在板层小体,呈同心圆状或平行排列;激光共聚焦显微镜观察可见细胞内有黄绿色荧光;小鼠肺泡上皮细胞经100 ng/ml IL-31作用24 h后,基因芯片检测细胞中表达上调的趋化因子和细胞因子基因11个、受体基因8个。结论成功分离培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,IL-31可诱导肺泡上皮细胞表达趋化因子,表明IL-31可通过诱导趋化因子参与气道炎症反应。     

不同剂量黄芪注射液对人肾小管上皮细胞黏附分子CD146表达的影响

目的:探讨不同剂量黄芪注射液对人肾小管上皮细胞(HK2)黏附分子CD146表达的干预作用。方法:将传代HK2等分为5组,进行培养处理:正常对照组(LG组,只加5.5mmol/L D-葡萄糖),高糖组(HG组,加入25mmol/L D-葡萄糖),黄芪注射液干预组:在HG组中加入不同剂量黄芪注射液,加入2μg/ml者为低剂量组(AML组)、加入20μg/ml者为中剂量组(AMM组)、加入200μg/ml为高剂量组(AMH组)。观察37℃培养24h、48h、72h后,各组HK2形态变化、分别收集各组培养细胞,用Western Blotting检测其CD146蛋白表达。结果:HG组较LG组HK2变长,呈梭形,细胞间连接疏松,间隔增大;黄芪注射液干预各组,细胞形态均较HG组变小变圆,且连接逐渐紧密,AMH组呈堆积生长。HG组CD146表达均较LG组明显增加(P0.01),干预24h、48h、72h,AMM组、AMH组与HG组比较,CD146表达均明显减少(P0.05或P0.01),AML组干预培养72h,CD146的表达亦明显减少(P0.01)。结论:黄芪注射液改善高糖引起的HK2形态改变和降低其CD146表达,对防治DN有积极作用。     

白蛋白超载诱导近端肾小管上皮细胞表达α-平滑肌肌动蛋白

目的：探讨白蛋白超载是否可以诱导近端肾小管上皮细胞（PTCs）向成肌纤维细胞转化（EMT）。方法：大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK52E培养至70％融合或完全融合时，用不同浓度（0-30 g/L）去脂牛血清白蛋白(dBSA)超载144 h。NRK52E形态和结构改变用光镜和电镜观测。上皮细胞标记抗原E-钙黏蛋白和β-连环蛋白，以及成肌纤维细胞标记抗原α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达用免疫荧光和Western 印迹法检测。结果：dBSA超载可诱导未完全融合NRK52E表达α-SMA，少数细胞变为长梭形，但α-SMA 的表达不呈剂量依赖性。dBSA超载处理不能诱导完全融合的NRK52E表达α-SMA，细胞形态也无改变。dBSA超载完全或未完全融合NRK52E均不能抑制E-钙黏蛋白和β-连环蛋白表达，电镜显示这些细胞仍保持上皮细胞结构，包括微绒毛和紧密连接。结论：白蛋白超载可以诱导PTCs表达α-SMA，促进EMT，但不能诱导PTCs完全转化为成肌纤维细胞，细胞完全融合可抑制白蛋白超载诱导PTCs表达α-SMA。     

TNF-α和IFN-γ对肾小管上皮细胞趋化因子表达的影响

目的探讨细胞因子TNF-α和IFN-γ对肾小管上皮细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11表达的影响。方法分别以TNF-α以及IFN-γ和TNF-α联合作用肾小管上皮细胞HK-2不同时间后,用Real-time PCR和ELISA分别检测CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA和蛋白水平。用流式细胞术检测淋巴细胞表面CXCR3表达情况,通过趋化实验检测细胞培养上清对淋巴细胞的趋化作用。结果肾小管上皮细胞在TNF-α作用12 h后能够诱导趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11mRNA表达上调,CXCL9 mRNA的表达在48 h达到高峰,而CXCL10和CXCL11 mRNA表达高峰在12 h;CXCL9、CXCL10和CXCL11蛋白的基础分泌水平均较低,在TNF-α作用12 h后,分泌水平也逐渐升高,CXCL9、CXCL10在48 h时分泌达到高峰,CXCL11分泌高峰在72 h。与TNF-α单独作用组和IFN-γ单独作用组相比,TNF-α和IFN-γ联合作用使肾小管上皮细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA表达和蛋白分泌明显增强(P<0.05)。与新鲜分离的淋巴细胞相比,活化的淋巴细胞表面的CXCR3表达明显升高(P<0.05)。TNF-α以及IFN-γ和TNF-α联合作用HK-2细胞培养上清对活化的淋巴细胞具有明显的趋化作用(P<0.05)且能被抗CXCR3抗体所阻断(P<0.05)。结论细胞因子TNF-α能诱导肾小管上皮细胞趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11表达,且与IFN-γ联合作用对趋化因子的表达具有协同作用。     

