环氧合酶2基因沉默诱导人肝癌细胞凋亡的作用观察

目的 观察作用于环氧合酶2(COX-2)mRNA的发卡状COX-2(COX-2 shRNA)真核表达质粒对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计靶向COX-2基因的RNA干扰序列,构建COX-2 shRNA表达载体,用阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染体外培养的HepG2细胞.半定量RT-PCR检测COX-2 mRNA表达水平的变化,筛选有效抑制COX-2基因表达的序列.采用CCK-8细胞计数法检测COX-2 shRNA对细胞增殖的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期,Western blotting检测细胞内COX-2和Bcl-2蛋白表达水平.结果 测序结果显示成功构建了2个表达COX-2shRNA的质粒载体,转染HepG2细胞后COX-2 mRNA表达下降至阴性对照组的41.66％和77.79％.选择沉默效率较佳者转染细胞并经G418筛选,获得稳定表达COX-2 shRNA的细胞,胞内COX-2 mRNA表达水平下降了75.30％,细胞增殖活性下降了 29.33％.在稳定表达COX-2 shRNA、错义序列以及未转染的细胞中,细胞凋亡率分别为17.83％、4.63％和4.47％,G0/G1期细胞比例分别为73.93％、61.2％和57.630％,而S期细胞比例分别为13.43％、26.03％和26.90％.Westernblotting检测显示,表达COX-2 shRNA的HepG2细胞内COX-2蛋白水平下降至表达错义序列组的31.25％(P＜0.01),Bcl-2蛋白水平下降至表达错义序列组的54.93％(P＜0.01),而转染错义质粒组与未转染组之间比较差异无统计学意义.结论 构建的真核表达载体pSilencer 2.1-U6-COX-2 shRNA能有效沉默人肝癌HepG2细胞内COX-2基因的表达,并具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和细胞周期阻滞、降低胞内抗凋亡蛋白(H)Bcl-2水平的作用.     

反义血管内皮生长因子C转染对人胃癌细胞SCC-7901成瘤性和脉管生成的影响

目的观察反义血管内皮生长因子C(antiVEGF-C)基因转染对人胃癌细胞系SGC-7901成瘤性和脉管生成的影响,探讨VEGF-C在脉管新生和胃癌转移中的作用。方法30只BALB/c裸鼠随机分为转染antiVEGF-C组、转染空白质粒组及未转染质粒组(n=10),采用皮下注射分别转染antiVEGF-C基因、转染空白质粒及未转染质粒的SGC-7901细胞悬液0.2ml(1×107/ml),每2d注射1次,连续3次,观察裸鼠皮下肿瘤的生成速度,并对肿瘤组织中的微淋巴管及微血管密度进行检测。结果转染antiVEGF-C组裸鼠肿瘤生长速度明显减慢且瘤体较小。注射后第1、2、3周,转染antiVEGF-C组肿瘤组织中微淋巴管密度分别为4.0±2.2、6.0±3.1、9.0±2.7每高倍视野(/HF),转染空白质粒组分别为6.0±8.7、9.0±3.5、18.0±7.2/HF,未转染质粒组分别为7.0±4.9、9.0±6.4、19.0±6.5/HF,转染antiVEGF-C组肿瘤组织中微血管密度分别为3.0±2.4、5.0±2.1、8.0±1.7/HF,转染空白质粒组分别为4.0±1.8、6.0±2.7、10.0±1...     

靶向肿瘤腺病毒介导IL-24抑制人胃癌细胞增殖

目的 探讨人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子特异驱动IL-24的重组腺病毒（Ad-phTERT-IL-24）对人胃癌SGC-7901细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 将Ad-phTERT-IL-24感染人胃癌SGC-7901细胞,采用荧光实时定量PCR及Western blot检测IL-24表达;采用CCK-8方法检测细胞生长曲线;采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 与以PBS代替病毒液处理的SGC-7901细胞相比,感染Ad-phTERT-IL-24的SGC-7901细胞内IL-24 表达明显升高（P＜0.01）,于第5、6 d吸光度明显下降（P＜0.05）,细胞侵袭能力亦显著降低（P＜0.05）.结论 Ad-phTERT-IL-24可有效上调人胃癌SGC-7901细胞IL-24表达,进而抑制细胞增殖及侵袭能力.     

