不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外培养及鉴定

背景：不同年龄段神经干细胞的增殖及分化特性目前未见报道。 目的：观察不同年龄段大鼠脊髓源性神经干细胞的体外分离、培养及鉴定。 方法：取不同年龄大鼠的脊髓,制成单细胞悬液,用含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和B27的DMEM/F12培养基,以细胞浓度5.0×105 L-1进行原代培养,每隔3 d传代1次。 结果与结论：不同年龄段大鼠的脊髓中均可培养出细胞,其形态为结构紧密、大小不等的悬浮细胞球,称之为“神经干细胞球”;经过传代后单细胞又迅速增殖成球且数目明显增多。提示不同年龄段大鼠脊髓中均能够在体外培养出神经细胞球。     

大鼠脊髓神经干细胞的鉴定及光镜和电镜观察

本研究应用无血清培养技术对分离的大鼠胚胎脊髓神经干细胞进行体外培养,在倒置显微镜和电镜下观察细胞形态,应用BrdU标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况。免疫荧光显示nestin、MAP2、GFAP以及BrdU/nestin、BrdU/MAP2、Br-dU/GFAP均有阳性表达,说明从大鼠胚胎脊髓可成功分离出神经干细胞,它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原。脊髓神经干细胞具有自我更新能力,能分化为神经元和星型胶质细胞。     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定和诱导分化

近年研究发现,哺乳动物无论在胚胎发育期还是在成年,其中枢神经系统内都存在具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞,这一发现为神经损伤修复的研究提供了一条新思路。分离培养神经干细胞,并在体外稳定的增殖与分化,为研究神经干细胞的增殖、分化特性、干细胞移植以及建立细胞系等,提供了细胞来源和保证。本研究利用胎鼠和乳鼠的大脑皮层和海马,用含EGFP和bFGF的NSC培养基培养、分离了具有自我增殖和多向分化潜能的神经干细胞,并观察其生长、增殖和分化特点,以期为神经干细胞的基础研究奠定基础。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的研究人胚胎神经干细胞的培养条件及体外分化情况。方法将新鲜分离的胚胎(自然流产胎儿4~6周,经志愿者知情同意)无菌条件下取海马,采用无血清培养基进行培养,原代培养的细胞增殖成神经干细胞球,倒置显微镜观察细胞的形态学,并用免疫荧光方法对神经干细胞进行自我更新能力(Brd U)的鉴定及特异性抗原Nestin的检测。结果培养5~7d的神经干细胞球呈桑葚样悬浮生长,呈明显的Brd U阳性反应,其具有增殖能力;神经干细胞表达了Nestin抗原阳性。结论人胚胎神经干细胞具有神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

新生大鼠神经干细胞球体外生长传代及分化鉴定

近年来，有关神经干细胞分离培养和研究已经成为神经生物学研究的热点。已有许多研究小组报道了大鼠、小鼠和人胚胎脑组织神经干细胞的分离和培养方法，但对新生大鼠的脑组织神经干细胞进行分离传代培养则鲜有报道。由于神经干细胞可作为一种移植手段治疗神经系统各种病变和损伤，还可用于研究不同生长因子对神经干细胞的体外发育的影响，其有着广泛的应用前景。因此，我们实验室利用新生当天大鼠大脑皮质和中脑进行神经干细胞的分离培养取得成功，现报道如下。     

新生大鼠神经干细胞的培养方法

神经干细胞研究是目前神经科学研究的热点 ,如何快速经济地培养出神经干细胞是每个研究者必须面对的问题。目前多数研究者采用胎鼠脑组织作为神经干细胞的组织来源 ,培养方法是加入EGF、bFGF的DMEM/F12无血清培养基。我们在进行新生大鼠神经干细胞分离和培养的过程中 ,发现应用无血清培养基 ,培养神经干细胞的速度较慢 ,数量也较少 ,需要较长周期才能达到研究要求。为此我们采用乳鼠为神经干细胞的组织来源 ,应用DMEM/F12 /N2为基础培养基 ,在此基础上添加不同成份 ,观察神经干细胞的生长情况。确定最佳的培养方法。1　材料1 1　Wis…     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与观察

目的 建立神经干细胞的分离，培养及分化鉴定技术；观察神经干细胞生长，增殖及分化的特点，方法 分离新生SD大鼠脑室下区的组织，经消化及机械吹打后，采用原代贴壁及传代悬浮的方法，培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，结果 从新生SD大鼠脑室下区分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具增殖的能力，原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性，分化后的细胞可表达神经元，星形角质细胞和少突角质细胞的特异性抗原。结论 用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分化

