周期型马来丝虫副肌球蛋白基因真核表达重组质粒构建

【提要】 提取周期型马来丝虫总RNA。跟据已知的马来丝虫副肌球蛋白（BmPmy）基因序列，设计合成引物，并引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点，应用RT?鄄PCR技术，扩增BmPmy基因片段，克隆至载体pGEM?鄄T中，经PCR和双酶切鉴定后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1（+），成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（+）-BmPmy，并转染COS-7细胞后进行RT-PCR分析。转染的COS-7细胞高水平表达周期型马来丝虫副肌球蛋白mRNA，结果与预期相符。     

周期型马来丝虫CPI基因真核表达载体的构建和免疫学研究

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因真核表达载体pcDNA3.1-BmCPI,并观察其在小鼠体内的免疫应答反应。方法以周期型马来丝虫总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段。与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-BmCPI表达载体。将48只小鼠随机分为4组,每组12只,分别为健康对照组、空质粒组、pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组,分别注射PBS 100μl、空质粒pcDNA3.1 100μg、重组质粒pcDNA3.1-BmCPI100μg和重组质粒pcDNA3.1-BmCPI 100μg+佐剂CpG 30μg,采用左后腿胫前肌注射免疫。每2周1次,共3次,于末次免疫后第4周,用RT-PCR方法检测小鼠注射部位肌肉组织内目的基因转录情况。于末次免疫后第4和第6周,用噻唑蓝(MTT)法检测小鼠T淋巴细胞刺激增殖水平。于末次免疫后第2、4和6周,用ELISA法检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)水平。结果成功构建了...     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析

目的在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70(HSP70)基因,并对表达产物进行SDS-PAGE分析。方法以重组质粒pGEM-T-HSP70为模板,根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物,用PCR法扩增HSP70基因(包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2 198 bp),PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中,构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导GST．Tag融合蛋白的表达,经SDS-PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pGEX-4T-3-HSP70全长约7 200 bp,经双酶切后应得到长度为4 968 bp的载体和2 198 bp的目的基因2个片段,1%琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符。HSP70相对分子质量(Mr)为70×10~3,质粒pGEX-4T-3的融合部分(GST．Tag)表达产物的Mr约为26×10~3,将重组质粒转化BL-21 (DE3)菌,经IPTG诱导表达,菌体蛋白的SDS-PAGE图谱显示,诱导组出现特异性蛋白表达条带,其Mr约100×10~3,与预计大小相同。目的蛋白占菌体总蛋白的12%左右。结论成功地构建了重组原核表达载体pGEX-4T- 3-HSP70：周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达,为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础。     

周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂复合基因真核重组质粒的构建与表达

目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氰酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂(GAPDH/CPI)复合基因真核重组表达质粒,为研制复合多价疫苗奠定基础.方法 依据GenBank中BmGAPDH及BmCPI基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克降后,克隆至载体pGEM-T Easy中.取阳性重组质粒pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI以及真核重组表达载体分别双酶切,将酶切后的载体和目的 片段进行连接,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI.将复合基因重组质粒瞬时转染人HeLa细胞后,进行RT-PCR验证,将表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析和鉴定.结果 分别克隆了pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI重组质粒,经酶切鉴定分别得到877、621 bp特异性片段,与预期值吻合.成功构建了复合基因重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI,酶切鉴定所产生的片段大小与预期吻合.复合基因真核重组表达质粒转染HeLa细胞后得到高水平表达,SDS-PAGE分析显示重组蛋白相对分子质量(Mr)约为54×103.结论 成功构建了周期型马来丝虫GAPDH/CPI复合基因重组表达质粒,并在哺乳动物细胞内得到正确表达.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression plasmid containing glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and cysteine protease inhibitor ( CPI ) gene from periodic Brugia malayi (Bm) and to lay foundation for studying multivalent vaccines. Methods Total RNA was extracted from periodic Bin. The BmGAPDH and BmCPI genes were amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned and then subeloned into eukaryotic recombinant plasmid vector pcDNA3.1 (+). pcDNA3.1 (+)/BmGAPDH/BmCPI was constructed. The recombinant plasmids were screened and identified by digestion with restriction enzyme and PCR amplification, and were transformed into HeLa cell subsequently. The transient expression of BmGAPDH and BmCPI were examined by RT-PCR. The expressed protein was identified by sodium dodeeylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). Results Two specific bands of around 877 bp of BmGAPDH and 621 bp of BmCPI were amplified, consistent with the expected value. The same bands were obtained by double restriction enzyme digestion of recombinant plasmids or PCR using recombinant plasmid as template. BmGAPDH and BmCPI mRNA were highly expressed in transfeeted HeLa cell. The relative molecular mass (Mr) of the recombinant protein was about 54 × 103. Conclusion The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+)/BmGAPDH/BmCPI has been constructed successfully and the protein is expressed correctly in mammalian cell.     

