丙型肝炎病毒核心蛋白抑制肝癌细胞P16、P27的表达

目的：探讨HCV核心蛋白对肝瘤细胞P16、P27表达的影响。方法：将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK－CMV的Hind　Ⅲ和BamH I位点间，构建重组质粒PBK－HCVc。再将重组质粒PBK－HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。免疫组化，蛋白印迹检测P16、P27蛋白表达；RT－PCR检测P16、P27mRNA。结果：重组质粒PBK－HCVc在HepG2细胞中有稳定表达；表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的P16、P27在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显下降。结论：HCV核心蛋白能抑制P16、P27表达，可能与肝细胞的癌变有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒与肝细胞癌关系研究进展

据估计，目前全世界感染丙型肝炎病毒(HCV)者约l.7亿。我国大陆以HCVlb、2a型为多，其中肝细胞癌(HCC)和(或)癌周肝组织HCV抗原阳性率达36．2％(25／69)～72．7％(48／66)，这种差异与检测方法的不同有关。HCV感染后通常经由慢性肝炎→肝硬化路径引起HCC。HCV抗原表达与肝细胞恶性转化和肿瘤相关基因的功能改变有关，是HCC发生的重要危险因子之一。     

丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒重叠感染对肝细胞癌的影响

运用巢式聚合酶锭反应检测３６例经外科手术治疗的肝细胞癌（ＨＣＣ）２的肝癌组织或癌周组织中的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ，并检测血清中的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）表面抗原来显示ＨＣＣ患者中ＨＣＶ和ＨＢＶ的感染情况。，同时收集一般临床资料。结果表明３６例ＨＣＣ２中，ＨＣＶ感染者１３例（３６．１％），ＨＢＶ感染者３０例９８３．３％），两者重叠感染者１２例（３３．３％），并发现ＨＣＶ、ＨＢＶ重叠感染者较仅ＨＢ     

丙型肝炎病毒核心抗原在肝细胞癌及癌旁组织中的表达

应用ＳＰ法（链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶连结法）对肝细胞癌（４６例）癌组织及癌旁组织（３８例）中丙型肝炎病毒核心抗原进行免疫组织化学染色，发现两者的检出率分别为２１．７％和３６．８％。阳性染色细胞呈弥漫、灶状和散在分布。抗原定位于肝细胞和肝癌细胞的胞浆内，少数有围核分布的特点。阳性染色多呈细颗粒状，少数呈均质状。癌旁组织抗原表达区域中有淋巴细胞浸润聚集。结果提示丙型肝炎病毒感染在肝细胞癌的发生中可能有一定的关联。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用

目的:探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用。方法:将表达HCV核心蛋白的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-core转染人源肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞株QSG7701-core,利用免疫细胞化学、Western blot及凝胶电泳迁移实验（EMSA）等方法检测stat3的磷酸化及DNA结合活性。结果:在表达HCV核心蛋白的QSG7701细胞中,stat3的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组,而总stat3的表达水平3组无明显差别;核内磷酸化的stat3阳性信号明显减弱; stat3的DNA的结合活性明显低于空白质粒转染组和未转染组。结论:在人源永生化肝细胞系中HCV核心蛋白的表达可能具有抑制stat3的磷酸化和DNA结合活性的作用,从而抑制JAK/ stat3信号转导通路活化,这可能是HCV干扰素治疗效果不佳的原因之一。     

丙型肝炎病毒结构蛋白真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)结构蛋白的真核表达载体.方法:用RT-PCR方法扩增HCV结构基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA3中,用磷酸钙转染法将其转入Sp2/0细胞,用免疫组化法检测细胞中瞬时表达的目的蛋白.结果:克隆的基因片段全长约1.9kb,包括C及E2的全长和E1的部分.免疫组化显示表达蛋白位于细胞浆中.结论:构建的丙型肝炎病毒结构蛋白的真核表达载体能够在哺乳动物细胞中得到表达,为进一步研究HCV结构蛋白的性质及各结构蛋白相互作用下的基因免疫效果奠定了基础.     