目的:研究正常大鼠脊髓发育过程中神经干细胞的分化规律。方法:应用免疫荧光染色技术,检测Nestin、NeuN、MAP2、GFAP、CNPase阳性细胞在大鼠胚胎期及生后脊髓内的分布及变化情况。结果:胚胎发育早期,脊髓中央管、灰质、白质均可检测到Nestin阳性细胞,生后Nestin阳性细胞数量逐渐减少。大鼠脊髓神经元的发生呈现明显的背腹模式,孕14d(E14)脊髓内可检测到NeuN阳性细胞,E16 NeuN阳性细胞逐渐增多,腹侧NeuN阳性细胞核体积较大,分布较稀疏,背侧神经元细胞核体积较小,分布较密集。MAP2染色结果与NeuN一致。胶质细胞的分化、成熟在生后初期进行,P4可检测到GFAP及CNPase阳性细胞,主要分布于脊髓白质内,P30在脊髓灰质内可检测到GFAP阳性细胞,细胞分支较多且短。结论:正常大鼠脊髓发育中神经干细胞的分化呈现一定规律性,向神经元方向化较早且呈明显的背腹模式,胶质细胞的分化较晚。     

大鼠骨骼肌植块诱导脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞的分化

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经于细胞进行体外培养,探讨骨骼肌植块诱导其向运动神经元样细胞分化.方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况;通过与骨骼肌植块共培养观察神经干细胞向运动神经无样细胞的分化情况.结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示.骨骼肌植块组有7.87%的细胞呈胆碱乙酰基转移酶阳性.与10%胎牛血清组(0.94%)比较具有统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,骨骼肌植块可诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

维甲酸、音猬因子对大鼠脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞分化的影响

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经干细胞进行体外培养,探讨维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导其向运动神经元样细胞分化. 方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光显色检测细胞增殖、分化情况;培养液分组添加Shh、 RA或Shh+RA,观察神经干细胞向运动神经元样细胞的分化情况. 结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示Shh组未检测到胆碱乙酰转移酶阳性细胞,RA组为20.63%, Shh+RA组为66.84%,其差异具统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,Shh、 RA可不同程度地诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

大鼠脊髓祖细胞的分离与体外培养

采用bFGF、EGF及神经元无血清培养基分离培养大鼠脊髓祖细胞，并对脊髓祖细胞进行了分化和电生理实验。脊髓祖细胞可增生分化成神经元和胶质细胞，并具有电流特性。有希望应用于脊髓创伤的治疗。     

补阳还五汤联合神经干细胞移植促进脊髓损伤髓鞘再生

目的:探讨补阳还五汤(BYHWD)灌胃联合神经干细胞(NSCs)移植对脊髓损伤(SCI)后髓鞘再生的影响.方法:将48只成年雌性SD大鼠随机分为脊髓损伤(SCI)组、BYHWD灌胃组、NSCs移植组、NSCs移植联合BYHWD灌胃(BYHWD+ NSCs)组.SCI组不做治疗;NSCs组于脊髓横断后局部移植NSCs; BYHWD+ NSCs组移植NSCs,并每天BYHWD灌胃;各组在损伤后14、28 d后分别留取损伤脊髓标本,用免疫荧光双标法检测髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达情况,透射电镜观察脊髓白质内髓鞘超微结构变化.结果:BYHWD+ NSCs组MBP阳性表达最多,较其他3组差异有统计学意义.电镜下BYHWD+NSCs组髓鞘结构较为规整,轴突微丝、微管排列有序,线粒体结构完整,可见薄髓的再生髓鞘.结论:SCI后BYHWD灌胃联合NSCs移植能够促进损伤脊髓MBP的表达及脱髓的轴突再髓鞘化.     

神经干细胞在治疗实验性脊髓损伤中的应用进展

20世纪90年代初首次体外分离神经干细胞(NSC)获得成功,给脊髓损伤(SCI)的治疗带来了新的希望。在大量应用NSC治疗实验性SCI的研究中,对于NSC的应用主要有三种方法:①单纯的NSC移植;②以NSC为载体的转基因治疗;③NSC联合生物材料的应用。研究取得了可喜的成就,但同时也存在一些尚未解决的问题。试从上述三个方面对应用NSC治疗实验性SCI研究的近期进展及所存在的一些问题加以综述。     