不同分子量尿毒血清组分对人肾小管上皮细胞CTGF基因和蛋白表达的影响

目的：探讨不同分子量尿毒血清组分对人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子（CTGF）基因和蛋白表达的影响。方法:无菌条件下收集40份尿毒症病人血清和20例正常人血清，应用Centricon Plus 20 Centrifugal Filter Devices将尿毒血清分离成分子量 >10 000 D，5 000-10 000 D，<5 000 D 3个组分。应用Western blotting方法检测CTGF的蛋白表达，RT-PCR方法检测CTGF mRNA表达。结果:2.5%-20%浓度尿毒血清组CTGF基因表达均明显高于正常对照组，以10%尿毒血清组最高；分子量 <5 000 D尿毒血清组CTGF基因表达与正常对照组差异无显著，而分子量 5 000-10 000 D和 >10 000 D尿毒血清组CTGF基因表达均高于正常对照组，以分子量 >10 000 D尿毒血清组最高。不同浓度尿毒血清组CTGF蛋白表达均高于正常对照组，且有随着尿毒血清浓度的升高而增高，在不同分子量尿毒血清组中，以分子量 >10 000 D组增高最为显著。结论：尿毒症毒素通过影响人肾小管上皮细胞致纤维化细胞因子CTGF基因和蛋白表达从而在人肾小管-间质纤维化中起重要作用，而以分子量大于 10 000 D的尿毒症毒素在其中起主要作用。     

Regulation and production of IL-8 by human proximal tubular epithelial cells in vitro

A number of inflammatory kidney diseases are associated with interstitial nephritis and influx of leucocytes in the renal interstitium. Potentially the influx of neutrophils in the interstitium may be induced by the chemotactic cytokine IL-8. In the present study we have analysed the production of IL-8 by cultured human proximal tubular epithelial cells (PTEC) in response to a number of proinflammatory cytokines. Primary cell lines of proximal tubular epithelium obtained from ten different kidneys, and cultured under serum-free conditions, were found to produce IL-8 to different degrees from not detectable levels up to 10·8±1·5 ng IL-8 per 1×10⁵ cells in 72 h. Gel filtration chromatography of PTEC supernatant indicated that the size of IL-8 of PTEC is 15·1 and 8·1 kD, and is chemotactically active for polymorphonuclear neutrophils (PMN). Addition of 0·5 ng/ml rIL-1α or 1000 U/ml recombinant tumour necrosis factor-alpha (TNF-α) to the culture media of PTEC induced an up-regulation of IL-8 production up to 6·3-fold and 3·0-fold, respectively. The up-regulation by IL-1α and TNF-α was dose- and time-dependent. In contrast, 500 U/ml recombinant interferon-gamma (rIFN-γ) down-regulated the production of IL-8 3·4-fold. Northern blot analysis showed that IL-1α and TNF-α increased the expression of IL-8 mRNA, whereas IFN-γ reduced IL-8 mRNA expression. Taken together, these experiments indicate that human PTEC are a potential source of IL-8 in the kidney, and that IL-8 produced in the proximal tubule can be induced by various proinflammatory cytokines.     

Intracellular trafficking pathway of BK Virus in human renal proximal tubular epithelial cells

Intracellular trafficking of BK Virus (BKV) in human renal proximal tubular epithelial cells (HRPTEC) is critical for BKV nephritis. However, the major trafficking components utilized by BKV remain unknown. Coincubation of HRPTEC with BKV and microtubule disrupting agents prevented BKV infection as detected by immunofluorescence and western blot analysis with antibodies which recognize BKV large T antigen. However, inhibition of a dynein, cellular motor protein, did not interfere with BKV infection in HRPTEC. A colocalization study of BKV with the markers of the endoplasmic reticulum (ER) and the Golgi apparatus (GA), indicated that BKV reached the ER from 6 to 10 h, while bypassing the GA or passing through the GA too transiently to be detected. This study contributes to the understanding of mechanisms of intracellular trafficking used by BKV in the infection of HRPTEC.     

