乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。     

传染病学

一、病毒性肝炎近年来核酸疫苗作为一种能有效地刺激机体产生特异性免疫应答的全新免疫方法而备受关注。乙型肝炎病毒核心抗原 (ＨＢｃＡｇ)是细胞毒Ｔ细胞 (ＣＴＬ)识别和攻击被ＨＢＶ感染细胞的主要靶抗原。南京大学第一医院在观察到ＨＢｃＡｇ核酸疫苗具有良好的细胞和体液免疫原性的基础上 ,分别单用ＨＢｃＡｇ核酸疫苗和疫苗加免疫佐剂ＱＳ 2 1对ＢＡＬＢ/Ｃ和Ｃ5 7ＢＬ/ 6小鼠进行免疫[1] 。结果发现ＱＳ 2 1对ＨＢｃＡｇ核酸疫苗所诱导的小鼠特异性抗体及ＣＴＬ应答均有增强作用。为进一步观察该核酸疫苗对非人灵长类动物的免疫原性 …     

携带抑胃多肽序列的HBc 病毒样颗粒蛋白疫苗的制备及其免疫效果

目的:设计及制备携带抑胃多肽(GIP)抗原序列的HBc病毒样颗粒(VLP)蛋白疫苗,并研究其免疫效果,为肥胖免疫干预治疗提供新的策略。方法:克隆GIP cDNA序列,并与HBc VLP(1~144aa)cDNA序列进行融合,通过原核表达及纯化,制备携带GIP序列的HBc VLP疫苗(HBc-GIP);同时将该融合基因的cDNA序列克隆入pVAX1真核表达载体,制备GIP核酸疫苗。用2种疫苗免疫大鼠并进行免疫学指标评价。结果:成功制备了携带GIP抗原序列的HBc-GIP,并同时制备了编码该融合蛋白序列的核酸疫苗pVAX1-HBc-GIP。经过两种疫苗的联合免疫,可以获得高滴度的GIP特异性抗体IgG,显示了良好的免疫效果。结论:采用HBc(1~144aa)作为GIP的载体,制备VLP蛋白疫苗,联合核酸疫苗免疫可以有效地诱导靶向大鼠GIP的特异性体液免疫反应,打破大鼠自身抗原耐受。该疫苗可以作为一种新的控制肥胖的免疫干预药物来进一步深入研究。     

新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。     

猕猴对乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的特异性细胞免疫应答

目的 观察乙型肝炎病毒核心抗原核心酸疫苗即ＨＢｃＡｇ核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫猕猴的特异性细胞免疫应答。方法 猕猴分别在第０、２、４、６个月肌肉注射法接种核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）或对照质粒（ｐＪＷ３０３）；ＥＬＩＳＡ法检测猕猴外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），经特异性抗原（ＨＢｃＡｇ）刺激后，培养上清中人白细胞介素－４（ＩＬ－４）和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）以及猕猴血清中抗－ＨＢｃｌ     

核酸疫苗的研究现状

核酸疫苗（nucleicacid vaccine）是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基（DNA或RNA）序列质粒载体作为疫苗，直接导入到动物细胞内，通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称为基因疫苗或裸DNA疫苗，核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，其中研究最多的是DNA疫苗。这种免疫称为核酸免疫、基因免疫、DNA介导的免疫以及遗传免疫等。许多研究者将不同病原的保护性抗原基因直接导入动物体内，引起特异性免疫应答，并已在一些疾病如流感、狂犬病、乙肝、艾滋病、牛疱疹病毒感染以及结核病和疟疾等取得初步结果。     

乙型肝炎病毒核心区DNA疫苗接种后H-2d小鼠的特异性免疫应答

目的　观察乙型肝炎病毒 (HBV)核心区DNA疫苗接种后BALB/c(H 2 d)小鼠的特异性免疫应答。方法　构建HBV核心区DNA疫苗 (PJW430 3/HBc) ;用基因枪法和肌内注射法将该DNA疫苗接种BALB/c小鼠 ;ELISA法检测小鼠血清抗 HBc(IgG)及IgG亚类 (IgG1,IgG2a) ;51铬释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性。结果　该DNA疫苗在体外转染细胞中可良好表达HBcAg。血清抗 HBc终点滴度在DNA疫苗基因枪组和肌肉注射接种组小鼠分别为 1∶32 80 5 0和 1∶10 935 0。两组小鼠的抗 HBcIgG亚型均以IgG2a略占优势。两组小鼠的HBbAg特异性CTL杀伤活性分别达到 5 1 1%和 5 5 2 %。结论　HBV核心区DNA疫苗在小鼠实验中具有良好的细胞免疫和体液免疫原性。     

