小肠粘膜下层的制备及细胞相容性的实验研究

目的了解猪小肠粘膜下层(SIS)的细胞相容性,探讨用SIS为生长载体复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构筑组织工程骨的可能性。方法用物理和化学方法处理猪小肠粘膜下层,将兔骨髓基质干细胞与SIS进行体外复合培养,分别进行组织学、相差显微镜和扫描电镜观察。结果经物理和化学处理的SIS纯度高,孔隙多,胶原纤维未受损;BMSCs在SIS材料上生长、粘附、增殖,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分。结论SIS的细胞相容性良好,不影响BMSCs的形态,对细胞生长和功能表达无抑制作用,可以用作骨组织工程的支架材料。     

生物可降解材料聚β-羟基丁酯对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：检测生物可降解材料聚β-羟基丁酯(PHB)对兔骨髓基质细胞(BMSC)形态、生长、附着及增殖的影响。方法：将家兔BMSC进行体外培养，以诱导剂(β-甘油磷酸钠，地塞米松，L-抗坏血酸)使其向成骨细胞分化，行碱性磷酸酶染色并计算阳性率，将PHB与成骨细胞样细胞进行体外复合培养，用倒置显微镜及扫描电镜观察PHB对BMSC的形态、生长、附着及增殖的影响。结果：在诱导剂的作用下BMSC向成骨细胞分化，碱性磷酸酶染色呈阳性，其阳性率随培养时间延长而增加。PHB与成骨细胞样细胞进行体外复合培养后显示PHB对BMSC的形态、生长、附着及增殖均无不良影响。结论：PHB具有良好的生物相容性，可望与骨髓复合移植修复骨缺损。     

组织工程化骨膜的构建及其在体外的成骨活性检测

[目的]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程骨膜,体外观察其生物学特性并检测成骨活性,为将来体内移植提供实验依据。[方法]以猪小肠粘膜下层基质作为支架材料,与新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)或体外成骨诱导培养后的BMSCs,采用沉淀法复合构建两种组织工程化骨膜(M2及M1),用MTT法检测种子细胞在支架材料上的生长情况;扫描电镜(SEM)观察种子细胞在支架材料上的生长、粘附状态;通过ELISA检测碱性磷酸酶活性和骨钙素分泌水平。[结果]种子细胞在SIS上生长良好,M2及M1在含有成骨诱导剂的培养基中培养可分泌一定量骨钙素(11 d达峰值),并表达碱性磷酸酶活性(7 d达峰值)。而且,Ml所分泌骨钙素的量与碱性磷酸酶活性高于M2,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]利用兔骨髓间充质干细胞与猪小肠粘膜下层复合构建组织工程化骨膜能够保持较稳定的生物活性,种子细胞能良好地在支架上附着、生长增殖,并稳定地分泌一定量的骨钙素和碱性磷酸酶,在体外表达较强的成骨活性。     

许旺细胞与小肠黏膜下层体外复合培养的形态学研究

目的观察体外培养的许旺细胞在小肠黏膜下层（SIS）表面的黏附生长状况，探讨SIS与许旺细胞（SCs）的生物相容性。方法体外分离培养SD乳鼠的许旺细胞，接种于制备好的SIS进行复合培养，不同时间段通过相差显微镜、组织学、扫描电镜和透射电镜观察SCs在SIS上的黏附、生长和增殖情况。结果相差显微镜下见3—5d后SIS边缘SCs生长良好；组织学观察见5d时许旺细胞与SIS表面黏附紧密；扫描电镜观察见SIS表面SCs增殖黏附良好，胞体突起显著，呈端对端的相互连接或排列成束，细胞表面可见有蛋白颗粒分泌。透射电镜观察见SIS表面许旺细胞生长状态良好，细胞紧密贴附生长于SIS表面；许旺细胞与SIS交界部见细胞底部形成一些突起与SIS接触。结论SCs能够在SIS表面良好地黏附生长，SIS作为支架材料，与SCs具有良好的生物相容性。     

