葛根素对支气管上皮细胞和中性粒细胞共培养体系VCAM-1表达的影响

目的探讨葛根素抑制支气管上皮细胞(BEAS-2B)与中性粒细胞(NEU)相互作用调控气道炎症反应的机制。方法应用流式细胞仪(FCM)检测BEAS-2B细胞和NEU细胞表面血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)的蛋白质合成;应用实时PCR方法检测上述细胞中VCAM-1的基因表达。结果 BEAS-2B细胞和NEU细胞共同培养组中BEAS-2B表面的VCAM-1平均荧光强度显著高于BEAS-2B单独培养组,共同培养组中NEU表面的VCAM-1平均荧光强度也显著高于NEU单独培养组。共同培养组中BEAS-2B细胞和NEU细胞各自VCAM-1基因表达水平均明显上调。不同浓度葛根素干预后BEAS-2B细胞和NEU细胞的VCAM-1基因表达显著下调,BEAS-2B细胞和NEU细胞表面VCAM-1蛋白质相应减少。结论葛根素可有效抑制BEAS-2B与NEU共同培养诱导的BEAS-2B细胞和NEU细胞中VCAM-1基因及降低其细胞表面蛋白质平均荧光强度。     

上皮细胞黏附分子与肝细胞癌的研究进展

癌症具有三大特征:基因组不稳定性,细胞行为改变,组织行为改变.这些特征决定了癌症的异质性、演进性、侵袭性、转移性和耐药性等威胁宿主生命的恶性表型.在临床工作中,癌症的生物标记分类对肿瘤的诊断和治疗具有重大意义,因此,确定肿瘤生物标记和治疗靶点是肿瘤个性化治疗的研究热点.     

葛根素对火药烟雾诱导支气管上皮细胞凋亡的防护作用

目的 探讨葛根素对火药烟雾诱导的支气管上皮细胞(BEAS-2B)凋亡的保护作用及其机制.方法 体外培养BEAS-2B细胞,随机分为对照组(不加任何干预)、烟熏组(火药烟雾4g,作用10min)、烟熏+葛根素组(12.5、25、50、100μg/ml).细胞接种12h后加入葛根素,继续培养至24h后烟雾作用10min,继续培养2h后进行检测.采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,流式细胞仪检测Annexin V-PI双染细胞及caspase-3阳性率.结果 与对照组相比,烟熏组BEAS-2B细胞活力明显下降(P＜0.01),不同浓度葛根素能够不同程度地对抗烟熏的作用,其最佳保护浓度为25μg/ml.与烟熏组相比,烟熏+葛根素组Hoechst染色细胞凋亡率、Annexin V-PI双染细胞凋亡率及caspase-3阳性率均明显降低(P＜0.05,P＜0.01).结论 火药烟雾可致体外BEAS-2B细胞凋亡,而葛根素对火药烟雾诱导的BEAS-2B气管上皮细胞凋亡具有一定防护作用.     

血透对尿毒症患者外周血中性粒细胞黏附分子表达的影响

 目的 观察血透时外周血中性粒细胞黏附分子(cell adhesion molecules, CAMs)CD62L、CD11a、CD11b、CD54表达的变化规律,以及不同透析膜对上述细胞黏附分子表达的影响.方法 实验分为血透组和健康对照组,同时血透组又分为铜仿膜组和聚砜膜组;流式细胞仪检测各组外周血中性粒细胞黏附分子CD62L、CD11a、CD11b、CD54的表达.结果 血透组中性粒细胞CD11b表达明显升高,CD62L和CD54表达明显降低;透析不久后,可见2透析组CD11b表达明显上调,CD62L和CD54表达下调.透析结束时CD11b、CD62L及CD54恢复透析前水平;CD11a变化不明显;铜仿膜组CD11b表达较聚砜膜组明显上调(P<0.05).结论 维持性血透可影响中性粒细胞的活性,使细胞表面黏附分子的表达发生规律变化,从而影响尿毒症患者的免疫力,可能增加了感染的机会.黏附分子表达与使用的透析膜的生物相容性相关.     