囊虫病的核酸免疫研究进展

囊虫病是一种常见的人兽共患寄生虫病,对人类健康危害极大.目前,尚无可用于人体的有效疫苗.以往的疫苗多为粗抗原疫苗,免疫效果不理想.核酸免疫技术的开展为囊虫病疫苗研制提供了一条新思路.核酸免疫(nuclear acid immunization)又称基因免疫(genetic immunization),是将含有编码目的抗原的质粒直接注入体内,通过宿主细胞的转译系统表达目的抗原,并诱导机体产生免疫应答的一种新技术.目前WHO已将此法正式命名为核酸免疫法(nuclear acidvaccination).     

基于SOE-PCR的核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70的构建及免疫效果研究

目的 构建pIRES2-MLAA34-HSP70重组质粒,并检测其免疫效果.方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)的方法提取急性单核细胞白血病相关抗原基因MLAA-34和热休克蛋白(HSP) 70基因,设计特异性重叠引物,以重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增MLAA34-HSP70融合基因,构建核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70.将核酸疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠脾淋巴细胞对U937细胞的杀伤作用及小鼠脾细胞悬液中白细胞介素(IL)-2、IL-4和γ干扰素(IFN-γ)水平.结果 扩增出MLAA34-HSP70融合基因2 956 bp,成功构建了核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70,经鉴定与预期结果一致;脾淋巴细胞杀伤活性结果显示,核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70对U937细胞的杀伤效率明显高于其他实验组及对照组(P＜0.01);核酸疫苗pIRES2-MLAA34-HSP70组细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ水平亦明显高于其他实验组及对照组(P＜0.01).结论 成功构建了pIRES2-MLAA34-HSP70核酸疫苗,该核酸疫苗能诱发强烈的体液免疫,增强机体对肿瘤细胞的免疫应答,对MLAA34阳性细胞具有特异性杀伤作用.     

树突状细胞介导的妇科肿瘤免疫治疗研究进展

肿瘤特异性免疫应答主要由T细胞承担,且依赖于有效的抗原提呈.树突状细胞(D C)是目前已知体内功能最强大、唯一能够激活初始型T细胞的专职抗原提呈细胞(A P C)[1].作为抗原特异性免疫应答的始动者和调控者,D C能够诱导患者机体产生对肿瘤特异、持久的主动免疫应答.近年来,随着体外扩增D C和制备D C疫苗技术的日趋成熟,采用D C疫苗进行抗肿瘤治疗已成为当今肿瘤免疫治疗的新方向,在宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等妇科肿瘤的治疗方面也有了突破性进展.     

DNA疫苗诱导的免疫应答控制土拨鼠肝炎病毒复制

目的:研究DNA疫苗在嗜肝病毒慢性感染的个体诱导产生的细胞和体液免疫应答水平,及其对嗜肝病毒复制的抑制作用,探索打破病毒特异性免疫耐受的新途径。方法:利用土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,采用WHV核心抗原(WHV core antigen,WHc Ag)的真核表达质粒(p WHc Im和p CGWHc)作为DNA疫苗免疫3次后,分别采用流式细胞仪检测WHc Ag特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxical T cells,CTL),ELISA检测血清抗-WHc抗体水平,realtime PCR检测血清WHV DNA载量。结果:DNA疫苗在转基因小鼠体内诱导高水平的抗-WHc-Ig G2a抗体和WHc Ag特异性的CTL应答,而且DNA疫苗介导的免疫应答显著抑制WHV复制。与对照组相比,DNA疫苗处理使WHV转基因小鼠血清病毒载量下降2~3个Log值,其中p CGWHc免疫组的6只小鼠中3只血清DNA降至检测低限以下。结论:DNA疫苗可以在转基因小鼠体内诱导产生强烈的细胞和体液免疫应答,并控制WHV复制,提示DNA疫苗在打破嗜肝病毒特异性免疫耐受中具有重要作用,有可能开发成为乙型肝炎治疗的新方法。     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

