2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析

目的 测定2014年南平市登革暴发相关登革病毒E基因序列,探讨其输入来源及基因型别.方法 将患者急性期血清接种C6/36细胞,分离登革病毒,通过RT-PCR进行血清型鉴定,扩增全长E基因,测定序列并绘制系统进化树.结果 共分离到4株DENV-1,2株DENV-2,扩增并测序获得E基因全长序列,4株南平地区DENV-1型分离株之间同源性为100%,与D13459(Donguang)分离株同源性也高达99.7%;2株DENV-2型分离株与DENV2/CN/GZ05/2014分离株的同源性均达100%.系统进化分析发现,4株DENV-1病毒株与来自广东及印度的毒株处于同一进化树分支,均为基因Ⅴ型;2株DENV-2病毒株与来自广东及新加坡的毒株处于同一进化树分支,均为基因Ⅳ型.结论 福建省南平市本次登革热本地病例暴发可能是由广东或者东南亚地区的登革热输入病例引起的.     

广州市2009年Ⅰ型登革病毒E基因序列分析

目的 测定广州市2009年Ⅰ型登革病毒的E基因序列并进行分析,探讨其来源及基因型.方法 收集广州市2009年登革热患者急性期血清19份,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发生树,结合流行病学资料进行信息学分析.结果 19份标本中分离到4株Ⅰ型登革病毒株,测序获得其E基因序列.分析发现4株病毒来自两个不同的亚型,09/GZ/9104和09/GZ/9236两株Ⅰ型登革病毒核苷酸序列相同,属于美洲/非洲型;09/GZ/11534和09/GZ/11562两株Ⅰ型登革病毒序列同源性较高,属于亚洲型.结论 广州市2009年Ⅰ型登革病毒属输入性,分属两个基因型,推测可能来源于不同的传染源.     

2015-2020年珠海市登革热流行情况与病毒基因特征分析北大核心CSCD

目的了解2015-2020年珠海市登革热的流行情况与病毒基因特征。方法收集登革热病例基本信息,采用RT-PCR对血清标本进行血清分型,阳性标本用RT-PCR扩增E基因并进行测序分型,获得的基因序列用MEGA6.0软件进行系统进化分析。结果2015-2020年珠海市共确诊登革热患者156例,其中131例患者的标本成功测序,包括DENV-1型96份,DENV-2型25份,DENV-3型10份;DENV-1型全部属于基因I亚型,分布在三个不同的分支上,这三个分支分别与柬埔寨、越南,斯里兰卡和柬埔寨、泰国等流行株进化距离较近;DENV-2和DENV-3病例主要为输入病例,与其对应的输入国流行株进化距离较近。结论近年来珠海市登革病热疫情为输入性病例引起的本地暴发流行,需加强与东南亚国家接壤的边境城市的登革热输入防控工作。     

南海市登革病毒流行株结构基因序列测定及结构分析

目的对我国登革2型病毒1998年广东省南海市流行株GD08/98结构蛋白基因进行序列测定及分析,为追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT—PCR扩增,分别克隆到pMD18—T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果此登革病毒株结构蛋白基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株ThNH81/93、NGC、44、TSV01、04及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为98％、94％、94％、92％、92％、90％。结论GD08/98病毒株的结构基因序列基本类似于已发表的其它登革2型病毒株。GD08/98株与ThNH81/93株同源性最高,推测其可能来源于泰国。     

福建省2004~2010年登革病毒E蛋白基因序列分析

目的 通过登革病毒包膜蛋白基因序列测定与进化分析,确定2004~2010年间福建省登革病毒的主要来源地。方法 提取登革病毒分离株的RNA,扩增病毒外膜蛋白基因,扩增产物经TA克隆后提取质粒并测序,应用相关专业软件做序列分析。结果 在测定的12株登革病毒外膜蛋白基因核酸序列中,1、2型病毒的序列长度均为1485bp,3型为1479bp。BLAST比对与序列进化树均表明,2004~2010年期间,福建省所分离的登革病毒分离株与东南亚一带流行的毒株一致性最高,福建省与东南亚流行的毒株间具有高度的同源性。结论 2004~2010年福建省流行的登革病毒应当是由东南亚一带输入,应加强对该地区入境人员的监测工作。     

杭州市2019年登革病毒分子流行病学研究

目的 了解2019年杭州市登革病毒分子特征和可能的传播来源.方法 收集登革热患者血清样本,分析登革热流行特征.分别采用ELISA和RT-PCR方法检测登革热抗体、登革病毒核酸及其型别,再对核酸阳性样本进行E基因扩增、序列测定和进化分析.结果 2019年杭州共检测登革热病例212例(输入性病例158例,本地病例54例),...     

