考尼伐坦抑制精氨酸血管加压素诱导的心脏成纤维细胞增殖及胶原表达

目的 探讨大鼠心脏成纤维细胞(CFs)经精氨酸血管加压素(AVP)及其受体拮抗剂考尼伐坦(CON)干预后,细胞的增殖和细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的变化.方法 采用胶原酶Ⅱ消化法、差速贴壁法、差速脱壁法获取并纯化CFs,应用CCK-8活细胞计数试剂盒检测细胞活性,RT-PCR方法检测细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1 A1)和Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1) mRNA的变化,Western blot法检测COL1A1、COL3A1蛋白表达的变化.结果 干预培养的CFs 24 h后,10-7 mol/LAVP可显著促进CFs细胞增殖(P＜0.01),而10-7 mol/L CON可显著抑制这一作用(P＜0.01).干预培养的CFs 12 h后,10-7moL/L AVP可诱导CFs COL1A1、COL3A1 mRNA表达显著增加,同时蛋白表达亦显著增加,而10-7 mol/L的CON可抑制这些作用.结论 AVP可促进CFs的细胞增殖和COL1A1、COL3A1 mRNA和蛋白表达,而CON可部分抑制这种作用.     

血小板反应蛋白1在转化生长因子β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞中的作用

目的:观察血小板反应蛋白1(TSP-1)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠心肌成纤维细胞中的作用.方法:差速贴壁法分离新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌成纤维细胞(CFs).MTT法测CFs生长,羟脯氨酸法测CFs胶原含量,RT-PCR法测TSP-1mRNA表达.结果:TGF-β1诱导CFs TSP-l的表达呈浓度一时间依赖性增加(P<0.01).TGF-β1(20ug/L)作用下24 h可诱导CFs增殖和胶原合成(P<0.01).TSP-l反义寡核苷酸作用后的CFs的MTTA值、胶原含量减少(P<0.01).结论:TGF-β1可诱导新生大鼠CFs TSP-1表达,TSP-1反义寡核苷酸对TGF-β1诱导大鼠CFs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用,TSP-1在TGF-β1诱导大鼠心肌纤维化中可能具有重要的作用.     

醛固酮对肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物1基因表达的影响

目的:探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物l(PAI-1)基因表达的影响.方法:(1)以不同浓度的ALD(10-11、10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L)刺激肾小球系膜细胞72 h后,用半定量RT-PCR法检测该细胞中PAI-1 mRNA的表达.(2)以10-7 mol/L的ALD刺激肾小球系膜细胞不同时间(12、24、48、72 h)后,用半定量RT-PCR法检测该细胞中PAI-1 mRNA的表达.结果:半定量RT-PCR结果显示,ALD促进培养的大鼠肾小球系膜细胞PAI-1mRNA的表达,且具有浓度依赖性和时间依赖性的特点.结论:ALD促进大鼠肾小球系膜细胞PAI-1 mRNA的表达,从而抑制细胞外基质的降解,促进肾小球疾病进展.     

醛固酮对3T3-L1前脂肪细胞与脂肪细胞内脂素表达和分泌的影响

目的:探讨醛固酮对3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞内脂素基因表达和蛋白分泌的影响。方法:10-8和10-6mol/L醛固酮加或不加10-6mol/L安体舒通分别干预3T3-L1前脂肪细胞和脂肪细胞24h和48h,用实时RT-PCR测定内脂素和盐皮质激素受体(MR)mRNA的表达,酶联免疫法测定培养液中内脂素的浓度。结果:醛固酮作用于3T3-L1前脂肪细胞,内脂素mRNA表达减少,培养液中蛋白浓度变化不明显,MR mRNA表达增高。醛固酮作用于脂肪细胞,内脂素mRNA表达和蛋白浓度均降低,MR mRNA表达增高。安体舒通在一定程度上可对抗醛固酮对内脂素的抑制作用。结论:醛固酮抑制3T3-L1脂肪细胞内脂素的基因表达和分泌。     

