静态机械拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞前列腺素E2分泌量的影响

目的：研究静态机械拉伸应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞前列腺素E2(PGE2)分泌量的影响。方法：实验的拉伸应变量设为0％、8％、12％、16％、20％5种，加力时间为24、48、72h3种，总共分为15组，每组设3个样本。加力完毕后，用RIA ELISA法分析每个样本培养基中PGE2的含量并进行统计分析。结果：在0％力值组，PGE2的每天分泌量与加力时间无关；在8％、12％、16％力值组，PGE2的每天分泌量随着加力时间和力值的增加而递增，但每天递增量随着加力时间的增加而减少；在20％力值组，PGE2的每天分泌量与加力时间成反比；在各个时间组，PGE2的每天分泌量均在16％力值处达到最高值。结论：在细胞的生理应变承受范围(0％、8％、12％、16％)内，静态机械拉伸应变促进人牙周膜成纤维细胞PGE2的分泌，但刺激效应随着加力时间的增加而减少；当拉伸应变量超过了细胞的生理应变承受范围(20％)．则PGE2的分泌量会随着加力时间的增加而减少。     

张应力刺激下人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素、细胞骨架的变化

目的:研究不同动态张应力刺激下体外培养的人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素β1和细胞骨架的变化.方法:刮取牙根中1/3牙周膜组织,采用Ⅰ型胶原酶消化结合组织块贴附法进行人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)原代培养并传代.用四点弯曲加载装置,通过对体外培养的hPDLF分别施加不同动态的张应力,采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白和整合素β1亚单位mRNA表达的影响.经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张应力后细胞形态的变化.采用SPSS 13.0软件包对荧光定量PCR所得数据取常用对数后行ANOVA分析.结果:张应力的大小及加力时间都对hPDLF纤连蛋白mRNA表达产生影响.加力后,hPDLF整合索β1亚单位mRNA表达下调,这种下调变化与所施加应力大小和作用持续时间相关.机械力刺激越强,整合素β1表达越明显.加力后,细胞骨架形态发生变化.加力前呈梭形,排列呈漩涡状,F-actin纤维粗且分布均匀;加力后,形态不规则,沿力的方向排列整齐,F-actin纤维细且分布不均匀;加力12h后,形态恢复到加力前形态,细胞F-actin荧光染色强度也由正常到下降再到正常.结论:动态张应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进纤连蛋白、整合素βmRNA表达改变,hPDLF细胞骨架的形态结构也发生一定规律的变化.     

机械拉伸对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原及蛋白合成的影响

目的：研究拉伸应变对人牙周膜成纤维细胞I型胶原及蛋白合成的影响。方法：应用酶联免疫吸附实验及考马斯亮蓝微板法对拉伸应变下的细胞合成代谢变化进行观察,应变范围为1－8％,结果：在0．5－8％拉伸应变范围内,人牙周膜成纤维细胞I型胶原合成无明显变化,但1－8％拉伸应变作用下细胞蛋白合成减少,其中2％拉伸应变影响最明显。结论：拉伸应变可改变人牙周膜成纤维细胞细胞外基质成分。     

动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架变化

目的:观察不同动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的变化.方法:用Forcel四点弯曲加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力(强度为1 000、2 000、4 000 μstrain,加力时间为0、1、2、4、8、12 h),经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张、压应力后细胞形态变化,细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化.结果:加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生规律性变化;细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常;细胞骨架对张、压应力作用的反应敏感程度无明显差异.结论:在一定的张、压应力范围内人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性.     