shRNA抑制GC-C基因表达对人胃癌SGC-7901细胞生物学功能的影响

目的 研究靶向鸟苷酸环化酶C(GC-C)的短发夹RNA(shRNA)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能的影响.方法 构建针对人GC-C基因的shRNA真核表达载体,将其转染人人胃癌SGC-7901细胞,采用半定量RT-PCR和Westem blotting法检测细胞中GC-C在mRNA和蛋白水平的变化.以CCK-8法、流式细胞术和原位末端标记法检测转染GC-CshRNA真核表达载体的SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期等生物学指标的变化.结果 经DNA测序鉴定,所得到的表达载体插入片段序列与GenBank中的序列一致.shRNA-GC-C真核表达载体转染能有效抑制GC-C基因的表达,以shRNA-GC-CⅢ序列的抑制效果最佳.转染GC-C shRNA真核表达载体后SGC-7901细胞的增殖能力受到抑制(P<0.05);细胞形态发生改变,细胞体积缩小,核固缩,染色质浓缩聚集于核膜;流式细胞术检测显示G7峰前出现亚二倍体峰,转染48、72h后凋亡率分别为5.47%和5.63%(P<0.05).结论 靶向GC-C基因的shRNA可有效抑制人胃癌SGC-7901细胞生长,并促进细胞凋亡,该作用与下调靶基因GC-C的表达有关;GC-C可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

端粒植入对胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响

目的研究外源端粒片段植入对胃癌细胞生物学行为的影响，初步探讨端粒影响细胞生物学活性的作用机制。方法大规模制备含有端粒片段的质粒pSXneo-1．6-T2AG3，采用LipofectAMIN^TM2000介导的转染方式，将质粒转染胃癌细胞SGC-7901，检测细胞周期、细胞形态、细胞生长曲线和细胞周期相关基因表达的改变。结果端粒片段能够成功导入SGC-7901细胞，获得稳定的细胞株。端粒片段植入后细胞生长变慢，异型性减少，S期细胞减少，G0／G1和G2M期细胞比例增加，增殖指数减小，P21mRNA表达明显高于SGC-7901细胞（P〈0．05），caspase-3 mRNA在各组细胞的表达无显著差异（P〉0．05）。结论携带了1600bp端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSXneo-1．6-T2AG3能够稳定转染至人胃癌SGC-7901细胞中，使细胞增殖减慢，P21 mRNA表达上调，但对caspase-3 mRNA表达无明显影响。     

上调microRNA-150表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨上调microRNA- 150 (miR- 150)表达对肝癌SMMC7721细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 SMMC7721细胞分成miR-150感染组(加入pGIPZ-miR-150慢病毒表达载体)、阴性对照组(加入只含GFP的慢病毒载体)和空白对照组(不转染).采用荧光定量PCR检测miR-150的表达情况,Western blotting检测靶基因c-Myb蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 荧光定量PCR结果显示,转染miR-150pGIPZ后,SMMC7721细胞miR-150表达量(2.48±0.15)较阴性对照组(0.81±0.09)增加了2倍(p＜0.01).CCK-8法检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组比较,miR-150组的细胞增殖率显著降低(P＜0.05).Western blotting检测结果表明,miR-150组细胞c-Myb蛋白表达(0.31±0.07)与空白对照组(0.80±0.09)及阴性对照组(0.81±0.08)相比明显减少(P＜0.0l).流式细胞仪检测结果显示,miR-150组细胞凋亡率(19.36％±1.78％)与阴性对照组(5.12％±0.54％)及空白对照组(4.68％±0.35％)相比明显增加(P＜0.01).结论 上调miR-150表达可通过降低靶基因c-Myb的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,miR-150可能成为肝癌靶向治疗新的靶基因.     

TRIM33基因对人胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的影响及意义

目的 观察三结构域家族33(TRIM33)基因对人胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的影响及意义.方法 通过TCGA和TIMER数据库分析TRIM33在胃正常黏膜组织和胃癌组织中的表达及与临床病理特征、预后的关系.将人胃癌细胞SGC-7901分为阴性对照组(NC组)、对照组(空载体组)与转染组(si-TRIM33组),...     