尿毒血清对人类肾小管上皮细胞增殖及转分化的影响

目的: 探讨尿毒血清对人近端肾小管上皮细胞株( HK-2)增殖及转分化的影响,以期阐明尿毒症毒素在人肾小管－间质纤维化中的作用。方法: 采用MTT比色法检测尿毒血清对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测尿毒血清对细胞周期、细胞增殖指数(PI)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性细胞百分率的影响。结果: MTT法示5％-20％浓度尿毒血清组A₄₉₀值均高于正常对照组,流式细胞检测示10％-20％浓度尿毒血清组G₁期细胞均低于正常对照组,PI指数均高于正常对照组,但不同浓度尿毒血清组组间无明显差异;各浓度尿毒血清组α-SMA阳性细胞百分率均高于正常对照组,且随着尿毒血清浓度的增高而增高。结论: 慢性肾衰竭患者体内蓄积的尿毒症毒素可能通过促进肾小管上皮细胞增殖及转分化从而加速肾小管－间质纤维化进程,导致肾功能进行性恶化。     

C-反应蛋白诱导人肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨与微炎症状态相应的C-反应蛋白(CRP)水平是否诱导肾小管上皮细胞凋亡。方法:以微炎症状态相应的CRP浓度刺激HK-2细胞。采用AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。采用Hoechst 33258染色观察肾小管上皮细胞凋亡的形态学改变。比色法检测细胞caspase-3活性。Real-time PCR检测促凋亡基因bax、抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达。结果:CRP呈剂量和时间依赖性地诱导HK-2细胞凋亡,细胞凋亡在CRP浓度为10 mg/L时达高峰,在20 mg/L时则以晚期凋亡和坏死为主。Hoechst 33258细胞核染色显示CRP作用的HK-2细胞呈现染色质浓缩、碎裂或染色质边集等细胞凋亡的特点。CRP增高细胞caspase-3的酶活性、上调促凋亡基因bax的表达和下调抗凋亡基因bcl-2的表达。结论:CRP轻度增高可诱导肾小管上皮细胞凋亡。     

Genistein ameliorates parathyroid hormone-induced epithelial-to-mesenchymal transition and inhibits expression of connective tissue growth factor in human renal proximal tubular cells

Introduction

Genistein, a soybean and soy-based product, has been reported to inhibit the growth of a wide range of cancer cells, but there is no evidence concerning its treatment of chronic kidney disease. The aim was to investigate whether genistein has potential to inhibit parathyroid hormone (PTH)-induced renal interstitial fibrosis.

Material and methods

Using human renal tubular epithelial HK-2 cells, α-smooth muscle actin (α-SMA) was assessed by using immunofluorescence detection. α-Smooth muscle actin, E-cadherin and connective tissue growth factor (CTGF) were measured by Western blot analysis. The promoter activity of the CTGF gene was examined by the luciferase reporter assay.

Results

When cells were treated with PTH (0.1 nM) for 48 h, α-SMA protein expression was induced significantly, the protein expression of E-cadherin decreased substantially, and the promoter activity of the CTGF gene as well as its mRNA and protein expression levels increased (p < 0.01). Interestingly, genistein effectively inhibited PTH-induced α-SMA expression, restored E-cadherin expression, decreased mRNA and protein expression of CTGF, and suppressed the promoter activity of CTGF in a dose-dependent manner.

Conclusions

Genistein has the ability to block the biomarker for renal transdifferentiation and epithelial-to-mesenchymal transition, α-SMA, following PTH treatment and inhibit CTGF expression in human renal tubular epithelial cells; these might be important modes of actions that contribute to genistein anti-fibrogenic effects and may have great implications for its potential in clinical treatment of renal interstitial fibrosis.     