周期型马来丝虫染色体的研究

采用空气干燥法对周期型马来丝虫染色体进行了研究,结果显示卵原细胞分裂中期相有4对小型的常染色体和1对大型的性染色体,精原细胞分裂中期相有4对小型的常染色体和1个大型的与1个中型的性染色体,终变期的卵母细胞有5个二价的染色体,次级精母细胞有5个单价染色体.以及受精卵分裂中期相有10个染色体。表明该虫染色体数为2n=10,性别决定机制为XY-XX型。     

含弓形虫复合抗原基因的真核表达质粒在哺乳动物细胞中的表达

目的 研究弓形虫复合抗原真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2/B在哺乳动物细胞中的表达情况。方法利用脂质体介导的转染技术，将真核表达质粒pcDNA3．1-P30-P22-CTXA2／B和空载体pcDNA3．1分别转染Hela细胞，400μg／ml G418加压筛选和200gg／ml G418维持筛选，获得稳定转染的Hela细胞。采用SDS-PAGE和Western-blot方法对复合基因P30P22-CTXA2／B的表达产物进行鉴定。结果SDS-PAGE结果显示，重组质粒转染Hela细胞后的表达产物分子质量单位为64ku，Western blot显示此蛋白条带能被抗P30抗体识别。结论构建的真核表达质粒pcDNA3，1-P30-P22-CTXA2／B能在哺乳动物细胞中成功表达插入基因所编码的融合蛋白，为进一步动物实验提供了实验依据。     

浙江省周期型马来丝虫等位基因酶谱研究

目的:研究浙江省周期型马来丝虫等位基因酶谱。方法:用微量平面淀粉凝胶电泳法,检测浙江省周期型马来丝虫成虫180 条(雌60,雄120),微丝蚴0.4 m l(约32 000 条)及感染期幼虫约1 500条的Acph 等14 种酶的同工酶的等位基因酶谱。结果:浙江省周期型马来丝虫的3 个生活期虫体呈现13 种酶的同工酶的27个等位基因位点,多数位点为纯合子型,仅2 个位点(MPI,MDH-2)为杂合子型(占7.4% )。成虫、微丝蚴及感染期幼虫分别呈现16、16 及9 个等位基因位点。同时用相同的方法对实验室传代的周期型马来丝虫等位基因酶谱进行比较检测。结论:浙江省与实验室传代的周期型马来丝虫的同工酶等位基因酶谱基本相似     

细胞毒作用对周期型马来丝虫微丝蚴化学元素含量的影响

目的　通过观察细胞毒作用对周期型马来丝虫微丝蚴 (mf)化学元素含量的影响 ,进一步探讨宿主体内杀伤虫体的机制。方法　应用原子吸收光谱分析法对细胞毒作用前后的周期型马来丝虫mf7种微量元素和 2种常量元素的含量进行检测分析。结果　所测的周期型马来丝虫mf7种微量元素中铁 (Fe)含量最高 ;镉 (Cd)含量最低。常量元素钙 (Ca)高于镁(Mg)。经细胞毒作用后虫体各微量元素和常量元素含量均有所下降 ,尤其是微量元素中的铁 (Fe)、铜 (Cu)、锰 (Mn)、铬 (Cr)、镉 (Cd)铝 (Al)和常量元素中的镁 (Mg)下降显著 (P <0 0 1 )。结论　经细胞毒作用后虫体内的微量元素和常量元素大量丢失 ,造成其营养代谢和生理功能的障碍 ,可能是宿主体内杀伤丝虫mf,导致虫体死亡的因素之一     

马来丝虫幼虫经细胞毒作用后氨基酸的变化

目的观察马来丝虫微丝蚴(mf)经细胞毒作用后氨基酸含量的变化,进一步探讨宿主体内杀虫机制.方法应用高速氨基酸分析仪对细胞毒作用前后的周期型马来丝虫mf进行氨基酸组成及含量的分析比较.结果马来丝虫mf含17种氨基酸,缺少色氨酸.经宿主细胞毒作用后的虫体氨基酸绝对含量明显低于细胞毒作用前(P＜0.05).其中,精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸下降显著(P＜0.01).结论氨基酸含量下降,尤其是碱性氨基酸与酸性氨基酸、芳香族氨基酸之间比率下降可能是宿主体内杀伤丝虫mf的后果之一.     

周期型马来丝虫CPI基因克隆和序列分析及编码产物B细胞表位预测

目的 克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因,并通过序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测,为进一步研究该基因的功能奠定基础.方法 从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增BmCPI基因,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-TBmCPI,经测序验证,并进行同源性比较.应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测.结果 RTPCR扩增出一条约621 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.其编码产物经表位预测分析,B细胞表位可能在23～32、50～79、117～126位氨基酸区域.结论 成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组质粒pGEM-T克隆载体,并进行了序列测定及编码产物的B细胞表位预测,达到预期目标,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

Genetic association of murine susceptibility to Brugia malayi microfilaraemia

Summary The influence of host genetics on susceptibility of mice to Brugia malayi microfilariae and its possible mechanism were studied. There was a strain-association for duration and peak level of microfilaraemia: CBA/CaJ, C3H/HeJ, DBA/1J, AuSs/J and A.Sw/Snhad a short duration (3–5 days) and low parasitemia (19–26 parasites/100 /il blood) compared to C57Br/cdJ, AKR/J, C57BL/6J, 129/J, BALB/cJ, DBA/2J, B10.D2/NSn, B10.D2/OSn and SJL/J(duration of 58–73 days, peak parasitaemia of 58–74 parasites/100 μl blood). Relative resistance to microfilariae was not related to the H-2 complex as determined in studies of congenic C3H.B10 (H-2^b) and B10.H-2^k mice and their background strains. This trait was inherited in a dominant fashion and involved a single or small number of genes. Serum anti-microfilarial antibodies reached highest levels in strains with a long duration compared to those with a short duration of parasitaemia (geometric mean titres of 1:13450 vs 1:284). The distribution of ^5lCr-labelled microfilariae among the livers, spleens, lungs and kidneys of a resistant (CBA/CaJ) and a susceptible (C57BL/6J) strain was similar. Transfer of immune lymphoid cells or sera between histocompatible (H-2^k) resistant CBA/CaJmice and susceptible C57Br/cdJ animals did not alter the duration of microfilaraemia.