醛固酮降低新生大鼠心肌成纤维细胞iNOS表达和NO含量

目的为探讨醛固酮诱导心肌成纤维细胞(CFs)增殖及其对诱导型一氧化氮合酶 一氧化氮(iNOS NO)系统活性的影响。方法用胰酶消化法分离、培养新生SD大鼠CFs,采用MTT比色法、硝酸还原酶法、分光光度法和半定量RT PCR技术,观察不同浓度醛固酮对CFs的增殖、NO含量、iNOS活性和iNOSmRNA表达的影响。结果醛固酮(10 -11～10 -7mol/L)能剂量依赖性促进CFs的增殖,降低CFs的NO含量、iNOS活性及iNOSmRNA的表达(均P <0 .0 5 ) ,且螺内酯能逆转醛固酮的上述作用。醛固酮干预下CFs增殖数目与NO含量和iNOS活性呈显著负相关(r分别为- 0 . 94 2、- 0 . 978,均P <0 . 0 1)。结论醛固酮能剂量依赖性降低CFs的iNOS -NO系统活性,促进CFs增殖;螺内酯能逆转此作用。     

腺苷促进人脐静脉内皮细胞bFGF的表达

目的：探讨腺苷对人脐静脉内皮细胞合成和分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白及bFGF mRNA的影响。 方法： 免疫组化法检测bFGF蛋白质表达；逆转录-聚合酶链反应测定bFGF mRNA。 结果： 对照组（腺苷0 mol/L）bFGF染色阳性细胞少，染色程度轻；10-4mol/L、10-6 mol/L腺苷组作用48 h后阳性细胞多，染色深，平均吸光度值与对照组比较有显著差异(P<0.05)，10-8mol/L、10-10mol/L腺苷组与对照组比较无显著差异(P>0.05)；RT-PCR分析显示10-4mol/L、10-6mol/L腺苷组bFGF mRNA表达显著高于对照组(P<0.05)；10-8mol/L腺苷组与对照组bFGF mRNA表达无显著差异(P>0.05)。 结论： 腺苷可能部分通过促进内皮细胞合成和表达bFGF而实现其促进内皮细胞生长和血管新生的作用。     

Ghrelin促进大鼠胰岛素合成及高葡萄糖诱导的胰岛素分泌

Ghrelin是由胃黏膜分泌的小分子脑肠肽。本研究探讨了Ghrelin对于大鼠胰岛细胞合成与分泌胰岛素的影响。将分离培养的大鼠胰岛分为Ghrelin处理组和对照组 :(1)在高浓度葡萄糖 (16 7mmol L)刺激时加入不同浓度Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 8mol L孵育 6 0min ,测定胰岛素分泌量。 (2 )在培养液中加入不同浓度Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 8mol L预处理 2 4h后 ,用RT PCR方法检测胰岛内前胰岛素原mRNA表达 ,并测定不同浓度葡萄糖 (5 6mmol L ,16 7mmol L)刺激时胰岛素分泌量。离体大鼠胰岛 ,在高糖刺激时加入Ghrelin 10 - 1 1 ～ 10 - 1 0 mol L共同培养 6 0min ,胰岛素分泌量增加高于对照组 (P <0 0 5 )。Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 1 0 mol L预处理 2 4h后 ,高糖刺激时胰岛素分泌量增加高于对照组 (P <0 0 5 ) ,同时Ghrelin 10 - 1 0 mol L促进胰岛内前胰岛素原mRNA表达高于对照组 (P <0 0 5 )。一定浓度的Ghrelin促进胰岛在高葡萄糖诱导下的胰岛素分泌 ,经Ghrelin预处理 2 4h后该作用更为显著。Ghrelin增加大鼠胰岛内前胰岛素原mRNA的表达 ,促进胰岛素合成。     

血小板反应蛋白1在转化生长因子β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞中的作用

目的：观察血小板反应蛋白1（TSP-1）在转化生长因子β₁(TGF-β₁)诱导大鼠心肌成纤维细胞中的作用。方法: 差速贴壁法分离新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心肌成纤维细胞(CFs)。MTT法测CFs生长,羟脯氨酸法测CFs胶原含量,RT-PCR 法测TSP-1mRNA表达。结果: TGF-β₁诱导CFs TSP-1的表达呈浓度-时间依赖性增加(P<0.01)。TGF-β₁（20 μg/L）作用下24 h可诱导CFs增殖和胶原合成(P<0.01)。TSP-1反义寡核苷酸作用后的CFs的MTT A值、胶原含量减少(P<0.01)。结论: TGF-β₁可诱导新生大鼠CFs TSP-1表达,TSP-1反义寡核苷酸对TGF-β1诱导大鼠CFs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用,TSP-1在TGF-β₁诱导大鼠心肌纤维化中可能具有重要的作用。     