兔脂肪源干细胞与牙周膜成纤维细胞共培养的实验研究

目的:研究脂肪源干细胞能否与牙周膜成纤维细胞直接共培养,在共培养状态下,脂肪源干细胞能否促进牙周膜成纤维细胞胶原特异基因的表达。方法:分别从新西兰白兔皮下脂肪和牙周膜组织中分离出脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞,体外常规培养;将两种细胞等量混合共培养,利用光镜和F-actin染色标记细胞骨架的方法观察共培养细胞的形态变化,并与单纯培养的细胞比较;利用DAPI染色标示细胞核细胞计数法检测共培养细胞的增殖情况;利用定量PCR法检测特异基因I型胶原在单纯培养和共培养细胞中的表达。结果:脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞能直接共培养;共培养细胞形态近似牙周膜成纤维细胞;共培养对细胞增殖无明显影响;脂肪源干细胞可提高牙周膜成纤维细胞I型胶原基因的表达。结论:脂肪源干细胞可与牙周膜成纤维细胞共培养,并促进牙周膜成纤维细胞的胶原分泌。     

人牙周膜成纤维细胞在纯钛表面附着的电镜观察

目的：研究人牙周膜成纤维细胞(PDLF)在纯钛金属表面的结合形式和超微结构。方法：将纯钛试件放在12孔培养板内，取生长良好的第五代人牙周膜成纤维细胞接种在试件表面，培养72h后取出，原位包埋法制作透射电镜标本，透射电镜观察。结果：人牙周膜成纤维细胞在纯钛表面附着形式不同于上皮细胞在金属表面的附着形式，细胞与金属结合界面中未观察到典型半桥粒结构。人牙周膜成纤维细胞胞浆中，细胞器发达，富含与蛋白质合成、代谢及增殖等生物学功能有关的细胞超微结构，如粗面内质网、线粒体、核糖体、细胞核等。结论：人牙周膜成纤维细胞在钛金属表面的附着形式，不同于上皮细胞的附着形式，表现为蛋白合成旺盛，可能为细胞直接附着，其具体附着形式还待进一步研究。     

静态张应力作用下人牙周膜成纤维细胞β-catenin和Wnt3a蛋白的表达

目的:研究人牙周膜成纤维细胞在不同大小机械张应力作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。方法:运用酶解组织块法体外培养人牙周膜成纤维细胞,将细胞按加力时间的不同(2 h、4 h、6 h)分为3组,每组再按形变率不同将其分为8%、12%和16%3个亚组,并取加力时间0h、形变率0%作为对照组。用western blot技术检测细胞在不同时间点和不同形变率作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。结果:Western blot结果显示,人牙周膜成纤维细胞在机械力加载后β-catenin 和Wnt3a蛋白表达显著减少(P<0.05)。在加力时间相同的组内(2 h、4 h、6 h),β-catenin 和Wnt3a蛋白表达随着形变率的增大而逐渐减少(P<0.05)。结论:β-catenin和 Wnt3a参与了静态张应力作用下牙周膜成纤维细胞的代谢,机械力对牙周膜成纤维细胞中Wnt/β-catenin信号通路有抑制作用。     

FN对牙龈和牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响

目的：观察纤维结合蛋白（FN）对牙龈成纤维细胞（GF）、牙周膜成纤维细胞（PDLF）的影响。方法：采用细胞培养、MTT比色测定、碱性磷酸酶（ALP）测定法、考马斯亮蓝法和茜素红染色法。结果：FN能促进两种细胞的增殖，对PDLF的碱性磷酸酶活性和蛋白合成也有促进作用，但对其矿化结节形成能力无显著影响。结论：FN能促进牙龈和牙周膜成纤维细胞的增殖及蛋白合成，但其促进细胞分化的能力有限，尚需其它生长因子的协助以促进组织再生。     

机械应力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1mRNA表达的调节

目的观察机械力刺激对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。方法用Forcel四点弯曲加载装置通过对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态张、压应力（强度为1 000、2 000、4 000 μstrain，加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h），采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。结果施加动态的张、压应力后，人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达量下调，这种下调变化与所施加应力的性质、大小和作用持续时间相关。人牙周膜成纤维细胞整合素β1对张、压应力刺激的感应不完全一致，机械力刺激越强，整合素β1表达越明显。结论动态张、压应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进目的基因mRNA表达改变，不同的机械力对细胞整合素β1效应不同。     

