疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究

目的 建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v,)的双重聚合酶链反应(PCR)法。方法 根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f．与P．v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规。结果 从P.f.和P．v．感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1-5个虫／μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P．c,)与P.v．相似,在412bp可见扩增条带。经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f．109例、P.v.l114例、P．f. P.v.9例,阳性率67．4％;比常规镜检的阳性率66．3％稍高,尤以检出P．f． P．v．感染病例高。分别检测人工感染P.f．与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果。结论一次性检测P．f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点。对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值。     

疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用

目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段，分析其分子特征，评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物，采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段，与pGEM—Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109；阳性克隆以双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定分析其序列特征；以SSUrDNA为靶基因，建立间日疟PCR诊断方法，并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。蛄果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段，含有267个核苷酸，与间日疟原虫Sall株孢子期SSUrRNA基因序列比较，同源性为99．3％，其中第220住为插入了1个碱基“T”，243住碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板，PER扩增结果显示检测灵敏度至少迭102copy／μl；特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段，而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准，PCR敏感性为100％（102／102），特异性为100％（76／76）。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定，不同地理株间存在单核苷酸多态性，以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异，具有良好的推广使用价值。     

聚合酶链反应检测疟疾的研究

目的 建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法。方法 根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列,设计合成两对引物,采用PCR技术,检测89份门诊“四热”病人血样,并与镜检法进行比较研究。结果 恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带,间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带,PCR检测的阳性率为74.16%,镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%。结论 PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法,对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的间日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值。     

逆转录聚合酶链反应检测恶性疟原虫的应用研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测恶性疟原虫的新方法,并用于检测现场采集血样。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,采用RT—PCR技术,恶性疟原虫预期被扩增出359bp特定扩增带。结果 从培养的恶性疟血样和现场采集的恶性疟血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。本检测系统初步显示可检出0．34个疟原虫／出血样,37份现场采集经镜检确诊的恶性疟血样中,36份RT—PCR检测为阳性,1份RT—PCR检测为阴性,阳性符合率为97．35％。结论 RT—PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

疟疾快速诊断试剂盒的研制及应用

目的：建立一种快速、敏感、简便的疟疾诊断方法。方法：应用快速电泳法和快速薄层色谱法检测疟原虫乳酸脱氢酶（LDH－P）诊断疟疾，并将两检测系统制成试剂盒。检测体外培养的恶性疟原虫不同分离株和疟疾病人全血中的LDH－P，为临床安全用药提供依据。结果：应用快速电泳法和快速薄层色谱法检测体外培养的恶性疟原虫感染红细胞的敏感度分别为10－100个原虫／μl血和25－150个原虫／μl血；检测病人血样的阳性率分别为90．00％和80．00％，检测30份间日疟病人血样的阳性率分别为83．33％和76．67％；检测40份疟区非疟疾血样、非疟区40份健康人及30份其他寄生虫病人血样，仅快速电泳法检测出1份疟区非疟疾血样为阳性。结论：应用快速电泳法试剂盒和快速薄层色谱法试剂盒诊断疟疾，敏感、特异、简便快速，在临床及现场具有很好的应用前景。     

间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

聚合酶链反应用于恶性疟疾诊断初步研究

合成一对恶性疟原虫特异引物，用聚合酶链的反应（PCR）技术检测海南岛恶性疟病人滤纸血滴30例，结果28例阳性，在206bp处可见一条清晰易辨的扩增条带，2例阴性经血片复查，其中1例为间日疟原虫；同时检测间日疟病人血滴和未发现原虫的发热病人血滴各16例，均为阴性，与镜检符合率达98．4％（61／62例）。初步表明PCR法具有准确、敏感、特异、简捷等优点，采用滤纸血滴方便现场采样、保存和送检，且易批量检测，在疟疾临床诊断和流行病学调查方面，将可替代血片镜检法，逐步扩大应用。     