沉默轴突导向蛋白4D对胃癌细胞SGC-7901生长、自噬及上皮-间质转化的影响

目的 探讨沉默轴突导向蛋白4D(Sema4D)对胃癌细胞SGC-7901生长、自噬及上皮-间质转化的影响.方法 将SGC-7901细胞随机分为对照组、shRNA-NC组、Sema4D-shRNA1组、Sema4D-shRNA2组与Sema4D-shRNA3组,构建shRNA Sema4D载体转染至SGC-7901细胞....     

miR-302a在胃癌中表达及其对胃癌细胞凋亡与细胞周期影响

目的研究微小RNA-302a(miRNA-302a)在胃癌标本中的表达水平与临床病理特征的关系,以及其对胃癌细胞的凋亡和细胞周期调控作用,以探讨将miR-302a用于胃癌生物靶向治疗的可能性。方法采用实时PCR(RT-PCR)方法检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中miR-302a的相对表达水平,并分析其与对应患者的临床病理资料的相关性。同时,采用RTPCR方法检测miR-302a在胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803和BGC-823及正常胃黏膜细胞GES-1中的表达情况;选取miR-302a表达水平最低者为癌细胞,并转染过表达miR-302a的真核重组质粒p CDNA3.1-miR-302a;转染后,采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法和PI单染法检测miR-302a对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果胃癌组织中miR-302a的相对表达水平显著低于癌旁正常胃癌黏膜组织(P<0.05),且其表达与临床分期、病理分级和转移均有密切关系(P<0.05)。同时,在胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC-823中miR-302a的相对表达水平显著低于正常细胞GES-1中的表达(P<0.05),且在BGC-823中表达水平最低。p CDNA3.1-miR-302a质粒转染组与空白组和p CDNA3.1质粒转染组比较,miR-302a质粒转染后48 h后细胞凋亡水平显著升高,且G2/M期细胞数显著增高(P<0.05)。结论在胃癌组织和细胞中miR-302a均呈现低水平表达,当miR-302a过表达后,能显著增高胃癌细胞的凋亡水平并使细胞出现G2/M期阻滞,可能成为胃癌治疗的新靶点。     

miR-29a抑制胃癌细胞内靶基因VEGF-A的表达及意义

目的 验证胃癌细胞株SGC-7901内miR-29a对靶基因VEGF-A的直接调控作用.方法 采用负载miR-29a的腺病毒载体（Ad-miR29a）感染人胃癌细胞株SGC-7901,上调SGC-7901细胞内miR-29a的表达丰度后,采用RT-qPCR及Western blot法分别检测SGC-7901细胞内VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达;进一步采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-29a是否通过结合在VEGF-A 3＇UTR而直接抑制靶基因表达.结果 与感染阴性对照Ad-LacZ的SGC-7901细胞相比,感染Ad-miR29a的SGC-7901细胞内VEGF-A蛋白表达下降（0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P＜0.01）,且VEGF-A mRNA水平亦下调（0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P＜0.05）;荧光素酶实验显示,与阴性对照相比,转染miR-29a mimic后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性明显下降（0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P＜0.05）;而在VEGF-A 3＇UTR与miR-29a的结合位点被突变之后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性得以恢复.结论 miR-29a通过结合于VEGF-A 3＇UTR相应位点,直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达.miR-29a可能成为胃癌基因治疗的有效靶标.     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

洛铂抑制胃癌SGC-7901细胞增殖及其机制的初步研究

目的观察洛铂对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法将对数生长期的SGC-7901细胞分阴性对照组（不加药物）和实验组（加入不同浓度洛铂）,采用倒置显微镜观察不同浓度下细胞生长状态;MTT法观察对细胞的增殖抑制;Western印迹方法分析不同浓度洛铂对SGC-7901细胞内Bcl-2蛋白表达水平的影响。结果倒置显微镜下观察,洛铂能抑制细胞增殖,出现明显的凋亡学形态特征。MTT法显示洛铂能抑制细胞增殖,并呈浓度及时间依赖关系。Western印迹结果显示洛铂能使SGC-7901细胞Bcl-2蛋白表达水平下降。结论洛铂能明显抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导凋亡,可能与调节SGC-7901细胞Bcl-2蛋白表达水平相关。     