体外转染牛碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质干细胞增殖的影响

目的：观察牛碱性成纤维细胞生长因子（bbFGF）基因体外转染兔骨髓基质干细胞（BMSC）的生长特性。方法：用脂质体法把pHβ-bbFGF7质粒导入体外分离培养的BMSC，G418筛选出阳性克隆，建立TBMSC系，体外连续传代培养TBMSC，观察生长特性。结果：在无血清Dulbecco改良基础培养基（DMEM)培养下，空白对照（BMSC）、阴性对照（BMSC／pHβ0)，第1、2天细胞分裂指数为5‰，第3天后细胞生长停滞。处理组细胞倍增时间为26．0h，分裂指数为40‰，差异有非常显著性（P＜0．01）。结论：将pHβ-bbGFF质粒体外转染兔骨髓基质干细胞可明显促进骨髓基质干细胞增殖，为组织工程化软骨的研究提供了依据。     

聚丙烯延胡索酸酯/β-磷酸三钙合成和对骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的制备聚丙烯延胡索酸酯／β-磷酸三钙（PPF／β-TCP）复合材料。在体外检测PPF／β-TCP材料对骨髓基质细胞（BMSC）的黏附、增殖、成骨能力的影响，对PPF／β-TCP生物材料的性能进行评价。方法二步反应法合成PPF单体，加入β-TCP后进行交联。骨髓基质细胞在PPF／β-TCP材料上培养2、4、6、8、10、12h后胰蛋白酶消化，检测黏附细胞数。BMSC和PPF／β-TCP材料复合培养，用MTT法检测BMSC的增殖，绘制生长曲线，检测碱性磷酸酶的含量。结果BMSC在PPF／β-TCP材料上黏附，2～8h细胞数增加，到10h黏附数达最高，约为68％。BMSC在PPF／β-TCP材料上生长，第4、5天为对数生长期，第7、8天进入平台期。BMSC种植在PPF／β-TCP后上表达ALP并不断增加。结论PPF／β-TCP生物降解材料对BMSC的黏附、增殖、成骨功能无不良影响，是一种有前途的生物降解材料。     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。     

小肠粘膜下层与雪旺细胞生物相容性的研究

目的研究猪小肠粘膜下层(SIS)与体外培养的鼠雪旺细胞(SCs)的生物相容性。方法在体外将分离培养的SD乳鼠SCs接种于制备好的猪SIS上进行复合培养,通过相差显微镜和扫描电镜观察不同时间段SCs在SIS上的黏附、生长与增殖情况,用酶联免疫吸附测定和逆转录聚合酶链反应方法检测SCs分泌神经生长因子-β和脑源性神经生长因子的情况。对照组为接种于未平铺SIS的孔中正常培养的SCs。结果培养3～5 d后,相差显微镜下见SIS边缘SCs较为密集,黏附良好,多呈长梭形生长;扫描电镜观察见SIS表面SCs增殖黏附良好,胞体突起显著,呈端对端连接或成束排列,细胞表面可见蛋白颗粒分泌。酶联免疫吸附测定和逆转录聚合酶链反应方法检测发现,SCs与SIS复合培养后,神经生长因子-β和脑源性神经生长因子分泌良好,与对照组的SCs差异无统计学意义。结论猪SIS与鼠SCs有良好的生物相容性,有望用作支架,供SCs黏附生长,构建组织工程神经,用于修复周围神经缺损。     

纳米组织工程骨与兔骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的探讨纳米组织工程骨(NHAC)与兔骨髓基质干细胞(RMSCs)体外生物相容性,为应用组织工程方法修复骨缺损提供依据。方法将RMSCs与NHAC体外复合培养,进行形态学和功能测定。结果骨髓基质干细胞能在纳米组织工程骨上良好地粘附、增殖、生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到纳米组织工程骨的影响。结论NHAC具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的生物材料。     

