人β-防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗微生物活性的初步分析

目的：在大肠杆菌系统中表达有活性的人β-防御素3(hBD3)。方法：从pGE-T-hBD3重组质粒PCR获得hBD3成熟肽编码区基因，插入pGEX-4T-1构建pGEX-4T-1-hBD3融合表达载体，转化E．coli DH5α宿主菌，进行IPTG诱导，诱导菌经超声裂解后获得包涵体，包涵体经溶解、变性、复性和纯化处理后获得GST-hBD3融合蛋白，再经凝血酶切割。获得纯化的重组hBD3(rhBD3)。对rhBD3采用最小抑菌浓度测定法测定其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。结果：以与GST融合表达的方式，运用pGEX-4T-1系统在大肠杆菌中表达了hBD3，融合蛋白以包涵体形式存在。融合蛋白经凝血酶处理使删释放出来，其对金黄色葡萄球菌的MIC为4μg/ml；对大肠杆菌的MIC为8μg／ml。结论：采用pGEX-4T-1融合表达系统在大肠杆菌中成功地表达了有活性的rhBD3。     

人β防御素-3在人工关节感染患者中的表达及其意义的实验研究

目的观察人β防御素-3(human beta-defensin-3,HBD-3)在人工关节感染患者松质骨中的表达,探讨其意义。方法按临床诊断收集术中切取的假体周围的松质骨和正常髂骨,并分为以下4组:人工关节感染组13例,假体无菌性松动组8例,占位器治疗后组9例,正常组7例。采用HE染色观察炎性细胞浸润,免疫荧光染色观察阳性细胞数目及强度并采用Image-pro plus(IPP)7.0C软件测量平均光密度值。收集术前外周血白细胞计数、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive pro-tein,CRP)结果。分析比较各组间差别。结果 HE染色4组无明显差别,免疫荧光染色以人工关节感染组阳性细胞最多、阳性程度及平均光密度值最高,依次为假体无细菌性松动组,占位器后组及正常组。术前外周血白细胞计数、ESR和CRP感染组最高,其余3组无明显差别。结论 HBD3在人工关节感染及假体无菌性松动患者的假体周围组织和松质骨中存在高表达,且在感染与松动间存在差异。     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建和鉴定人β防御素2（HBD2）的重组腺病毒表达载体，并观察其转染大鼠真皮多能干细胞（dMSCs）后的表达。方法反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增HBD2全长cDNA，亚克隆至穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中，然后转化含骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌BJ5183，通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞，包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞，并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果 经测序、酶切及聚合酶链反应（PCR）鉴定，表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA，并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中，进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs，并有效表达HBD2。结论 本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体，并证实其可在dMSCs中表达。     

人β-防御素3在感染皮肤组织中表达的研究

目的:探讨人β-防御素3(human β-defensin 3,hBD3)在感染皮肤组织中的表达情况.方法:取烧伤患者感染皮肤组织和正常皮肤组织,提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western印迹法检测hBD3的mRNA和蛋白表达水平.结果与结论:感染皮肤组织中hBD3的mRNA和蛋白水平均显著高于正常皮肤组织.感染皮肤组织中hBD3表达增强.     

内毒素诱导小鼠β-防御素-3(mBD3)基因急性时相表达与肝脏损伤的关系

目的：探讨急性时相反应时β-防御素基因表达与内毒素性肝损伤的关系。方法：小鼠腹腔注射内毒素建立急性时相反应。经Northern-blot检测各组织中mBD3mRNA及表达的剂-效、时-效关系。结果：仅在肝脏组织中检测到mBD3mRNA。内毒素诱导mBD3mRNA在肝脏中的表达存在最小诱导剂量。以最小诱导剂量(1．5μg／g)注射后6h才出现mBD3mRNA的表达。8～10h达峰值，12h后表达水平下降。不同剂量内毒素注射后不同时间引起肝脏组织出现不同程度的炎性反应。结论：mBD3基因在肝脏中的急性时相表达与内毒素引起的肝脏组织炎性反应有关。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

重组人β-防御素3对铜绿假单胞菌生物膜结构影响的初步研究

目的研究重组人β-防御素3（rhBD-3）对铜绿假单胞菌（PA）形成生物膜的体外抑制作用。方法平板培养法培养PA,得到早期和成熟期生物膜;琼脂糖弥散抗菌法测定最低抑菌浓度（M IC）;扫描电镜（SEM）观察载体表面BF形态;连续稀释法行活菌计数。结果 rhBD-3对PA的M IC值是64μg/m l。rhBD-3作用后8、16、24 h,膜片载体表面PA活菌黏附量减少,且随着rhBD-3浓度的增高,活菌群数量进行性减少;SEM观察见rhBD-3组少量散在的游离细菌,有少量小斑片状多糖复合物,而空白对照组可见大量分布均匀的微菌落和游离细菌及多糖复合物交联。结论 rhBD-3可以抑制PA的BF形成,并对早期和成熟期BF具有破坏作用。     

蚓激酶基因在真核细胞COS-7中的表达

目的：为了实现蚓激酶基因片段F-3，F-5在真核细胞COS-7中的表达，获得具有生物学活性的重组蚓激酶蛋白。方法：将F-3，F-5与分泌表达载体pcDNA3，1( )连接，构建重组表达质粒pcDNA-3和pcDNA-5，利用COS-7细胞进行基因F-3和F-5的瞬时表达；纤维蛋白平板法对培养液上清进行活性检测。结果：蚓激酶基因片段F-3，F-5在真核细胞COS-7中实现了表达；SDS-PAGE显示蛋白质条带，纤维蛋白平板法检测培养液上清有明显的纤溶活性。结论：蚓激酶基因片段F-3，F-5可在真核细胞COS-7中分泌表达，表达产物具有一定的纤溶活性。     

