hTERT基因永生化人毛乳头细胞系的转化特征

目的 探讨hTERT基因永生化人毛乳头细胞系是否具有转化特征.方法 采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养.应用RT-PCR 法检测 hTERT mRNA 的表达.采用细胞形态学观察、染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验分析转染细胞是否具有转化特征.结果 转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,现已连续传至50代.检测证实转染细胞稳定表达hTERT mRNA,细胞形态与未转染细胞基本相同,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性.结论 hTERT基因永生化人毛乳头细胞系基本上是正常细胞而无明显转化特征.     

东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的 建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料.方法 运用脂质体介导的基因转染法将pSV3 neo质粒导入第3代东方田鼠胚胎成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆并扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测细胞株中SV40T基因的整合,RT-PCR鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达;绘制东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞生长曲线.结果 阳性细胞克隆已扩大培养并稳定传代50代,经鉴定SV40T抗原已整合到东方田鼠胚胎成纤维细胞中且稳定表达.结论 成功建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系.     

HSF1基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化

目的：建立HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维永生化细胞系，为HSF1的功能研究提供实验模型。方法：用脂质体介导的基因转染法将pSV3neo质粒导入HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养，建立永生化细胞系；用PCR检测两种细胞株中目的基因的整合，用RT—PCR法鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达；用Western blot检测所建细胞株的诱导型热休克蛋白70的表达情况。结果：有3个细胞克隆已扩大培养稳定传代达6个月，经鉴定SV40T抗原已整合到两种细胞中且稳定表达，HSF1^-/-胚胎成纤维细胞热休克蛋白70的诱导表达消失。结论：成功建立永生化HSF1^-/-，HSF1^＋/＋两种基因型小鼠胚胎成纤维细胞。     

可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox的构建与表达

目的 探讨以hTERT作为永生化基因、嘌呤霉素乙酰转移酶基因puro作为筛选基因、加强型绿色荧光蛋白EGFP作为报道基因、loxP作为重组位点构建可回复性永生化逆转录病毒载体。为建立可回复性永生化细胞株奠定基础。方法 用NheⅠ酶切线性化pBABE-puro产生两个相同的黏端，与loxP双链混合连接构建成载体pBABE—puro—lox；用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切下逆转录病毒载体pBABE—hTEKT-puro上约3．5kb hTERT基因片段，插入pBABE-puro—lox载体的相应酶切位点之间，重组的新载体称为phTERTPlox；扩增出无终止密码子的EGFP基因片段并插入phTERTPlox，正确构建的载体命名为phTERTGPlox。转染包装细胞PT67并用嘌呤霉素选择培养，在荧光显微镜下观察绿色荧光细胞，免疫组化染色检测hTERT基因的表达。结果 EcoRⅠ和NheⅠ双酶切鉴定phTERTGPlox形成4．0kb和5.3kb两个片段，转染PT67细胞荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光细胞，免疫组化染色结果显示稳定转染的细胞胞核呈阳性染色。结论 成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体phTERTGPlox。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子，并观察hTERT启动子调控下tk／GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物，以HepG2基因组DNA为模板，用PCR方法扩增hTERT启动子；分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体：将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后。通过RT—PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况；用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp～ 40bp的核心启动子。RT-PCR和B-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达．hTERT启动子调控的tk／GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞，表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

SV40T基因介导的永生化对细胞生物学特性的影响

目的研究SV40 T基因对其诱导的永生化细胞系细胞表型的影响。方法以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料,进行体外培养。将永生化基因———SV40 T抗原基因转染第10代细胞,经筛选,抗性克隆扩大培养,得到永生化细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等,研究转染与未转染细胞的生物学特性,通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)在相同条件下检测转染与未转染细胞对顺铂、阿霉素、足叶乙甙、拓扑替康四种化疗药物的敏感性。结果建立人卵巢肉瘤样癌细胞系,命名为BUPH:OVSC-1。经SV40 T抗原基因转染,建立人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系,命名为BUPH:OVSC-2,两者均已长期稳定传代。通过比较,两者的生物学特性无明显差别,对不同化疗药物的敏感性无明显差别。结论SV40 T基因永生化的细胞保留了原细胞的分化表型,SV40介导的永生化细胞系可作为体外研究的模型。     