聚合链酶反应对海南疟区儿童带疟原虫的调查

为了解应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测疟区儿童带疟原虫的效果，参照文献合成恶性疟原虫（ＰＦ）与间日疟原虫（ＰＶ）引物各１对，并改进标本处理方法，按ＰＣＲ检测操作常规，对采自乐东县的恶性疟与间日疟混合流行区的儿童血标本，分别进行ＰＦ与ＰＶ的ＰＣＲ检测，同时以厚血膜镜检法对照比较。１１９例儿童血标本检测结果，ＰＣＲ法与镜检法的带疟原虫率分别为６．７２％和５．０４％，镜检发现的ＰＦ与ＰＶ带虫者，ＰＣＲ皆可     

武汉市两种输入性卵形疟巢式PCR检测

目的 了解巢式PCR鉴别卵形疟curtisi及变种wallikeri效果。方法 收集武汉市2008—2015年疟疾患者血样和流行病学资料。提取患者血样中的疟原虫DNA,进行巢式 PCR 检测。结果 采用巢式PCR检测疟疾患者282例,其中恶性疟原虫206例、间日疟原虫62例、三日疟原虫6例、卵形疟原虫19例。巢式PCR结果显示,卵形疟原虫经典型curtisi 和变种型wallikeri 分别扩增出800 bp和780 bp目的 条带。2012—2015年卵形疟占当年疟疾患者分别为4.1%（2/49）、12.2%（9/74）、8.2%（4/49）、11.4%（4/35）,卵形疟总数占全部病例的6.74%,其中,经典型curtisi 14例,变种型wallikeri 3例,混合感染2例,变种型wallikeri检出率占卵形疟26.3%。19例卵形疟病例全部为男性,感染输入地主要分布在撒哈拉沙漠以南地区,2例卵形疟混合感染分别来自安哥拉和尼日利亚。其中有2例卵形疟原虫curtisi型镜检 结果分别为间日疟和恶性疟,1例血片重新复核后为卵形疟,另1例巢式PCR检测为间日疟和卵形疟混合感染型。结论 分子生物学技术可以减少卵形疟误诊的情况;加强卵形疟curtisi及变种wallikeri的巢式PCR 检测,避免误诊。     

应用套式PCR技术检测我国西南部分疟区疟原虫的感染状况

目的　建立鉴别人体四种疟原虫的套式 PCR技术 ,检测我国西南部分疟区疟原虫的感染情况。方法　选用两组疟原虫引物 ,扩增 SSU r DNA特定片段 ,经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色 ,紫外检测凝胶分析仪观察并摄像。结果　采用上述方法扩增出间日疟、恶性疟和三日疟分别为 10 4bp、10 2 bp和 115 bp特异片段。所检测的 138份疟疾患者血样中 ,四川名山县 95份均为间日疟单纯感染 ,筠连县 37份中 10份为与间日疟和 /或恶性疟呈混合感染的三日疟 ,云南金平县的 6份均为合并恶性疟的两种或两种以上疟原虫混合感染。结论　所建立的套式PCR检测系统具有敏感性高、特异性好和稳定可靠等优点 ,在疟疾诊断、虫种鉴别、混合感染的判定、大规模流行病学研究和疫情监控预测等方面具有实际应用价值。     

恶性疟多表位疫苗在鼠疟的保护性试验

为寻找恶性疟原虫基因工程多表位疫苗保护性评价的模型动物,利用鼠约氏疟原虫（Plasmodium　yoelii）及伯氏疟原虫小鼠（Phasmodium　bergher）模型对本实验室构建的恶性疟原虫（Plasmodium　falciparum）多表位基因工程候选疫苗进行了体内保护性及免疫模式试验。结果在约氏疟原虫,先用该疫苗基因的大肠杆菌表达蛋白免疫、后用含同一基因的重组痘苗病毒加强免疫组与野生型痘苗病毒免疫组及空白对照相比,小鼠的死亡时间延长（P<0.01）。结果初步显示,约氏疟原虫鼠模可用作该基因工程多表位恶性疟原虫候选疫苗的保护性评价。     