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。     

白细胞介素2对淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶在肾小管上皮细胞中表达的影响

目的：探讨IL-2对肾小管上皮细胞中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck） mRNA及蛋白表达的影响以及Lck在狼疮肾炎中的致病作用.方法：采用BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞为实验对象,分别给予 IL-2（100 U/ml）刺激.应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肾小管上皮细胞Lck mRNA的表达,免疫印迹法检测Lck蛋白的表达,比较IL-2刺激前后Lck mRNA及蛋白表达水平的变化.结果：正常BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞中仅有微量Lck mRNA及蛋白表达,经IL-2刺激后二者的Lck mRNA及蛋白表达水平均有增加,以狼疮小鼠肾小管上皮细胞增加更为显著.结论：（1）肾小管上皮细胞中有Lck基因的表达.（2）肾小管上皮细胞经IL-2刺激后Lck mRNA及蛋白表达水平增加,提示IL-2可活化肾小管上皮细胞诱导Lck表达,进而可能通过一系列信号传导作用,发挥生物学作用.相对于BALB/c小鼠,狼疮小鼠肾小管上皮细胞在IL-2刺激后Lck表达更明显,提示狼疮小鼠肾小管上皮细胞可能更易激活.（3）由于Lck在狼疮肾炎小鼠肾小管上皮细胞中异常表达,推测Lck可能作为细胞因子或炎症因子的重要信号分子,促进狼疮肾炎的发生.     

福辛普利抑制LPS诱导的人肾小管上皮HK-2细胞TAK1表达

目的 探讨福辛普利(FOS)对脂多糖(LPS)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)增殖及对转化生长因子β激活激酶(TAK1)表达的影响.方法 体外培养正常HK-2细胞,分为3组:对照组(Ctrl)、LPS诱导组(10μg/L)、FOS干预组(LPS 10 μg/L+FOS 1×106 mol/L).细胞培养12、24和48 h,以甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附(ELISA)法观察细胞上清纤维黏连蛋白(FN)变化,Western blot法检测TAK1、FN蛋白表达,实时荧光定量PCR检测TAK1 mRNA的含量.结果 LPS诱导组较对照组细胞的增殖水平(在48 h分别为0.462±0.013及0.363±0.014)、胞质中FN的含量均显著增高,且自12 h开始TAK1蛋白(在48 h分别为1.627±0.101及0.547±0.010)及mRNA表达水平上调(P＜0.01,P＜0.05),FOS干预组细胞增殖(在48 h为0.396 ±0.011)、FN的含量及TAK1的表达(在48 h蛋白表达为1.308±0.097)较同时间点LPS组(在48 h蛋白表达为1.627 ±0.101)显著下调(P＜0.01).结论 FOS可能通过抑制HK-2的增生与活化,减轻细胞外基质FN的沉积,起到延缓肾间质纤维化的作用.     

肾小管上皮细胞转分化及逆转的分子机制

肾小管上皮细胞转分化(EMT)过程广泛存在于胚胎发生和肾纤维化过程中,其调节是一个复杂有序的过程,受多种细胞因子和细胞外基质的调节。促纤维化细胞因子如TGF-β1具有诱导EMT的作用,而抗纤维化细胞因子如骨形成蛋白-7(BMP-7)和肝细胞生长因子(HGF)能抑制纤维化过程。     

特异性小干扰RNA沉默CHOP对肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:研究C/EBP同源蛋白(CHOP)对肾小管上皮HK2细胞凋亡的影响。方法:采用qPCR法检测急性肾损伤患者及健康对照者血清中CHOP的mRNA水平。体外培养肾小管上皮HK2细胞,随机分为对照组、阴性组和si-CHOP组,si-CHOP组和阴性组分别转染CHOP小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,通过转化生长因子β1(TGF-β1)诱导细胞损伤。MTT法检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞的凋亡率, Western blot检测细胞中细胞核抗原Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:与健康对照者相比,急性肾损伤患者血清中CHOP的表达量显著增加(P0.05);转染CHOP siRNA显著降低肾小管上皮细胞HK2中CHOP的水平,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。敲减CHOP的表达显著增加肾小管上皮HK2细胞的活力(P0.05),降低其凋亡率(P0.05),增加Ki-67和PCNA的表达量(P0.05),下调cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05)。结论:在急性肾损伤患者血清中CHOP的水平增加。敲减CHOP表达通过调节增殖和凋亡相关蛋白的表达抑制肾小管上皮HK2细胞的凋亡。