转导人端粒酶逆转录酶基因致人成骨细胞永生化的研究

目的建立永生化的人成骨细胞系供骨科临床和基础研究使用。方法将人骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞,以逆转录病毒为载体,导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)全长cDNA,经筛选得到阳性克隆,体外连续传代,检测hTERT基因的整合情况及其表达,并对不同代次细胞的成骨特性进行了检测。结果成功地将hTERT基因转入人成骨细胞,得到的转化细胞端粒酶表达阳性,增殖旺盛,至今已传至62代,对第25、第55代转化细胞分别进行碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥素的检测,证明此永生化细胞保持了良好的成骨特性。结论转导外源性的hTERT基因可以导致人成骨细胞永生化且可保持其正常的成骨特性。     

人端粒酶逆转录酶基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2活性的影响

目的：观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转染U2OS细胞对其基质金属蛋白酶2(MMP-2)的影响,探讨hTERT基因与端粒酶的关系及端粒酶活性在肿瘤浸润和转移中的作用。方法：利用重组质粒PCI-Neo-hTERT转染人骨肉瘤细胞系U2OS,选取转染的2个阳性克隆株进行实验,同时以未转染的U2OS细胞为对照。通过RT-PCR和TRAP-ELISA法检测阳性克隆株hTERT基因的转染效果,明胶酶谱法和RT-PCR检测转染hTERT基因对细胞MMP-2的表达和活性的影响。结果：与对照组比较,2个阳性克隆株可见特异性hTERT表达,并表现出明显的端粒酶活性状态（ΔA>0.2　U）。阳性克隆株MMP-2 mRNA的表达无明显改变（P>0.05）,而酶原型MMP-2减少（P<0.01）。结论：hTERT稳定转染克隆U2OS细胞株中异位表达hTERT可以产生端粒酶活性,而且端粒酶活性的出现,可能通过调节MMP的分泌影响细胞外基质成分的降解和构建而对肿瘤的浸润和转移产生一定影响。     

hTERT转染神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA检测

目的以逆转录病毒PLXSN为载体,将hTERT基因转染入体外培养的人神经干细胞,检测神经干细胞端粒酶活性及hTERT mRNA表达情况,为建立永生化神经干细胞系提供一种新的思路.方法体外扩增人神经干细胞及基因转染后,应用PCR-ELISA法检测神经干细胞端粒酶活性,荧光定量PCR法检测hTERT mRNA表达情况.结果通过逆转录病毒介导的hTERT基因转染人神经干细胞后,端粒酶活性明显升高,持续表达,hTERT mRNA也早期呈高水平表达,但继之下降,维持在一个较低水平.结论转染hTERT基因后的神经干细胞具有表达高水平端粒酶活性,并稳定表达,这为建立基因工程的永生化神经干细胞系奠定了基础.而hTERT mRNA则逐渐下降,并维持在一个较低水平,不能作为检测神经干细胞增殖和分化能力的指标.     

Bcl-2和p53基因对永生化软骨细胞端粒酶活性影响的实验研究

目的：探讨原癌基因bcl-2 和肿瘤抑制基因p53调节永生化细胞端活性的机理。方法：兔髁突软骨细胞通过真核表达载体转梁人端粒酶催化亚基hTERT，经G418筛选，挑选阳性克隆培养，使用原位杂交和荧光TRAP检测转染细胞bcl-2和p53 Mrn水平和端粒酶活性。结果：未转染的细胞无端粒酶活性；100代转染后的软骨细胞端粒粒酶活性明显高于未转染细胞；同时 bcl-2 mRNA和p53 mRNA水平有所降低， bcl-2 mRNA水平明显低于未转染hTERT和端粒阴酶软骨细胞。结论 bcl-2和p53参与了细胞永生化过程中端粒酶活性的调节。     