肝癌疫苗的研究现状和进展

近些年来,肝癌疫苗备受关注,已成为肝癌免疫治疗的研究热点之一。运用肝癌细胞、肝癌抗原、树突状细胞及核酸等为基础构建的肝癌疫苗,通过激发机体的免疫系统,诱导机体产生针对肝癌特异性抗原的免疫应答,达到杀灭表达肝癌抗原的肿瘤细胞而产生抗肿瘤效应的目的。通过临床试验发现,肝癌疫苗可减少肝癌的复发转移、改善患者生存质量以及延长存活时间,已成为肝癌综合治疗的重要部分。现对研究较多的几种肝癌疫苗的研究概况及最新研究成果作一综述。     

汉坦病毒胞膜糖蛋白与人溶酶体相关膜蛋白嵌合基因疫苗研制

【目的】 我国是汉坦病毒所致肾综合征出血热发病情况最为严重的国家,作为传统预防措施的灭活疫苗在预防出血热发生中发挥了巨大的作用,然而仍存在免疫原性低,生产运输保存不便,免疫后机体不能获得长效免疫记忆能力等缺陷。为克服传统灭活疫苗的诸多不足,近年研究多集中在核酸疫苗的探索上。常规DNA疫苗表达的蛋白属内源性抗原,抗原提呈细胞(APC)启动MHCI类抗原加工途径,向CD8⁺T细胞提呈MHCI/抗原肽复合物,而CD4⁺T细胞不能被有效活化。溶酶体是外源性抗原加工途径MHCⅡ类分子器室(MⅡC)的重要组成部分。我们课题组利用溶酶体相关膜蛋白(LAMP)胞浆尾的靶向作用(可与内吞体/溶酶体膜结合并翻转其中),将汉坦病毒胞膜糖蛋白(Gn)基因插入LAMP分子luminal domain和transmembrane/cytoplasmic tail之间,使Gn直接进入MⅡC,从而实现内源性抗原的MHCⅠ类加工途径向MHCⅡ类加工途径的转化。由此,不仅可同时激活细胞免疫应答和体液免疫应答,还可获得较好的长效免疫记忆能力,保护机体免受汉坦病毒的感染和疾病的发生。 【方法】 构建质粒pVAX-Gn、pVAX-LAMP、pVAX-LAMP/Gn,转染293T细胞鉴定目的蛋白表达;高纯度去内毒素质粒免疫BALB/c小鼠,设立灭活疫苗对照组;通过间接ELISA和中和试验评价体液免疫应答;采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)与细胞杀伤试验共同评价特异性细胞免疫应答;夹心ELISA和实时定量PCR(qRT-PCR)检测攻毒后体内各组织病毒载量评价保护效力。 【结果】 成功构建载体并有效表达目的蛋白;实验组小鼠血清特异性抗体和中和抗体效价都明显高于各对照组,脾淋巴细胞特异性分泌IFN-γ和CTL杀伤活性亦均高于其他各组,体外结果表明:即使与传统灭活疫苗相比,特异性细胞与体液免疫应答均显著增强;体内攻毒试验显示,实验组小鼠体内无汉坦病毒特异性抗原检出,表明接种该疫苗可保护个体免受病毒感染;增强免疫观察到表位扩展,且仅在LAMP重组疫苗免疫小鼠组检测到长效记忆性免疫应答。 【结论】 汉坦病毒胞膜糖蛋白与人溶酶体相关膜蛋白嵌合基因疫苗能够获得良好的特异性免疫应答,同时具有很好的对抗病毒感染的保护效力和长效免疫记忆,这些都提示该新型汉坦病毒基因疫苗未来在临床上的应用前景。     

CTL的免疫识别

免疫识别是机体免疫系统产生特异性免疫的基础 ,通过对抗原的特异性识别 ,激发机体产生免疫应答 ,最终由效应细胞和 /或效应分子 (Ａｂ)清除病原体或“异己”物质。对特异性抗原的大量研究 ,并由此研制的疫苗在预防、控制多种传染性疾病方面起到重要作用。近年来 ,细胞毒性Ｔ细胞 (ＣＴＬ)引起人们的重视 ,发现人类面临的多种难以攻克的疾病 ,如肿瘤、ＡＩＤｓ、乙型肝炎等 ,ＣＴＬ扮演着关键角色。现就ＣＴＬ免疫识别方面的问题作一综述。1　ＣＴＬ免疫识别的结构基础　　ＣＴＬ仅能识别表达于抗原提呈细胞 (ＡＰＣｓ)表面并与ＭＨＣⅠ类分…     