神经干细胞移植对小鼠脊髓损伤的影响

目的观察神经干细胞(NSCs)移植对脊髓损伤(SCI)小鼠功能恢复的影响。方法分离、培养、增殖和纯化E14-17d小鼠的NSCs,并通过免疫荧光法对其进行鉴定。将绿色荧光蛋白转基因小鼠的NSCs移植到小鼠脊髓损伤模型体内,术后进行行为学和病理学检测,观察小鼠功能恢复情况。运用改良Allen's法制备小鼠T10-T11脊髓损伤动物模型,动物分为假手术组(12只)、模型组(12只),治疗组(12只)和对照组6(12只)。治疗组每只小鼠自眶静脉注射NSCs悬液200μl(2×10个细胞),对照组只注射DMEM/F12培养基200μl。术后1d、3d、7d、14d、21d、28d和56d,进行BBB运动功能评分和病理学检测,观察植入区细胞生长变化情况。结果 BBB评分显示:治疗组明显高于对照组(<0.01),治疗组与假手术组相比没有明显差异(>0.05),说明NSCs移植后小鼠的行为学得到了明显改善,功能有所恢复。病理学检测发现,移植后NSCs不仅迁移到脊髓损伤区,而且与宿主细胞较好地整合。结论移植的E14-17d胚胎小鼠NSCs不仅可在脊髓损伤部位存活并和宿主细胞整合,而且可促进小鼠后肢运动功能恢复。     

Lithium enhanced cell proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells to neural cells in rat spinal cord

Lithium has been shown to inhibit apoptosis of neural progenitor cells (NPCs) and promote differentiation of NPCs. However, there was rare data to discuss the effects of lithium on neural differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs). Here, we investigated the potential promotion of lithium to MSC proliferation and neural differentiation in vitro and after transplanted into the ventral horn of rat spinal cord in vivo. We found that lithium possesses the ability to promote proliferation of GFP-MSCs in a dose dependent manner as verified by growth curve and bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation assays; While in neural induction medium, lithium (0.1 mM) promotes neural differentiation of GFP-MSCs as verified by immunostaining and quantitative analysis. After transplantation of GFP-MSCs into the rat spinal cord, lithium treatment enhanced cell survival and neural differentiation after transplantation as verified by immunohistochemistry. These data suggested that lithium could be a potential drug to augment the therapeutic efficiency of MSCs transplantation therapy in central nervous system (CNS) disorders.     

直流电场诱导神经干细胞桥接横断脊髓的实验研究

目的:探讨直流电场(direct current field,DC)诱导神经干细胞(neural stem cells,NSCs)桥接横断脊髓的作用。方法:将54只雌性成年SD大鼠随机分为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)组、NSCs移植组、NSCs移植联合直流电场诱导组(DC+NSCs组),各组分7,14,28d三个时间点取材,HE染色观察神经纤维再生情况,透射电镜下观察脊髓白质内髓鞘结构变化,免疫荧光染色检测髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)表达变化。结果:在光镜下,DC+NSCs组神经纤维较其他两组都多,排布均匀且走行较规则,部分纤维穿越损伤脊髓断端两侧。在电镜下,DC+NSCs组髓鞘松散程度明显减轻,部分髓鞘结构规整,排列有序,线粒体肿胀减轻,微管空泡样变较轻,可发现大量突触,薄髓的再生髓鞘明显增多。DC+NSCs组大鼠脊髓组织中可见直径大小不等的MBP阳性的圆形结构,MBP阳性表达最多,较其他两组有显著性差异(P0.01)。结论:直流电场诱导NSCs治疗SCI可以促进损伤处脱髓的轴突再髓鞘化和MBP的表达,促进神经纤维再生,从而起到桥接横断脊髓的作用。     

补阳还五汤对大鼠脊髓损伤后移植神经干细胞存活、增殖与迁移的影响

目的:探讨补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction,BYHWD)灌胃对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后移植胚胎神经干细胞(neural stem cells,NSCs)存活、增殖与迁移的影响。方法:将SD大鼠随机分为SCI组、NSCs移植组、NSCs移植联合补阳还五汤灌胃组。制作大鼠脊髓横断损伤模型,将BrdU标记NSCs细胞按浓度1×106/ml分别移植入移植组和联合组的脊髓横断处,损伤组用等量DMEM/F12完全培养基代替。术后联合组每天用BYHWD予以灌胃治疗1次,损伤组和移植组用生理盐水代替。各组在7、14、28 d后分别取材,用免疫荧光组织化学法检测移植在SCI处的NSCs存活、增殖和迁移情况。结果:损伤组未见BrdU标记阳性细胞;联合组各时间点BrdU标记阳性细胞数量均多于移植组各时间点,并有显著性统计学意义(P<0.05);联合组28 d时BrdU标记阳性细胞数量最多,与联合组7 d和14 d相比有显著性统计学意义(P<0.05);在联合组各时间点,BrdU标记阳性细胞向SCI处头尾端组织迁移的距离明显长于移植组各时间点。结论:脊髓横断损伤后,移植胚胎NSCs能够存活并增殖和迁移。补阳还五汤能够促进大鼠脊髓全横断损伤处移植的NSCs存活、增殖和迁移。