正常大肠干细胞的条件永生化

目的:建立正常人大肠干细胞系.方法:用中性蛋白酶分级分离法从人胚肠中分离正常大肠干细胞,以含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒感染,对其进行永生化;然后,对建立的正常大肠干细胞系进行生物学特性鉴定.结果:用中性蛋白酶分级消化获得的AKP活性阴性的细胞群生长呈多角形.该细胞群转染含端粒酶逆转录酶和SV40大T抗原的重组逆转录病毒后8～12周出现上皮样细胞克隆,经细胞特性鉴定:PAS染色黏蛋白阳性,上皮细胞角蛋白pan、CK-8、CK-19均阳性;用ELISA-PCR法检测该细胞第12代和第43代端粒酶活性,分别为0.43、0.83;用Western blot法检测发现该细胞系表达端粒酶和SV40大T抗原;用RT-PCR检测示该细胞株表达Musashi-1 mRNA;以1×106细胞数接种裸鼠,观察4个月无肿瘤形成,软琼脂克隆试验培养无转化细胞克隆出现.结论:建立的正常的大肠干细胞系具有干细胞特征,可作为体外研究致癌剂/促癌剂作用机制的较理想实验靶点.     

榄香烯乳对胃癌细胞人端粒酶反转录酶及其启动子的影响

目的：观察榄香烯乳对胃癌细胞株SGC7901人端粒酶反转录酶（hTERT）表达及其启动子的影响,以深入了解榄香烯乳的抗癌机制。方法：以榄香烯乳处理胃癌细胞,分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平的表达。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中,2h后加入不同浓度的榄香烯乳,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：榄香烯乳处理后,胃癌SGC7901细胞hTERT mRNA和蛋白水平呈浓度和时间依赖性下调。榄香烯乳处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：榄香烯乳可能通过下调hTERT启动子活性,抑制hTERT表达,从而抑制胃癌细胞端粒酶活性。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

hTERT siRNA表达载体的构建及对转染的HeLa细胞生长抑制作用

目的:通过RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达,探讨干涉后对肿瘤细胞生长的抑制作用. 方法:根据人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA编码序列,设计RNA干涉靶点,构建siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并转染HeLa细胞,通过RT-PCR法观察重组质粒转染肿瘤细胞后端粒酶mRNA、蛋白含量及细胞生长情况. 结果:构建的siRNA表达载体可以使HeLa细胞端粒酶逆转录酶mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度减慢. 结论:成功构建了针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中端粒酶的表达,并引起细胞生长抑制.     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

人脐动脉平滑肌细胞体外培养的生物学特性及其永生株的初步建立

目的 建立人脐动脉血管平滑肌细胞（HUASMC）原代．传代培养的最佳方法，并初步建立其永生株。方法 采用人脐动脉血管中膜组织块贴壁法原代培养，比较不同培养养基对原代及传代细胞增殖的影响；选择标记为新霉素（G418）的带有端粒酶催化亚基（hTERT)基因的重组质粒导入人脐动脉血管平滑肌细胞。结果 经α肌动蛋白鉴定，组织块贴壁洒可获得高纯度的HUASMC。原代培养的HUASMC1－4代细胞增殖能力强，生长旺盛，此后细胞的增殖逐渐降低，到第10代几乎丧失增殖力。原代培养以MCDB131为最佳培养基。hTERT转染细胞克隆由长梭形变为短梭形，接触抑制消失，生长速度快，目前已传至20代，增殖能力与第1代无差别。转染前后平滑肌特异的α－肌动蛋白表达阳性。结论 hTERT转染的HUASMC保留了HUASMC的基本生物学特征，能保持较强的增殖能力持续传代。