恒磁场对脂多糖诱导内皮细胞与中性粒细胞黏附及细胞间黏附分子表达影响的研究

目的研究恒磁场对脂多糖(LPS)诱导中性粒细胞与内皮细胞黏附及内皮细胞表达细胞间黏附分子的影响。方法人脐静脉内皮细胞于0·05、0·1、1mT的磁场中曝磁,用LPS刺激内皮细胞,内皮细胞与中性粒细胞黏附用细胞计数法评估,内皮细胞表面细胞间黏附分子表达用流式细胞仪及酶联免疫吸附法测定。结果LPS刺激后,中性粒细胞的黏附率为58%;0·05、0·1mT磁场条件下中性粒细胞黏附率下降为40%及38%,与单纯LPS组比较明显下降(P<0·05),而1mT组中性粒细胞黏附率为65%,与单纯LPS组相近。单纯LPS组细胞间黏附分子表达为10·34±0·33/0·89±0·16;0·05、0·1mT磁场条件下细胞黏附分子表达为6·61±0·17/0·53±0·18、6·98±0·15/0·46±0·10,与单纯LPS组比较明显下降(P<0·05);1mT组为10·99±0·41/0·78±0·15,与单纯LPS组比较无明显差异。结论0·05、0·1mT可以抑制LPS刺激下内皮细胞与中性粒细胞的黏附及内皮细胞表面细胞间黏附分子的表达。     

p38 MAPK对嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞共培养时细胞因子释放的调控作用

目的 了解嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞相互作用诱导细胞因子释放的p38 MAPK信号转导通路.方法 用CD16磁珠抗体分离外周血中嗜酸性粒细胞,以嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞(BEAS-2B)接触共培养为实验模型,观察SB 203580对细胞培养上清液中细胞因子浓度的影响.细胞因子浓度采用ELISA和流式细胞微珠方法测定.结果 SB 203580能够有效抑制BEAS-2B细胞释放IL-6、IL-8(P＜0.05)和嗜酸性粒细胞释放IL-8(P＜0.01).SB 203580对嗜酸性粒细胞与BEAS-2B细胞接触共培养诱导的IL-6、IL-8和IP-10释放具有显著抑制作用(P＜0.001).结论 嗜酸性粒细胞、BEAS-2B细胞单独或相互作用时均通过p38 MAPK信号转导通路释放细胞因子.     

人外周血白细胞黏附分子的辐射效应研究

目的 研究外周血白细胞表面黏附分子的表达及其介导的细胞黏附能力变化与辐射剂量的关系。方法 人外周血细胞经不同剂量照射后不同时间用流式细胞仪双色标记分析不同白细胞表面不同黏附分子表达,特异底物包被微孔板法和结晶紫染色分析检测单核细胞对不同底物的黏附能力。结果 单核细胞表面CD11b和粒细胞表面CD29表达下降与辐射剂量间存在良好量效关系,照射后单核细胞对底物β1-整合素和胶原蛋白I的黏附能力改变与辐射剂量存在一定量效关系。结论 外周血白细胞表面黏附分子表达及功能改变展现出的与辐射剂量间的良好关系,为进一步深入研究将其作为评估生物受照剂量指标的可能打下基础。     

葛根素对火药烟雾致支气管上皮细胞损伤的防护效应

目的 研究火药烟雾损伤支气管上皮细胞模型中炎性细胞因子IL-8和IL-6的变化,以及葛根素对上述损伤的防护作用.方法 用不同浓度(100、50、25、12.5μg/ml)的葛根素预处理细胞后,建立火药烟雾损伤支气管上皮细胞(BEAS-2B)模型.采用MTT法检测火药烟雾对细胞存活率的影响,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-8和IL-6的浓度.结果 以正常对照组细胞存活率作为100％,火药烟雾刺激后,BEAS-2B细胞的存活率下降至48.53％±4.44％,加入葛根素后细胞存活率明显提高,且呈剂量依赖性;细胞培养上清液中IL-8(P＜0.05)、IL-6(P＜0.01)浓度升高.加入葛根素后,IL-8、IL-6浓度逐渐下降(P＜0.05),亦呈浓度依赖性.结论 火药烟雾可致体外培养支气管上皮细胞存活率降低并促进炎性细胞因子IL-8和IL-6分泌,中药葛根素可逆转这种损伤效应.     