我国3株登革2型病毒E基因序列测定及毒力基因位点分析

目的 测定我国3株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革2型病毒流行株E基因序列并找到可能与毒力相关的基因位点。方法 运用RT-PCR法测定我国3株登革病毒的E基因序列。结果 DEN2-04、43、44株的核苷酸及氨基酸同源性均在95%以上,DEN2-04与DEN2-43、44共有4个氨基酸差异引起极性或电荷的变化。结论 E64、E203很可能是与毒力相关的基因位点。     

Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达

目的　克隆 2型登革病毒E基因并用酵母真核表达 ,获得全长的重组E蛋白 ,为其结构与功能的研究提供条件。方法　从感染DEN2 (NGC株 )后病变的C6 /36细胞上清中提取RNA ,通过RT -PCR扩增E基因片段 ,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒 ,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定 ,取Mut+菌诱导表达 ,SDS -PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果　RT -PCR得到 1 5kb的E基因片段 ,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因 ;Mut+ 酵母转化菌可分泌表达约 6 9kDa的蛋白 ,与DEN2E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论　成功将克隆的全长DEN2E基因在酵母菌中表达 ,获得的重组E蛋白具有免疫反应性。     

2015-2016年深圳市登革Ⅲ、Ⅳ型分离病毒株E/NS1基因序列特征

目的 了解2015-2016年深圳市分离的登革Ⅲ、Ⅳ型病毒E/NS1基因序列特征及登革Ⅲ、Ⅳ型病毒流行规律,探究其可能的传播来源。方法 收集2015-2016年深圳市登革热患者病例资料及急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,用FQ-PCR对其进行血清分型,分离成功的病毒株用反转录-聚合酶链反应(PCR)方法扩增E基因和NS1基因,进行序列分析,绘制系统进化树,氨基酸比对分析4个不同血清型NS1蛋白。结果 从5份Ⅲ型的登革病毒标本中成功分离4份病毒株,3份Ⅳ型登革病毒标本中成功分离2份登革病毒;BLAST分析保守E基因结果表明,与DENV-3分离株同源性最高(99%)的毒株主要是印度尼西亚2010和2015年分离株、菲律宾2015年分离株。与DENV-4分离株同源性最高(99%)的毒株主要是菲律宾2013年分离株、印度尼西亚2010分离株、意大利2009年分离株。NS1基因序列分析显示所选4株不同血清型的病毒株氨基酸相似性为77.69%,4个不同血清型的登革热NS1抗原存在5-7个氨基酸保守区域。结论 2015-2016年深圳市输入的登革Ⅲ、Ⅳ型病毒可能来自印度尼西亚和菲律宾,应加强出入境人员的监测工作,避免输入引起本地感染的风险。     

登革病毒2型广东省分离株的鉴定及NS1基因序列分析

目的 明确广东省南海市1998年夏、秋季一批发热、出疹患者的诊断,并从基因水平分析其流行株的来源。方法 收集疑似登革热（DF）患者 血清52份,应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、病毒分离和间接免疫荧光技术分别进行了病原学和血清学检测;同时采用分子克隆技术将PCR扩增产物克隆到T载体,并进行序列测定。结果 从25份发病早期患者血标本中分离病毒10份,经用单克隆抗体间接免疫荧光检测和RT－PCR检没让实为登革病素2型感染。基因序列分析表明,1998年广东分离的登革2型病毒与ThNH-P28/93、C0166`16681`NGC`JAM`04`GD06/93和S1株核苷酸的同源性分别是：98％、97％、96％、93％、92％、91％。结论 此次南海市登革热暴发流行为 登革病毒2型感染所致。基因序列分析提示：1998年广东省南海市分离的登革病毒2型可能来源于泰国。     