恶性疟原虫新的PDZ包含蛋白编码区基因的分离与克隆

目的：分离、克隆一种新的恶性疟原虫PDZ结构域包含蛋白（PfPCP）编码区基因,并初步研究其红内期表达。方法：分析恶性疟原虫基因组3号染色体数据库,设计特异的引物,利用RT－PCR从恶性疟原虫海南株红内期mRNA扩增PfPCP编码区基因;利用生物信息学相关软件分析所扩增的基因;利用Western印迹法分析PfPCP在红内期的表达。结果：从恶性疟原虫mRNA扩增到的PfPCP编码区基因长度为2076bp cDNA克隆,编码蛋白长为691氨基酸,具有典型的PDZ结构域。Western印迹显示,该基因在红内期裂殖体期特异性表达。结论：获得新的恶性疟原虫PfPCP编码区基因,该基因在恶性疟原虫红内期裂殖体期特异性表达。     

伯氏疟内质网塑形蛋白SEY1敲除质粒的构建及转染

目的:为了研究重要内质网塑形蛋白SEY1在疟原虫致病性方面的作用,本研究构建敲除伯氏疟原虫PbSEY1的质粒,结合疟原虫转染技术筛选PbSEY1缺失疟原虫突变体。方法:选取PbSEY1编码区中相邻的两个片段作为同源臂进行PCR扩增,并引入特定酶切位点,借助T4 DNA连接酶和In-Fusion无缝克隆的方法将其插入载体pL0034中;利用疟原虫同步化培养及电转染技术将该质粒转入疟原虫,基于基因同源重组原理在疟原虫中敲除PbSEY1并进行药物筛选。结果:（1）获得可用于基因敲除及回复实验的重组质粒pL0034-△PbSey1;（2）在伯式疟原虫中敲除PbSEY1。结论:利用重组质粒pL0034-△PbSey1和疟原虫转染技术初步获得PbSEY1缺失疟原虫突变体,为进一步研究PbSEY1在疟原虫致病性中的作用提供了必要工具。     

约氏疟原虫17XL和17XNL感染小鼠组织病理学差异研究

目的 观察感染约氏疟原虫17XL(P.y 17XL)和17XNL(P.y 17XNL)小鼠的组织病理学差异.方法 常规腹腔注射感染P.y 17XL和P.y 17XNL,观察感染小鼠原虫率和存活率,以及感染对小鼠贫血、体重的影响;感染后第6天处死小鼠,灌注固定后解剖小鼠取出大脑和脾脏,石蜡包埋切片,HE染色进行组织形态学...     

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的：建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）基因转染伯氏疟原虫的模型．方法：将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm. DB./AB. AF. DB．用Bgl Ⅰ酶切线性化．伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测．结果：PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因．结论：成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础．     

新疆输入性非洲恶性疟和三日疟4例报告

本文报道新疆某院2018年收治的输入性2例恶性疟和2例三日疟患者的临床表现、实验室诊断特点、治疗、预防情况。4例患者均为外派非洲喀麦隆、利比里亚、尼日利亚和南苏丹务工人员,均有蚊虫叮咬史,回国返疆前后出现发热、寒战、头痛、烦躁等症状入院。实验室快速法检测疟原虫阳性3例,阴性1例;薄血膜涂片镜检可见恶性疟和三日疟不同阶段环状体、裂殖体、配子体等多种形态特点;炎性细胞因子检测：C-反应蛋白增高,L-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α均明显增高至数倍,血沉加快,而血象变化不大。用蒿甲醚 80 mg 肌肉注射,1 次/d,或以青蒿琥酯静脉注射120 mg,首次剂量加倍,连续7 d方案治疗,7 d 疟原虫转阴1例,1例转阴时间较长为16 d,4例均治愈,随访2个月,均无复燃。