氟伐他汀对醛固酮诱导的系膜细胞SGK1及CTGF表达的影响

目的:观察氟伐他汀对醛固酮(Ald)诱导的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)血清与糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK1)和结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法:以大鼠系膜细胞为实验对象,分为:(1)对照组;(2)不同浓度及时间Ald组;(3)Ald(10-7mol/L)+SPI(安体舒通10-9mol/L)组;(4)Ald(10-7mol/L)+LY294002(PI3K抑制剂20μmol/L)组;(5)Ald(10-7mol/L)+SB203580(P38MAPK抑制剂20μmol/L);(6)Ald(10-7mol/L)+F(氟伐他汀10-7、10-6、10-5mol/L)组;(7)Ald(10-7mol/L)+F(氟伐他汀10-5mol/L)+MVA(甲羟戊酸10-4mol/L)组;(8)Ald(10-7mol/L)+F(氟伐他汀10-5mol/L)+FPP(法尼酯焦磷酸10-5mol/L)组;(9)Ald(10-7mol/L)+F(氟伐他汀10-5mol/L)+GGPP(焦磷酸牛儿基牛儿酯10-5mol/L)组。Western印迹方法检测SGK1、CTGF蛋白表达水平。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养液中细胞外基质成分纤维连接蛋白(FN)、单核细胞趋化因子(MCP-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白含量。结果:Ald呈剂量依赖性上调SGK1和CTGF蛋白表达(P0.05)。醛固酮刺激6h即可增加SGK1蛋白表达(P0.05),12h达高峰,CTGF蛋白水平呈时间依赖性增加。安体舒通和PI3K特异性抑制剂LY294002可阻断Ald对SGK1的激活作用(P0.01)。氟伐他汀可呈剂量依赖性下调Ald诱导的系膜细胞内SGK1和CTGF蛋白表达,以及其下游趋化因子MCP-1和ICAM-1表达(P0.05)。甲羟戊酸和GGPP可逆转氟伐他汀的作用(P0.05)。结论:醛固酮可通过抑制盐皮质激素受体(MR)和PI3K信号转导通路诱导大鼠系膜细胞内SGK1和CTGF蛋白的表达,氟伐他汀可通过SGK1信号转导通路缓解Ald的致纤维化作用。甲羟戊酸可部分逆转氟伐他汀的作用,可能与甲羟戊酸通路中的Rho蛋白活化有关。     

醛固酮对大鼠心脏成纤维细胞内皮素A型受体表达的影响

醛固酮(aldosterone,Aid)能促进心脏成纤维细胞(cardi-ac fibroblasts,CFs)合成和分泌内皮素[1],通过与内皮素A型受体(endothelin subtype A receptor,ET-AR)结合对心肌纤维化起重要作用.但Ald干预下CFs ET-AR表达的变化及其机制尚不清楚.本实验观察Ald对CFs ET-AR mRNA和蛋白表达的调控作用,阐述Ald在心脏局部的作用.     

阿司匹林抑制内皮素-1诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖

目的 探讨阿司匹林（Aspirin）对内皮素-1(ET-1)诱导的大鼠心脏成纤维细胞（CFs）增殖的干预作用及可能机制。方法 经差速贴壁法培养的新生大鼠CFs,随机分为7组：对照组、ET-1组、阿司匹林组、ET-1+ 阿司匹林1、2、5和10 mmol·L-1组。用四氮唑盐（MTT）法测定CFs数目,流式细胞仪检测CFs细胞周期,液体闪烁计数仪测定CFs 3H-脯氨酸掺入率,硝酸还原酶法测定细胞培养上清液中NO含量。结果 与对照组相比,10-7 mol·L-1 ET-1能显著促CFs增值及[3H]-Proline掺入率,降低CFs生成NO2-/NO3-的量（均P < 0.01）,1～10 mmol·L-1 阿司匹林呈浓度依赖性的缓解上述变化（均P < 0.05）; ET-1能显著提高S期细胞百分率（P < 0.01）,10 mmol·L-1 阿司匹林抑制ET-1诱导S期细胞百分率上升（P < 0.01）。结论 阿司匹林抑制ET-1诱导的CFs增殖及胶原合成可能和NO生成有关。     

Effects of aldosterone on synthesis of fibronectin and expression of transforming growth factor-beta1 mRNA in cultured rat mesangial cells]