肺癌治疗性疫苗的临床应用进展

肿瘤疫苗即是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应,以调节机体免疫功能,达到治疗肿瘤的目的。治疗性肿瘤疫苗可通过主动免疫诱导全身特异性抗肿瘤效应。根据其制备方法不同,疫苗主要分为:细胞疫苗、多肽疫苗和蛋白质疫苗、核酸疫苗、抗独特型抗体疫苗等。本文对目前肺癌相关疫苗的类型、研究进展和临床应用情况进行综述,从而为进一步的研究提供一定的借鉴和参考。     

SARS S603-620表位核酸疫苗诱导BLAB/c小鼠产生特异性体液免疫应答

目的构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗并观察其免疫效果。方法将已经鉴定的SARSS抗原的B细胞表位S603-620的编码DNA序列插入真核表达载体PCI中,构建核酸疫苗(PCI-S603-620)。使用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,电泳及DNA测序鉴定。使用脂质体将PCI-S603-620转入293A细胞,使用ELISA检测其在真核细胞中的表达。使用PCI-S603-620免疫小鼠,ELISA检测其诱导的抗体情况。结果对PCI-S603-620进行酶切鉴定,电泳结果表明目的基因片段分子量为100bp左右。PCI-S603-620的DNA测序结果表明其序列与设计序列吻合。PCI-S603-620能在转染的293A细胞中表达。PCI-S603-620免疫小鼠可以诱导特异性抗体产生,效价为1:400。该抗体可以特异性识别SARSS抗原。结论成功构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗(PCI-S603-620)。     

乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后的免疫应答研究

目的 构建乙肝核酸疫苗pCI/S2S,研究其接种小鼠后,接种局部肌肉特异性抗原蛋白的表达以及所诱生的免疫应答反应.方法 从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,扩增出基因片段S2S,与pCI载体进行连接,得到重组质粒pCI/S2S.将其肌肉注射接种BALB/c小鼠,在不同的时间点检测血清中抗-HBs及抗-preS2;并于第12周时用细胞毒性检测试剂盒(LDH)检测体外细胞毒性T细胞(CTL)活性,同时以免疫组织化学法检测小鼠接种部位HBsAg的表达.结果 小鼠肌肉接种pCI/S2S完成后1周血清抗-HBs、抗-preS2开始阳转,阳转率于6周或8周达高峰,且能诱生特异性CTL应答.此外,免疫组织化学法能在小鼠的接种局部肌细胞中检测出目的抗原蛋白的表达.结论 乙肝核酸疫苗pCI/S2S接种小鼠后,能在小鼠体内诱生特异性的体液免疫和细胞免疫应答.     

SARS冠状病毒S蛋白多价核酸疫苗的构建和免疫学原性

目的构建以SARS冠状病毒（severe acutere spiratory syndrome coronavlrus,SARs．c0V）S蛋白3个保守片段基因的组合为抗原基因DNA疫苗,采用肌肉注射的方法接种小鼠后观察机体产生免疫应答的情况。方法将人工合成的S蛋白3个保守片段基因组合（称为Sa）克隆至真核表达载体pcDNA3、1（-）,随之将重组质粒进行小鼠肌肉免疫,定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平,流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化,PCR法检测质粒分布,免疫组化检测抗原表达。结果疫苗注射后15d就能在血清中检测出病毒特异性抗体,并且疫苗能在机体中持续表达抗原引发机体持续的免疫应答,直到注射后45d免疫应答都不见减弱;以CTLT淋巴细胞为主的CD8＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著,引起强大的体液免疫和细胞免疫;而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论以S蛋白3个保守片段基因组合为抗原基因的DNA疫苗通过肌注能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

鼻黏膜免疫佐剂提高疫苗免疫效应的作用机制及进展

大量研究表明,通过鼻黏膜免疫的疫苗可诱导机体生成免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA),有望成为疫苗的有效作用途径之一.但单独使用疫苗鼻黏膜免疫后不会在鼻腔中诱导强IgA产生,需要添加免疫佐剂激活先天免疫应答,增强抗原特异性IgA产生和细胞应答.目前应用的鼻黏膜免疫佐剂种类繁多,但佐剂促进免疫应答的具体机制仍不清楚.本文讨论了鼻黏膜免疫佐剂在鼻相关淋巴组织(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)中促进免疫应答的途径,为进一步对鼻黏膜免疫佐剂的相关研究提供参考.