原发性肝癌患者乙型肝炎病毒与丙型肝炎病毒感染标志物的分析

了解原发性肝癌患者乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的感染状况,并探讨原发性肝癌与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的关系。用酶联免疫吸附法对８２例肝癌患者、８０例肿瘤对照组和１０３例健康对照组进行了乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染标志物的检测。     

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG2细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法 观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2-C和作为对照的细胞株HePG2-CMV的细胞形态;绘制细胞生长曲线;检测细胞周期;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA,P16,P27,P53;半定量RT－PCR检测P16,P27,P53mRNA。结果 转染重组质粒PBK－HVCC的HePG2-C细胞与转染空载体PBK－CMV的HePG2-CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK-HCVC和空载体PBK－CMV后,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2-CMV 81.3%进入G0／G1期,7．7％进入S期;而转染PBK－HCV C的细胞HePG2-C73%进入G0／G1期,13．7％进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2-C细胞PCNA、P53表达显著增加,P16、P27表达显著降低。 同样的变化也发生在转录水平。结论 HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达,增加细胞DNA合成,扰乱细胞周期,进而参与致癌过程。     

丙型病毒性肝炎相关肝细胞肝癌的研究

丙型肝炎病毒(HCV)感染不仅是造成慢性肝病的主要原因,同时也是部分国家和地区肝细胞肝癌(HCC)的主要病因。HCV的结构特点和生命周期的规律使感染易转为慢性化,病毒通过其基因组编码的若干蛋白使肝细胞发生转化。在此过程中,肝脏反复发生的损伤和修复、肝纤维化和肝硬化是HCC发生过程中的几个关键阶段。反应性氧分子家族的作用和HCV感染造成肝细胞基因的遗传损伤可能是导致肝细胞癌变的重要机制。运用体外细胞转染方法和转基因动物模型研究HCV-HCC发病机制已取得一定进展,并将成为研究的主要手段。     

Cloning and sequencing of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus

A hepatitis C virus(HCV)cDNA fragment,534bp in length and designated asQ534,was obtained by PCR amplification with self-designed primers.Q534 was cloned in-to Hinc Ⅱ site of pUC18 and the recombinant plasmid pQ534 was then selected from thebacterial transformants.The sequence analysis indicated that Q534 was a cDNA fragmentof HCV core gene,and located in HCV genome from positions 320 to 853 incorrespondence with Chiron's prototype sequence.The homologies between Q534 and theprototype at the levels of nucleotides and amino acids were 90.0% and 97.6%,respectively.The homologies of Q534 with Japanese HCV-J and HCV-BK strains were 96.6% and97.0% at the nucleotide level,and 98.2% and 98.8% at the amino acid level.In terms ofthe sequence,this Chinese HCV isolate should belong to HCV group Ⅱ.     

Expression of nuclear factor kappa B in hepatitis C virus core gene transfect ed cholangiocarcinoma cells

Objective To establish an experimental model for exploring the role of hepatitis C virus (HCV) in the development of cholangiocarcinomaMethods Recombinant plasmids of HCV- C gene were constructed by molecular cloning techniques and identified by PCR and restriction enzyme mapping. The plasmids were then transfected into QBC939 cells (a cholangiocarcinoma cell line) by Lipofection. After selection with G418, resistant colonies were obtained and analyzed by immunocytochemistry and Western blotting. The morphology was observed by transmission electron microscopy (TEM). The expression of NF- κB was detected by immunocytochemistry.Results Recombinant plasmid was shown by PCR and restriction enzyme mapping to carry the target gene. Moreover, it could efficiently express HCV- C protein in QBC939 cells. HCV- like particles were found in the cytoplasm by TEM, which were spherical with a diameter of 50-80 nm and possessed an outer membrane. Moreover, NF- κB activation could be shown in HCV core- transfected cells.Conclusion Expression of the HCV- C gene in cholangiocarcinoma cells was achieved. Transfected tumor cells (QBC939- HCVc) could be used as a model to study the effect of HCV on the development of cholangiocarcinoma.