融合免疫佐剂Lipo多肽与包膜蛋白EDⅢ区的登革病毒四价疫苗的构建及免疫效应研究

目的构建编码免疫佐剂Lipo多肽与登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII区的重组甲病毒载体,并在小鼠体内研究其免疫效应,为研制新型的登革病毒四价疫苗奠定基础。方法先通过GS linker将编码免疫佐剂Lipo多肽的基因序列与编码登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII区的基因序列进行串联获得LipoEDIII;然后将LipoEDIII基因插入甲病毒载体DREP的多克隆位点,构建重组甲病毒载体DREP-LipoEDIII;将DREP-LipoEDIII转染293细胞,Western blot检测融合蛋白的表达;随后将DREP-LipoEDIII免疫ICR小鼠,不加任何佐剂,再加强免疫2次后,通过ELISA检测血清中的抗体效价和细胞因子的分泌情况来评价其免疫效应。结果成功构建了含有"融合免疫佐剂Lipo多肽与包膜蛋白EDIII区"的重组甲病毒质粒DREP-LipoEDIII。DREP-LipoEDIII免疫小鼠后可以诱导产生特异性抗体,抗体效价为1∶160。抗原刺激小鼠脾淋巴细胞可以产生IFN-r、IL-4、IL-10细胞因子,实验组的浓度明显高于对照组。结论在不需要加入任何外源佐剂的情况下,本研究构建的融合免疫佐剂Lipo多肽的登革四价疫苗能够诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答,且以细胞免疫应答为主,为今后新型登革病毒四价疫苗的研究奠定了基础。     

登革1型病毒广州分离株全长E基因序列测定与分析

目的对两株登革1型病毒广州分离株(DV1-GZ01/03、DV1-GZ02/03)E基因进行序列测定及分析,了解此次分离的登革病毒流行株的可能来源及其生物学特性。方法应用RT-PCR扩增两分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,应用计算机软件与国内外参考株及流行株进行同源性分析,绘制系统进化树。并作毒株感染细胞及乳鼠毒力试验。结果两分离株全长E基因为1 485 bp,与登革1型Austria/83株的同源性最高,核苷酸同源性均达96.6%,氨基酸同源性分别达97.4%、97.8%;与登革1型GD23/95株次之。构建的系统进化树将19株登革1型病毒分为3个基因群。两分离株与Austria/83、GD23/95同属于基因型Ⅳ型,在同一进化分支内。两分离株颅内接种乳鼠均发病,但发病时间较晚。结论DV1-GZ01/03、DV1GZ02/03属于基因型Ⅳ型,与广东1995年流行株关系密切。乳鼠的神经毒性较弱可能与其基因变异有关。     

广州市2010年1、2、3型登革病毒E基因进化分析

目的 测定广州市2010年1、2、3型登革病毒的E基因序列,探讨其来源及基因型.方法 收集广州市2010年85例登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发育树,结合流行病学资料进行信息学分析.结果 85份血清标本中分离到1型和3型登革病毒株各6株,2型登革病毒2株,测序获得E基因序列.进化分析发现,1型和3型登革病毒分别来自不同的亚型,即亚洲型和南太平洋型,印度次大陆型和东南亚/南太平洋型;2型登革病毒来自马来西亚/印度次大陆型.结论 推测广州市2010年2型登革病毒为输入性.1型和3型登革病毒中各有4株为输入性,余各2株广州本地病例毒株尚须从蚊媒介来进一步证实其来源.     

广州地区2012年1、2型登革病毒基因型特征研究

目的 测定广州市2012年1、2型登革病毒(DENV 1、DENV 2)的E基因序列,探讨其来源及基因型。方法 收集广州市2012年478例登革热患者急性期血清478份,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发育树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 478例患者标本中分离到DENV 1 6株,DENV 22株,测序获得E基因序列,E基因长度均为1 485 bp,编码495个氨基酸,DENV 1碱基同源性为97.4%~99.9％,推导的氨基酸同源性为99.2%~100.0％,其同源性与2011、2006和2004年份的国内DENV 1流行株接近。DENV 2碱基同源性为91.3%,推导的氨基酸同源性为97.8%,其同源性与我国DENV 2流行株相对较远。进化分析发现,DENV 1均属于同一亚型,即亚洲型,DENV 2属于两个亚型,即马来西亚/印度次大陆和东南亚型。结论 推测广州市2012年DENV 1和DENV 2均为输入性,DENV 1可能由柬埔寨和广东佛山输入,DENV 2可能由孟加拉国和缅甸输入。     