低强度氦氖激光对小鼠骨髓基质细胞黏附分子表达的影响

目的研究低强度氦氖(He-Ne)激光照射对小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)表面细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞间黏附分-子1(VCAM-1)表达的影响。方法 30只小鼠随机分为3组:对照组(A组),2.75J/cm2激光组(B组),4.20J/cm2激光组(C组),每组10只。激光组建立低强度He-Ne激光体外照射小鼠模型,对照组不作任何处理。分离小鼠BMSCs,并进行原代、传代培养。采用倒置相差显微镜、光镜及透射电镜对BMSCs形态进行观察;采用流式细胞术检测低强度He-Ne激光照射对小鼠BMSCs表面VCAM-1和ICAM-1蛋白表达的影响。结果倒置显微镜和光镜观察到BMSCs呈贴壁生长,细胞呈梭形或不规则,有突起;电镜观察到细胞内粗面内质网、分泌小泡、线粒体等细胞器丰富。激光组BMSCs增殖加快,达到80%细胞融合时间短。2.75J/cm2激光组和4.20J/cm2激光组均能增加小鼠BMSCs表面VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达。其中,4.20J/cm2激光组较2.75J/cm2激光组作用更明显(P<0.01)。结论低强度He-Ne激光能促进小鼠BMSCs表面VCAM-1和ICAM-1蛋白的表达。     

当归注射液对辐射损伤小鼠骨髓细胞黏附分子表达及增殖周期的影响

目的探讨当归注射液对辐射损伤小鼠骨髓有核细胞黏附分子表达及增殖周期的影响。方法BALB/c小鼠随机分为3组:正常组、照射组和当归注射液预防组。正常组:即未经照射组。照射组:于照射前3d起给予10ml·kg-1·d-1无菌生理盐水腹腔注射。当归注射液预防组:于照射前3d起给予腹腔注射当归注射液2·5g·kg-1·d-1。于照射后第7天断颈处死小鼠,取出股骨,计数骨髓单个核细胞。经流式细胞仪分别检测骨髓单个核细胞黏附分子CD49d和CD49e及G0/G1期细胞百分率和周期蛋白D2表达水平。结果与正常组比较,照射组造血细胞明显减少,骨髓有核细胞黏附分子CD49d和CD49e表达明显下降,G0/G1期细胞百分率明显增加,而细胞周期蛋白D2表达水平明显降低,当归注射液预防组能增加骨髓单个核细胞计数,明显提高细胞黏附分子CD49d和CD49e的表达,降低G0/G1期细胞百分率,提高细胞周期蛋白D2的表达水平。结论当归注射液能通过提高细胞黏附分子表达水平,刺激细胞周期蛋白D2的表达促进造血细胞的增殖。     

人气道上皮细胞的体外原代培养研究

目的 探索简单有效的人原代气道上皮细胞培养方法 .方法 以人肺叶或肺段支气管为取材对象,用蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法分离肺叶或肺段支气管上皮细胞,并与蛋白酶ⅩⅣ消化 机械剥离法、胰酶消化 机械刮刷法比较分离的细胞数、纯度及成活率,同时比较含必需营养因子的DMEM/F12无血清培养与有血清培养时的细胞纯度及成活率.角蛋白AE1/AE3免疫组化鉴定培养的细胞.结果 蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法组分离的细胞数为(9.37±1.62)×105,而蛋白酶ⅩⅣ消化 机械剥离法组为(5.20±0.75)×105,二者比较差异显著(P＜0.01);蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法组分离的细胞成活率及纯度均高于胰酶消化 机械刮刷法组(94.3% vs 85.7%,92.5% vs 83.0%,P＜0.05);无血清培养的成活率及纯度均高于有血清培养(90.7% vs 82.1%,95.5%vs 83.0%,P＜0.01);培养的细胞角蛋白AE1/AE3染色阳性.结论 蛋白酶ⅩⅣ消化 机械刮刷法分离肺叶或肺段支气管上皮细胞,并用含营养因子的DMEM/F12无血清培养是一种简单有效的人原代气道上皮细胞培养方法 .     

嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞中p38 MAPK信号转导通路的活化作用观察

目的探讨嗜酸性粒细胞在与支气管上皮细胞接触共培养过程中对后者炎性介质释放的影响。方法用CD16抗体磁珠法分离嗜酸性粒细胞,免疫印迹(Western blotting)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管上皮细胞中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、激活转录因子(ATF)-2蛋白含量,微珠免疫沉淀结合免疫印迹法检测p38MAPK活性。结果经与嗜酸性粒细胞共同培养活化后,支气管上皮细胞中磷酸化p38MAPK蛋白含量及其活性均显著上升,p38MAPK信号转导通路链中下级底物蛋白质ATF-2(细胞内调控某些基因表达的转录因子)量也显著上升;多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞同样可以活化支气管上皮细胞,增加其细胞内p38MAPK蛋白质磷酸化。p38MAPK酶选择性抑制剂SB203580可有效抑制p38MAPK诱导其底物ATF-2磷酸化。结论嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞接触共培养过程中对炎性介质表达和释放的调控作用可能是通过活化支气管上皮细胞内p38MAPK信号传导通路未实现的。     

PM2．5通过诱导AP-1活化介导支气管上皮细胞中VEGF的诱导表达和炎症反应

目的：探讨细颗粒物（particulate matter 2．5, PM2．5）可否通过诱导转录因子激活蛋白1（AP-1）活化介导支气管上皮细胞（bronchial epithelial cell, Beas-2B）中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的诱导表达及炎症反应。方法体外培养Beas-2B细胞,采用双荧光素酶报告基因法检测细胞中AP-1的诱导活化水平和VEGF基因启动子的转录活化水平;Western印迹法检测AP-1的2个组成亚基c-Jun、ATF2的诱导活化水平及VEGF的蛋白表达水平。结果 PM2．5可显著上调Beas-2B细胞中转录因子AP-1的转录激活活性;同时诱导AP-1组成亚基c-Jun和ATF2活化。 Beas-2B细胞中转染c-Jun或ATF2 siRNA后,可抑制AP-1的转录激活活性,同时VEGF的转录活化和蛋白表达也显著下调。结论 PM2．5通过活化AP-1可诱导支气管上皮细胞中VEGF表达及炎症反应。     

骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞的可能性.方法 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.75只受体大鼠随机分为5组(n＝15):肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组、单个核细胞对照组和正常对照组.分别于MSCs、单个核细胞注入受体大鼠体内1、2、4周后观察肺组织结构变化,检测肺组织中植入细胞情况及广谱细胞角蛋白的表达水平.结果 MSCs治疗组大鼠肺组织在各时间点均有少量植入的细胞,并且部分植入的细胞表达广谱细胞角蛋白.MSCs植入后2周大鼠细支气管壁有少量植入的细胞同时表达广谱细胞角蛋白.其余各组未发现植入细胞的标记.结论 MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞.     

人羊膜不同位置上皮细胞的类胚胎干细胞性质差异研究

目的了解足月人羊膜上皮不同位置上皮细胞在类胚胎干细胞性质方面的异质性。方法分层消化收集人羊膜上皮近表层与近基底层细胞,运用流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学等方法观察测定其干细胞表面抗原及分子标记物Nanog、Oct4、Sox2、SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、CD73的表达情况;同时将足月人羊膜全层及经胰酶消化去上皮后的人羊膜行组织学染色,测定SSEA3、TRA1-60、TRA1-81表达情况。结果人羊膜上皮近基底层细胞表达Nanog、Oct4、Sox2、SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81普遍高于近表层细胞;表达SSEA4最强、最显著的细胞主要为较小的近圆形细胞,分布于羊膜上皮近基底层处。结论人羊膜上皮不同位置细胞的干细胞特性不同,近基底层细胞比近表层细胞具有更强的类胚胎干细胞性质,因而有望成为临床干细胞的来源。     