胃腺癌CDC25A表达及青蒿琥酯干预的实验研究

目的 初步探讨细胞分裂周期素25A(CDC25A)与胃腺癌发生、发展的关系,以及青蒿琥酯对其的干预作用.方法 利用流式细胞术检测胃腺癌组织中CDC25A蛋白表达水平.细胞水平实验分为4组:对照组及30、60、120μmol/L青蒿琥酯组,即以不同浓度(30、60、120μmol/L)青蒿琥酯(Art)干预胃腺癌SGC-7901细胞24h,并以生理盐水代替药物作为对照组,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期及CDC25A蛋白表达水平.结果 胃腺癌组织中CDC25A蛋白表达水平(419.69±21.91)明显高于正常胃组织中的表达水平(316.11±24.23,P<0.01).30、60、120μmol/L青蒿琥酯组细胞凋亡率(分别为5.48%±0.67%、12.55%±1.17%、23.43%±2.18%)明显高于对照组(0.87%±0.14%,P<0.05),且具有Art剂量依赖性.30、60、120μmol/L青蒿琥酯组细胞增殖指数(分别为39.18%±0.53%、35.71%±0.99%、31.73%±1.02%)明显低于对照组(44.12%±2.51%,P<0.01);30、60、120μmol/L青蒿琥酯组细胞中CDC25A蛋白表达水平(分别为414.80±4.06、397.86±3.61、345.68±7.11)明显低于对照组(433.99±1.56,P<0.01).结论 CDC25A在胃腺癌组织中的高表达可能参与了胃腺癌的发生、发展,Art具有抑制胃腺癌SGC-7901的细胞生长作用,且可以下调细胞CDC25A的蛋白表达水平.     

回转器模拟失重对人胃癌SGC-7901细胞形态和生物学特征的影响

目的 探讨模拟失重对人胃癌SGC-7901细胞形态、增殖、周期和凋亡的影响.方法采用回转器模拟失重,用图像分析系统软件分析HE染色后SGC-7901细胞形态的改变,用免疫组化法观察细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化,用流式细胞仪测定细胞周期,并用TUNEL法检测细胞凋亡.结果 回转器模拟失重后,回转组SGC-7901细胞12 h、24 h、36 h、48 h及72 h各时间段的细胞面积均较对照组缩小（P＜0.01）;在36 h时,其长短径之比较对照组增大（P＜0.01）,其余时间段无明显差异.12 h、24 h和36 h回转组SGC-7901细胞PCNA抗体阳性细胞比率与对照组相比无明显差异,48 h、72 h回转组的PCNA抗体阳性细胞明显减少（P＜0.05或P＜0.01）.12 h、24 h和36 h回转组SGC-7901细胞的细胞周期与对照组相比无明显差异,48 h、72 h回转后G0＋G1期细胞显著增多（P＜0.01或P＜0.05）,S＋G2＋M期细胞则显著减少（P＜0.01或P＜0.05）.12 h、24 h、36 h和48 h回转组SGC-7901细胞凋亡比例与对照组相比无明显差异,72h回转组细胞凋亡比例较对照组明显增多（P＜0.01）.结论 回转器模拟失重使胃癌SGC-7901细胞的形态发生了变化,48 h、72 h时出现细胞周期阻滞、增殖抑制,72 h时凋亡增加.     

白花蛇舌草多糖诱导人胃癌细胞凋亡作用的研究

目的研究白花蛇舌草多糖对体外培养人胃癌7901细胞增殖抑制的影响及其作用机理。方法采用MTT法测定不同浓度白花蛇舌草多糖对人胃癌7901细胞增殖的影响;流式细胞技术检测药物作用后的细胞周期和凋亡率;RT-PCR方法检测药物对人胃癌7901细胞P53和Bcl-2基因表达的影响。结果白花蛇舌草多糖能明显抑制人胃癌7901细胞的增殖,其作用48 h的IC50约为116.52 mg·L-1;流式细胞检测显示40 mg·L-1白花蛇舌草多糖联合5.0 mg·L-1顺铂组总凋亡率为69.42%,明显优于顺铂组的50.85%（P〈0.01）和40 mg·L-1白花蛇舌草多糖组的26.41%（P〈0.01）;PCR结果显示高、中浓度白花蛇舌草多糖可使人胃癌7901细胞的bcl-2 mRNA表达量降低,P53 mRNA表达量增加。结论白花蛇舌草多糖能明显诱导人胃癌7901细胞的凋亡,与顺铂联合可产生协同作用,其作用机制可能与降低细胞bcl-2和增加P53基因表达量有关。