温州市2019年新诊断HIV-1感染者的病毒基因型分析

目的 分析温州市2019年新诊断HIV-1感染者的病毒基因型,揭示亚型分布特点及流行趋势.方法 采集232例HIV-1感染者血浆样本,采用巢式PCR扩增pol区基因,于Los Alamos HIV database下载参考序列,构建系统进化树确定基因亚型,利用HIV Blast工具进行同源性分析.结果 获得199例感染...     

双抗原夹心ELISA法检测登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗体

目的 建立一种检测登革病毒(dengue virus, DENV)特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法?方法 利用毕赤酵母系统表达4个血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(envelope protein domain Ⅲ, EDⅢ),并采用改良过碘酸钠法对EDⅢ蛋白标记辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP),建立一种可同时检测4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白特异性抗体的双抗原夹心ELISA法?并对2014年广州珠江医院门诊和住院确诊的登革热患者血清标本进行检测,并与澳洲Panbio MAC ELISA检测的敏感性进行比较?结果 本研究成功建立了一种检测4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,该方法能同时检测到4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的小鼠血清和Ⅰ型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的兔血清,而与烟曲霉AF-MP蛋白免疫的小鼠血清和兔血清均无交叉反应?对184份健康人血清标本检测全为阴性,而对168份确诊为登革病毒感染患者血清标本检测结果表明,两种诊断方法检测结果差异无统计学意义,P<0.001(57.1% vs 57.7%),联合NS1抗原检测方法,其敏感性提高到97.6%?结论 双抗原夹心ELISA法检测登革病毒EDⅢ特异性抗体具有高度的特异性,但如果能同时联合抗原检测可明显提高登革热的早期诊断率?     

2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09 流感病毒基因特性分析

目的 分析海南省A(H1N1) pdm09亚型流感病毒的抗原性和基因特性,了解病毒的变异情况,为海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的防控提供依据.方法 选取14株2019-2020年海南省流感监测网络实验室分离到的A(H1N1)pdm09亚型流感病毒进行基因序列测定,测序结果用MEGA 10.1.8和DNAST...     

登革病毒E蛋白结构与功能的研究进展

登革病毒（Dengue Virus,DEN）为单股正链RNA病毒,是急性蚊媒传染病-登革热的病原体,属黄病毒科（Fla-viviridae）黄病毒属（Flavivirus）。按生物学和免疫学特性分为DEN—1、DEN-2、DEN-3和DEN-4四种血清型。各血清型均可引起登革热（Dengue fever,DF）和致死率很高的登革出血热（dengue haemorrhagic fever,DHF）以及登革休克综合征（dengue shock syndrome,DSS）。目前登革的预防主要依赖于切断蚊媒传播,尚无有效的疫苗用于其预防。     

登革病毒(NGC株)C与prM全长基因的扩增与克隆

目的　从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prM全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法　以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prM基因 ,T -A重组入pGEM -T载体 ,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定。 结果与结论　应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组 ,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和 prM基因     

蓝氏贾第虫分离株tim基因序列分析比较研究

为了探讨来源于不同地理位置贾第虫分离株之间的遗传学关系，采用ｔｉｍ基因扩增、限制性酶切和ＤＮＡ序列分析方法来自我国（Ｃ１、Ｃ２、ＣＨ２、ＣＨ３）、柬埔寨（ＣＡＭ）、澳大利亚（Ａ１、Ａ２）和美国（ＢＰ、ＣＡＤ）共９株蓝氏贾第虫的基因型进行了分析比较。结果表明，Ａ１、Ａ２和ＣＡＭ属第１型（ＷＢ）；ＣＨ３属第２型（ＪＨ）；Ｃ１、Ｃ２、ＢＰ和ＣＤＣ属第３型（ＧＳ）。本实验结果提示，虫株间遗传学关系并非由地