体外机械力诱导牙周膜细胞成骨分化过程中转录因子Osterix的表达

Osterix（Osx）是前成骨细胞分化为功能性成骨细胞过程中一种关键性的转录因子。该研究旨在通过检测机械力诱导牙周膜细胞成骨分化过程中转录因子Osterix表达的变化，揭示Osterix是否在机械力诱导牙周膜细胞成骨分化过程中发挥作用。体外培养人牙周膜细胞，以离心机加力，加力时间分别为1、2、4、6、8和12h。     

人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。     

人牙周膜成纤维细胞增殖与压力关系的初步观察

目的：在体外培养环境下观察压力对人牙周膜成纤维细胞（HPLF）增殖的影响。方法：取第4－6代培养的HPLF,应用可控压力细胞加载装置分别间断性施加30、60、90kPa的压力,分别在培养3、5、7d后用MTT法测定各组的A值。结果：HPLF在30、60、90kPa的压力培养环境下MTT反应的A值显著小于对照组,压力值越大,A值越小。结论：30、60、90kPa间断性压力显著抑制PLF细胞增殖,该抑制作用随压力值增大而增强。     

周期性牵张力加载下人牙周膜细胞中血管内皮生长因子表达变化的研究

目的：观察周期性牵张力作用下，体外培养的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，HPLFs)中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的变化，以探讨机械力介导下牙周组织改建的机制。方法：通过体外细胞培养加载系统，采用周期性牵张力(每分钟6个循环，12％形变量)加载l、3、5、7d，用免疫组化和原位杂交技术，观察VEGF在HPLFs中的表达。结果：HPLFs在体外表达VEGF，其蛋白水平及mRNA水平的表达从加力ld开始升高，5d达到高峰，在加力7d开始下降。结论：在一定条件下，周期性牵张力可显著影响HPLFs VEGF的蛋白和mRNA水平的表达，进一步证实机械力作用下，VEGF参与了牙周组织改建，在正畸牙齿移动的机制中具有重要意义。     

The roles of angiotensin II in stretched periodontal ligament cells

The loading caused by occlusion and mastication plays an important role in maintaining periodontal ligament (PDL) tissues. We hypothesized that a loading magnitude would be involved in the production of biological factors that function in the maintenance of PDL tissues. Here, we identified up-regulated gene expressions of transforming growth factor-β1 (TGF-β1), alkaline phosphatase (ALP), and angiotensinogen in human PDL fibroblastic cells (HPLFs) that were exposed to 8% stretch loading. Immunolocalization of angiotensin I/II (Ang I/II), which was converted from angiotensinogen, was detected in rat PDL tissues. HPLFs that were stimulated by Ang II also increased their gene expressions of TGF-β1 and ALP. Furthermore, the antagonist for Ang II type 2 receptor, rather than for type 1, significantly inhibited gene expressions induced by the stretch loading. Analysis of these data suggests that Ang II mediates the loading signal in stretched HPLFs to induce expressions of TGF-β1 and ALP.     

雌激素与机械张应力对碱性成纤维细胞生长因子的影响

目的研究雌激素与机械张应力共同作用对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast,HPDLF)增殖分化相关因子碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)mRNA表达水平的影响。方法体外培养HPDLF,分为两组。实验组使用10-7mol/L雌激素干预后,使用4点弯曲加力装置对HP-DLF进行张应力加载;对照组不使用雌激素干预,只进行机械张应力加载。采用实时多聚酶链反应、琼脂糖凝胶电泳和紫外线分析检测HPDLF加力时3、6、12 h时bFGF基因的表达。结果加力0、3、6、12 h时,对照组bF-GFmRNA表达量光密度值分别为1.000,3.245±0.261,4.498±0.431,7.969±0.597,实验组bFGFmRNA表达量光密度值分别为16.736±1.003,22.542±1.768,27.923±1.914,31.556±2.142。雌激素干预与张应力加载共同作用与单纯受到机械张应力作用相比,bFGF的mRNA表达量明显上调(P<0.05)。结论雌激素对机械张应力状态下的牙周膜成纤维细胞增殖分化相关因子bFGF有较强调控作用,表现为bFGF的mRNA表达量显著上升。     