人表皮生长因子基因的克隆及其真核表达载体的构建

人表皮生长因子（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｈＥＧＦ）具有促进表皮细胞增殖的作用，与免疫性皮肤病及创面组织修复有着密切的关系。随着分子生物学理论和技术的发展，人们对外源性基因在真核系统中表达的机理有了进一步了解〔１〕。为了进行ｈＥＧＦ基因的真核表达及表皮组织基因治疗方面的研究，我们采用逆转录ＰＣＲ方法扩增了ｈＥＧＦ及其信号肽基因，并选用ｐＢＫＣＭＶ穿梭质粒构建了ｈＥＧＦ基因真核表达质粒。１　材料和方法１．１　主要试剂限制性内切酶ＮｈｅⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ及Ｔ４Ｄ…     

蜕皮素诱导基因表达细胞系的建立及其应用

目的：建立一个可诱导表达目的基因的细胞系以研究新基因的功能。方法：将含蜕皮素受体基因的表达载体pVgRXR稳定转染NIH3T3细胞，经zeocin抗性筛选，获得单克隆抗性细胞株，并进一步将可诱导表达质粒pIND-LacZ分别转染各单克隆细胞，经松甾酮(ponasterone)A诱导和β-半乳糖苷酶活性检测，鉴定出阳性单克隆。结果与结论：在建立稳定表达功能性蜕皮素受体的NIH3T3细胞系的基础上，我们进一步建立了一个可诱导表达红系分化相关基因(EDAG)的细胞系，并对目的基因诱导表达特性及诱导目的基因表达后细胞表型的改变进行了初步观察，结果提示EDAG可能与血液细胞的增殖分化密切相关。     

用脂质体法转染COS—7细胞条件的优化

现有的多种真核细胞基因转染方法存在繁琐和效率低的问题，我们利用脂质体包裹的方法，以瞬时表达系统中最常用的ＣＯＳ－７细胞为靶，观察了影响转梁效率的多种因素，优化了转染条件。     

pp32表达引起人肝癌细胞HepG2形态改变

目的:研究pp32在肝癌细胞中的作用.方法:采用RT-PCR的方法钓取pp32全长基因.脂质体介导的方法将pp32基因导入HepG2细胞.观察细胞形态,血清依赖性和接触抑制等细胞表型,测量细胞生长曲线,检测ALP、LDH、γ- GT、ALB和AFP等生化指标.结果:成功钓取了pp32全长基因,筛选获得pp32稳定表达的HepG2细胞株.pp32表达使HepG2细胞伸出细长突起,但不影响HepG2细胞增殖.ALP和LDH酶活力升高,其他指标没有变化.结论:pp32表达引起人肝癌细胞HepG2形态改变,但不改变其恶性表型.     

人β－干扰素在杆状病毒载体与Sf细胞体系中的表达

采用苜蓿尺蠖核多角休病毒（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ中多角体蛋白基因启动子及其前后序列作为转移载体，将人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β基因插入转移载体ｐＵＡｃ－５，构建成ｐＡｃ－ＩＦＮ－β载体。该质粒ＤＮＡ与野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ经ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ共转染秋粘虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）传代细胞（Ｓｆ９细胞），利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征，进行病毒空斑筛选。用核酸杂交方法鉴定出携带ＨｕＩＦＮ－β基因的主组病毒。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞，可表达ｒＨｕＩＦＮ－β。在１．０×１０￣６细胞／ｍｌ感染上清中测定ｒＨｕＩＦＮ－β最高活性为３．０×１０￣６ＩＵ／ｍｌ，抗天然ＨｕＩＦＮ－β抗体能完全中和ｒＨｕＩＦＮ－β的抗病毒活性。     

人PD-1分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人PD—1分子的编码序列cDNA，将其重组进真核表达载体中，并表达于COS—7细胞。方法：从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人PD—l的编码cDNA序列，将其克隆进真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组表达载体。并测序证实。用脂质体法转染COS—7细胞，流式细胞仪检测PD—1分子的膜表达。结果：PCR方法扩增出—880bp左右的基因片段，插入pcDNA3．1( )载体后构建成重组表达质粒，经测序证实扩增的片段为人PD—l编码序列。将重组质粒转染COS—7细胞，流式细胞仪检测显示有21．10％的细胞表达人PD—1分子。结论：本研究为进一步研究PD—1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

变异胰岛素基因在HepG2细胞系中的表达

目的了解变异的胰岛素基因(insulin/furin)在HepG2细胞系中表达及活性胰岛素的产生情况。方法构建含有insulin/furin的表达质粒p(G1RE)3BP-11×furin并转染HepG2细胞,RT-PCR和放射免疫分析法从mRNA和蛋白质水平观察转染后HepG2细胞中insulin/furin的表达和胰岛素的产生情况。结果HindⅢ和EcoR V双酶切验证质粒p(G1RE)3BP-11×furin,切下260bp和4700bp两个片段,回收260bp片段测序证实为insulin/furin;RT-PCR检测转染后的HepG2细胞有insulin/furin的表达,DNA测序证实为insulin/furin;培养基中可检测到胰岛素。结论含insulin/furin的真核表达质粒p(G1RE)3BP-11×furin转染HepG2细胞,insulin/furin成功地在HepG2细胞中表达,并产生有生物活性的胰岛素。