巨噬细胞条件培养基对人视网膜色素上皮细胞活性和增殖的影响

 目的探讨激活的巨噬细胞和未激活的巨噬细胞刘视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial,RPE)细胞活性和增殖的影响.方法制备脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)激活的和未激活的人腹腔巨噬细胞条件培养基(MψCM),取3种不同的浓度,分别施加于纯化培养的胎眼RPE细胞,作用24、48、72 h,用MTT比色法测定RPE细胞的OD值.结果LPS激活的MψCM(L-MψCM)和未激活的MψCM(N-MψCM)取不同浓度作用不同时间后均能不同程度地促进RPE细胞的活性和增殖,其中L-MψCM的作用明显强于N-MψCM.结论MψCM中含有促RPE细胞增殖的因子,可能L-MψCM中的促增殖因子在质和量上优于N-MψCM.     

α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNA甲基化的变化

目的 分析α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNA甲基化谱的变化.方法 分别提取α粒子诱发永生化人支气管上皮恶性转化细胞BERP35T4和对照细胞BEP2D的基因组DNA,用非甲基化敏感酶MseI对基因组DNA进行酶切,然后在酶解后的片段两端连接上连接臂,再用甲基化敏感内切酶进行消化,最终消化产物进行PCR扩增和荧光标记,最后与甲基化芯片进行杂交.杂交结果进行扫描,并对芯片图像进行分析,对芯片上的数据进行归一化处理,最后以差异倍数为1.5的标准来确定差异表达基因.结果 α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化后,有16个基因发生了甲基化的改变,其中,甲基化上调基因有9个,下调基因7个.鞘氨酸激酶SKIP,蛋白质磷酸酶PPP3CC,蛋白激酶MAP2K6,杀伤细胞免疫球蛋白受体KIR2DLI、KIR2DL4、KIR3DP1,锌指蛋白ZNF493、ZNF100,转录因子NKX2-5、TFAP2D、DR1,钾离子通道KCNJ16,肉瘤抗原CCDC18,以及甘油甲酸酯结合蛋白FNBP1L、同源异形蛋白IRX4、HSF蛋白片段EPB41L3、TCP10蛋白等都发生了甲基化改变.结论 证实了电离辐射能够通过改变细胞的表观遗传修饰而在肿瘤发生中发挥一定的作用.

Abstract：

Objective To identify the changes of DNA methylation profile in the process of malignant transformation of BEP2D cell induced by α particles.Methods The genomic DNAs were isolated from the malignant transformation BERP35T4 cells and immortalized human bronchial epithelial cell line BEP2D.Genomic DNAs were digested by MseI and ligated of PCR linkers.Methylated DNAs were digested by BstUI and amplified by PCR.The methylated DNA probes were prepared by labeling with Cy3 and Cy5 fluorescence dyes individually and hybridized to the methylation CpG-Island microarray.The hybridization results were scanned and analyzed.Intensity values were quality controlled and normalized.The normalized data were used to identify the differentially expressed genes based on a 1.5 fold difference of the expression level.Results There were 16 genes which showed changes of methylation level in malignant transformation BERP35T4 cells, 9 of them were hypermethylation and 7 were hypomethylation.These genes were including the SKIP gene, PPP3CC gene, MAP2K6 gene, KIR2DL1 gene, KIR2DL4 gene, KIR3DP1 gene, ZNF493 gene, ZNF100 gene, NKX2-5 gene, TFAP2D gene, DR1 gene, KCNJ16 gene, CCDC18 gene, FNBP1L gene, IRX4 gene, EPB41L3 gene, TCP10 gene and so on.Conclusions The DNA methylation might have effects on ionizing radiation drived tumorigenesis.