食管黏膜上皮细胞与SIS复合培养及生物学特性研究

目的 探讨体外快速培养犬食管黏膜上皮细胞（esophageal mucosa epithelial cells，EMECs）及其与SIS体外复合培养的方法，为组织工程食管研究提供实验依据。方法 取2～5周龄幼犬5只，无菌获取其食管组织，采用混合酶消化法，分离培养EMECs，于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，取第2代细胞培养1～5d绘制生长曲线并进行细胞表面标志物细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK-19）检测。取第2代EMECs与SIS复合培养4、8d，行形态学、组织学及扫描电镜观察。结果 倒置相差显微镜下EMSCs呈典型铺路石样。CK-19免疫组织化学染色可见细胞胞浆呈阳性染色。MTT法测定第2代细胞在传代培养2d生长达高峰。EMECs与SIS复合培养4d，细胞呈多角形，细胞间连接紧密，呈铺路石样排列；SIS表面形成1～2层细胞组成的复层上皮样结构。8d时，细胞密度增大，SIS表面形成2～3层细胞组成的复层上皮样结构；扫描电镜见细胞在材料上已大量增长，呈层状排列。结论 采用混合酶消化法，用含6％FBS的DKSFM培养犬EMECs，方法简便，适合推广应用。SIS与EMECs有良好的相容性，可作为构建组织工程食管的理想支架材料。     

冻存对组织工程骨膜生物活性的影响

目的 观察冻存复苏过程对组织工程骨膜生物学特性的影响.方法 体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),与猪小肠黏膜下层(SIS)构建组织工程骨膜.冻存后复苏培养,扫描电镜(SEM)观查复苏后种子细胞生长状况、噻唑蓝(MTT)比色法绘生长曲线、钙-钴法检测碱性磷酸酶(ALP)、生物化学法定量分析ALP的表达.结果 冻存复苏后BMSCs仍能在SIS上保持良好的生长状况;组织工程骨膜复苏后成骨诱导培养5d时ALP含量达峰值,10～15d时稳定在较低的量,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05). 结论组织工程骨膜冻存复苏后仍保持较稳定的生物活性.     

小肠粘膜下层复合成骨诱导的骨髓基质干细胞体内成骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,以小肠粘膜下层为支架材料复合成骨诱导后的骨髓基质干细胞构建骨组织的可行性。方法将取自兔骨髓中的骨髓基质干细胞经成骨诱导液诱导后,与经处理的猪小肠粘膜下层在体外共培养。1周后,将共培养的猪小肠粘膜下层埋置于无胸腺裸鼠皮下。分别在不同时间进行扫描电镜、透射电镜、组织学和免疫组织化学观察。结果体外培养时,见细胞与材料粘附良好,且分泌大量的细胞外基质,细胞分化、增殖活跃。大体观察植入体内的细胞-材料复合物,见颜色变白,组织硬度增加,组织学和电镜观察见有大量骨组织形成。免疫组化示细胞为具有分泌特异性骨钙蛋白的成骨细胞。结论骨髓基质干细胞经成骨诱导为成骨细胞后与小肠粘膜下层共培养,植入裸鼠体内后可形成骨组织,小肠粘膜下层是一种良好的骨组织工程支架材料。     

骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层体内异位成骨的研究

目的 观察骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建组织工程骨膜的异位成骨能力.方法 将常规方法培养的BMSCs与SIS复合(M1组)及进行成骨诱导培养BMSCs与SIS复合(M2组)植入兔(n=8)背部肌袋内作为实验组,以单纯SIS作为阴性对照.术后4、8、12周观察其成骨情况.结果 BMSCs在SIS支架上黏附、生长良好.植入体内4、8、12周,M2、M1、SIS组成骨量分别为(25.08±0.79)%、(18.81±0.42)%和(13.98±1.86)%,各指标M2组高于M1或SIS组(P<0.05),M1组高于SIS组(P<0.05).随着时间的延长,两实验组成骨量逐渐增加(P<0.05),SIS组的成骨量变化不明显(P>0.05). 结论 BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜在体内有异位成骨作用,而且经过成骨诱导的组织工程骨膜成骨作用更加明显.     

组织工程骨修复牙槽嵴裂的实验研究

目的探讨骨髓来源的种子细胞复合胶原蛋白海绵构建组织工程骨修复牙槽嵴裂的可行性。方法12条实验犬被分成4组。于双侧上颌第3切牙处去除长15mm牙槽骨形成牙槽嵴裂动物模型;经股骨骨髓穿刺,分离骨髓基质干细胞,培养、传代扩增诱导后,与蛋白胶原海绵混合培养48h,植入骨缺损处。饲养12周后处死动物,通过三维CT及组织学检查评价骨缺损修复的效果。结果实验组牙槽骨断端间形成完整的骨连接,切片可见髓腔通畅,新形成的牙槽嵴宽度与松质骨组相似(P>0.05),但高度不足(P<0.05)。结论组织工程骨可以较好地修复牙槽嵴裂,有望成为修复牙槽嵴裂的治疗方法。     