AIM: To evaluate the effect of aldosterone (ALD) and spironolactone (SPI, one of the aldosterone receptor antagonists) on synthesis and secretion of fibronectin (FN) and expression of transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) mRNA in cultured rat mesangial cells. METHODS: (1) Mesangial cells were treated with medium containing different concentrations of ALD (10(-11), 10(-9), 10(-7) mol/L) and/or 10(-7) mol/L SPI for 48 h, while control cells were treated with vehicle only. The levels of FN in the supernatants were measured by ELISA method. The expressions of FN mRNA and TGF-beta1 mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. (2) Mesangial cells were treated with 10(-9) mol/L ALD for 24, 48, 72 h. The levels of FN in the supernatants were measured by ELISA method. The expressions of FN mRNA and TGF-beta1 mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR. RESULTS: ELISA method showed that the level of FN in the supernatant of cultured rat mesangial cells stimulated with ALD increased significantly in a dose- and time-dependent manner. Also the expressions of FN mRNA and TGF-beta1 mRNA were increased significantly by ALD in a dose- and time-dependent manner by semi-quantitative RT-PCR. SPI inhibited the stimulating effect of ALD on synthesis of FN and expressions of FN mRNA and TGF-beta1 mRNA in cultured rat mesangial cells. CONCLUSION: ALD up-regulates the protein synthesis and mRNA expression of FN, and up-regulates the mRNA expression of TGF-beta1 in cultured rat mesangial cells. SPI inhibits the effect of ALD, and thus implication in the treatment of Glomerulosclerosis.     

非诺贝特对血管内皮细胞凝血酶诱导的内皮素-1表达的影响

目的:大量研究表明氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)具有抗炎、抗动脉粥样硬化及扩张血管作用,本研究观察PPARα激动剂非诺贝特对牛主动脉内皮细胞(BAECs)ET-1表达的影响。方法: 制备5-10代BAECs,用凝血酶及不同浓度非诺贝特(10、50、100和500 μmol/L)处理。采用放射免疫方法测定ET-1含量,用RT-PCR法测定ET-1 mRNA表达。结果: 凝血酶明显增加ET-1分泌(22.4±4.7 vs 对照13.2±1.6) nmol/g蛋白质,P<0.01,非诺贝特(100 μmol/L)对基础ET-1分泌无影响。但以剂量依赖的方式抑制凝血酶诱导的ET-1分泌(22.3±4.3、18.5±2.8、13.4±2.7 和11.7±1.6) nmol/g蛋白质,与对照组的(25.6±3.7) nmol/g蛋白质比较,均P<0.01。PT-PCR显示凝血酶明显增加ET-1 mRNA表达,此作用可为非诺贝特(100μmol/L)所抑制。结论: PPARα激动剂非诺贝特抑制BAECs凝血酶诱导的ET-1分泌及ET-1 mRNA水平,提示非诺贝特对凝血酶诱导的ET-1表达的作用发生在转录水平。     

醛固酮对肾小球系膜细胞上血管紧张素Ⅱ受体表达的影响

目的：研究醛固酮(ALD)对高糖状态下大鼠肾小球系膜细胞（RMCs）上血管紧张素Ⅱ1a、1b 和 2 型受体(AT-1aR、 AT-1bR 和 AT-2R)表达的影响及意义。方法:以不同浓度的 ALD (10-8-10-6 mol/L)或 10-7 mol/L 螺内酯(醛固酮受体拮抗剂,SPI)或 10-7 mol/L 氯沙坦（血管紧张素Ⅱ 1 型受体拮抗剂,Los）或10-9 mol/L PD123319(血管紧张素Ⅱ 2 型受体拮抗剂,PD)刺激高糖(30 mmol)状态下培养的 RMCs, MTT 法检测 RMCs 的增殖,半定量 RT-PCR 法检测细胞上 AT-1aR、AT-1bR 和 AT-2R mRNA 的表达,ELISA法检测单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达。结果: ALD(10-8-10-6 mol/ L)刺激高糖状态下 RMCs 12 h 后, AT-1aR、AT-1bR 和 AT-2R mRNA 表达显著上调,分别为高糖对照组的 1.62-1.77倍、9.61-9.89倍、7.26-7.35倍（P<0.01）。 ALD 受体拮抗剂 SPI 能拮抗 ALD 上调 AT-1aR、 AT-1bR 表达的作用;而 AT-2R mRNA 表达轻度增加（P<0.05）。ALD 刺激高糖状态下 RMCs 12 h 后 AT-1aR/AT-1bR 显著下降（P<0.01）,SPI 能拮抗 ALD的这种作用。ALD 刺激高糖状态下RMCs 12 h 后,MCP-1表达增加（P<0.01）,SPI/Los/PD 能拮抗 ALD 的作用。结论: ALD 能通过上调高糖状态下 RMCs 上 AT-1aR、 AT-1bR 和 AT-2R 基因表达, 改变 AT-1R 亚型的比例,诱导 MCP-1 过度表达,参与炎症反应。     