周期性张应力作用下成骨样细胞MG-63中c-fos基因和丝状肌动蛋白相互关系的研究

目的探讨成骨样细胞MG-63中c-fos基因和细胞骨架丝状肌动蛋白（F-actin）的相互关系。方法对MG-63细胞施加周期性张应力,频率为0.5 Hz,细胞应变为2 000 μstrain,按3、6、12 h不同时间段进行加载,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测c-fos mRNA的变化,筛选最佳加载时间点,并作为实验组和0 h组进行对比,检测在细胞松弛素D作用下c-fos mRNA和F-actin的表达变化。结果周期性张应力可以诱导c-fos mRNA的表达增加,至3 h达到峰值;在周期性张应力作用下,MG-63细胞中F-actin的结构、排列发生改变,但荧光强度无明显变化;经细胞松弛素D处理后,张应力作用下的MG-63细胞的应力纤维明显减少,F-actin荧光强度降低,c-fos mRNA表达受抑制。结论周期性张应力作用下,F-actin的量并没有明显变化,只是出现了结构上的重组,且重组的是既有的F-actin。F-actin重组是应力诱导c-fos基因高表达的一个重要环节。     

bFGF与米贝拉地尔对人牙周膜成纤维细胞增殖的调节

目的:研究成纤维细胞生长因子(bFGF,以下用B代表)与米贝拉地尔(Mibefradil,以下用M代表)这两种药物对人牙周膜成纤维细胞(HPLFs)增殖的调节作用。方法:B分10.0、20.0、30.0 μg/L 3种浓度(分别为B1、B2、B3),M分2.5、5.0、10.0 μmol/L 3种浓度(分别为M1、M2、M3),再按加药时间分为1 d组、2 d组和3 d组,用WST法检测两种药物单独使用和按先后不同顺序联合使用后HPLFs的增殖率。结果:两种药物单独使用可分别起到促进和阻滞细胞增殖的效果,但是B作用时间过长细胞表现为增殖受阻滞。其中,B3作用1 d组细胞增殖率最高(P<0.05),M2作用1 d组细胞增殖率最低(P<0.05)。M仅对加用B3的细胞有明显阻滞作用,与单独使用B3的细胞增殖率有显著性差异(P<0.05)。另外,只有B1不能改变细胞加用M后增殖受阻滞的现象。所有联合用药后的细胞增殖率均与正常细胞增殖率无统计学差异。结论:bFGF与Mibefradil单独使用有各自的最佳作用浓度和作用时间。除过度增殖状态外,HPLFs增殖状态很难受到阻滞,并且处于增殖受阻滞状态的细胞很容易恢复增殖状态,以维持HPLFs不断处于增殖平衡状态。     

内皮素促人牙周膜成纤维细胞生长作用的体外研究

目的:探讨不同浓度内皮素-1(ET-1)对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblastcells,HPLFs)增殖和分化的影响,为进一步探讨正畸牙齿移动的生物学机制奠定基础。方法:采用HPLFs体外培养技术和四唑盐(MTT)显色分光光度法及生化检测法观察ET-1对人牙周膜成纤维细胞增殖和分化的影响。结果:与对照组相比,10-8mol/L组ET-1对HPLFs具有显著的促增殖作用(P<0.01),10-6mol/L组ET-1对HPLFs的增殖具有明显的抑制作用(P<0.01)。ET-1对HPLFs的分化没有影响。结论:ET-1为促HPLFs生长因子,但是对细胞分化不产生影响,可能在正畸过程中牙周组织的改建中发挥作用。