Growth of bone marrow stromal cells on small intestinal submucosa: an alternative cell source for tissue engineered bladder

OBJECTIVE: To assess the potential use of bone marrow stromal cell (BMSC)-seeded biodegradable scaffold for bladder regeneration in a canine model, by characterizing BMSCs and comparing them to bladder smooth muscle cells (SMCs) by immunohistochemistry, growth capability, and contractility. MATERIALS AND METHODS: Bone marrow was taken by direct needle aspiration from the femurs of five beagle dogs for the in vitro study. Mononuclear cells were isolated by Ficoll-Paque density gradient centrifugation and cultivated in medium 199 with 10% fetal bovine serum. BMSCs were characterized by cell proliferation, in vitro contractility, immunohistochemical analysis, and the growth pattern on small intestinal submucosa (SIS) scaffolds compared to bladder SMC cultures from the same dogs. Another six dogs had a hemicystectomy and bladder augmentation with BMSC-seeded (two), bladder cells including urothelial cells plus SMC-seeded SIS (two) and unseeded SIS scaffolds (two). The six dogs were followed for 10 weeks after augmentation. RESULTS: In vitro BMSCs had a significant contractile response to calcium-ionophore, with a mean (sem) 36 (2)%, relative contraction (P < 0.01), which was similar to bladder SMCs but markedly different from fibroblasts. BMSCs also expressed alpha-smooth muscle actin by immunohistochemical staining and Western blotting, but did not express desmin or myosin. In vivo, both BMSC-seeded and bladder cell-seeded SIS grafts had solid smooth-muscle bundle formation throughout the graft. CONCLUSIONS: BMSCs had a similar cell proliferation, histological appearance and contractile phenotype as primary cultured bladder SMCs. SIS supported three-dimensional growth of BMSCs in vitro, and BMSC-seeded SIS scaffold promoted bladder regeneration in a canine model. BMSCs may serve as an alternative cell source in urological tissue engineering.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

骨髓基质细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的为验证三维打印研究中动物模型的可靠性，采用骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）修复裸鼠颅骨缺损。方法共10只裸鼠，其中实验组（n=5只）：颅骨缺损区植入BMSCs／脱钙骨；材料对照组：颅骨缺损区植入单纯脱钙骨，采用实验组自身对照（n=5只）；空白对照组（n=5只）：双侧颅骨区造成缺损后旷置。术后3个月取材进行大体观察、组织学和免疫组化（骨钙蛋白）检查。结果术后3个月，实验侧组织质地较硬，组织学表现为骨结构，骨钙蛋白免疫组化阳性；对照侧质地较软，组织学表现为结缔组织，骨钙蛋白免疫组化阴性；空白对照组仍表现为颅骨缺损。结论采用BMSCs可修复裸鼠颅骨缺损，验证了三维打印研究中动物模型的可靠性。     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

骨髓间充质干细胞促进兔预构皮瓣成活的实验研究

目的探讨新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSC)同种异体移植促进预构皮瓣的血管再生,从而提高预构皮瓣存活率的可能性。方法体外分离、培养、鉴定并标记新西兰大白兔的BMSC。在实验兔腹部两侧构建预构皮瓣,两侧皮瓣随机分为实验组和对照组,实验组在股血管周围经皮注射已标记的BMSC悬液,对照组注射等量生理盐水。注射后第7天追踪观察BMSC移植后的成活情况,术后第14天掀起以股动静脉为轴心血管的岛状皮瓣,分别对两组的岛状皮瓣进行BrdU/vWF的免疫荧光双标检测;对岛状皮瓣中的VEGF进行Western Blot半定量分析;岛状皮瓣形成后第7天,观察两组皮瓣的成活情况。结果 BMSC异体移植后成活良好;实验组皮瓣内VEGF蛋白表达量明显高于对照组;实验组皮瓣内BrdU标记阳性细胞胞浆内有vWF信号;将预构皮瓣制成岛状皮瓣后第7天,实验组和对照组皮瓣存活率分别为(93.1±2.6)%、(51.5±7.5)%,P<0.05。结论异体移植BMSC可促进预构皮瓣的血管再生,提高预构皮瓣存活率。