Resveratrol inhibits the intracellular calcium increase and angiotensin/endothelin system activation induced by soluble uric acid in mesangial cells

Resveratrol (Resv) is natural polyphenol found in grapes. This study evaluated the protective effect of Resv against the effects of uric acid (UA) in immortalized human mesangial cells (ihMCs). ihMCs were preincubated with Resv (12.5 µM) for 1 h and treated with UA (10 mg/dL) for 6 or 12 h. The intracellular calcium concentration [Ca²⁺]i was quantified by fluorescence using flow cytometry. Angiotensinogen (AGT) and pre-pro endothelin-1 (ppET-1) mRNA were assayed by quantitative real-time RT-PCR. Angiotensin II (AII) and endothelin-1 (ET-1) were assayed by ELISA. UA significantly increased [Ca²⁺]i. Pre-incubation with Resv significantly reduced the change in [Ca²⁺]i induced by UA. Incubation with UA for 6 or 12 h also increased AGT mRNA expression and AII protein synthesis. Resv blunted these increases in AGT mRNA expression and AII protein. Incubation with UA in the ihMCs increased ppET-1 expression and ET-1 protein synthesis at 6 and 12 h. When ihMCs were pre-incubated with Resv, UA had a significantly diminished effect on ppET-1 mRNA expression and ET-1 protein synthesis at 6 and 12 h, respectively. Our results suggested that UA triggers reactions including AII and ET-1 production in mesangial cells. The renin-angiotensin system may contribute to the pathogenesis of renal function and chronic kidney disease. Resv can minimize the impact of UA on AII, ET-1 and the increase of [Ca²⁺]i in mesangial cells, suggesting that, at least in part, Resv can prevent the effects of soluble UA in mesangial cells.     

半边莲生物碱抑制内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：探讨半边莲生物碱(LCLA)对内皮素-1（ET-1）诱导人脐动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的抑制效应及其作用机制。 方法： 采用细胞计数、［3H］-TdR掺入、流式细胞术、免疫细胞化学染色及Fura-3/AM 荧光探针标记方法检测VSMC增殖；并用台盼蓝拒染、乳酸脱氢酶（LDH）检测方法观察LCLA对VSMC的毒性反应。 结果： LCLA(100、200和400 mg/L)、BQ-123(10-6mol/L)、ST(10-7mol/L)均抑制ET-1所诱导的VSMC增殖（均P＜0.05）：明显降低VSMC的细胞数目、［3H］-TdR掺入量、S期和G2/M期的数目百分比，增加G0/G1期的数目百分比；减弱细胞内增殖细胞核抗原（PCNA）的表达强度和Ca2+荧光强度；LCLA的抑制作用存在明显的剂量依赖关系，但对VSMC存活率和LDH释放量均没有影响。 结论： LCLA浓度依赖性地抑制ET-1所诱导的人脐动脉VSMC增殖，其机制与降低VSMC内Ca2+含量有关。     

Ang-(1-7)与Mas结合促进NIT细胞分泌胰岛素

目的体外研究Ang-(1-7)对NIT细胞胰岛素分泌的影响及其潜在机制。方法将NIT细胞在不同浓度Ang-(1-7)(10-8～10-3mol/L)培养24 h,ELISA法检测NIT细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能。用RT-PCR法,从NIT细胞中扩增Mas、GLUT-2和TGF-β1基因的全长cDNA序列。将NIT细胞在10-5mol/L Ang-(1-7)条件下培养48 h,QRT-PCR方法检测NIT细胞Mas、GLUT-2及TGF-β1的mRNA表达,Western印迹方法测定NIT细胞Mas、GLUT-2及TGF-β1的蛋白表达。结果 NIT细胞系随着细胞外Ang-(1-7)浓度(10-8～10-3mol/L)的增加胰岛素分泌增加,10-5mol/L Ang-(1-7)组胰岛素分泌量为(8.86±0.53)mIU/L,显著高于对照组(8.06±0.39)mIU/L(P<0.05)。与对照组相比,经10-5mol/L Ang-(1-7)预处理的NIT细胞Mas及GLUT-2的mRNA和蛋白表达上调(P<0.05);相反,经10-5mol/L Ang-(1-7)预处理的NIT细胞TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论Ang-(1-7)与Mas结合能够促进NIT细胞分泌胰岛素,这可能与提高NIT细胞摄取葡萄糖的能力、抑制纤维化进程等相关。