首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
以聚乙烯亚胺-β-环糊精为骨架偶联短肽CY11的转基因载体   总被引:2,自引:1,他引:1  
目的:以聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)作为载体骨架,用靶向于肿瘤表面成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的短肽CY11(CGMQLPLATWY)偶联于载体材料上,研究该载体材料的基因转染效率.方法:用琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯[N-succinimidy-3-(2-pyridyldithio) propionate,SPDP]将CY11偶联到PEI-β-CyD上,合成CY11-PEI-β-CyD.核磁共振氢谱(1H-NMR)、热重分析(TGA)对载体材料进行化学表征,凝胶电泳阻滞实验研究载体材料对质粒DNA的浓缩能力,MTT法测定载体材料的细胞毒性,在COS-7、Hela和B16细胞株上进行体外转染实验.结果:成功合成材料CY11-PEI-β-CyD,在N/P为4时能够有效地浓缩质粒DNA.在B16细胞上,材料CY11-PEI-β-CyD达到160 μg/ml时,细胞存活率仍高于80%.在CY11-PEI-β-CyD/DNA复合物在N/P为20∶1时,转染效率是对照组PEI-β-CyD的17倍.结论:CY11-PEI-β-CyD是具有低毒性、高转染且有FGFR靶向性的新型非病毒转基因载体.  相似文献   

2.
目的:以阿司匹林为配体的聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)生物复合材料,观察其理化特性和转基因功能.方法:通过N,N'-羰基二咪唑(1,1'-carbonyldiimidazole,CDI)将阿司匹林偶联到PEI-β-CyD载体材料上,制成PEI-β-CyD-ASP复合材料.用1H-NMR、FT-IR、UV和XRD对合成的载体材料进行了化学表征,用凝胶电泳阻滞实验观察PEI-β-CyD-ASP浓缩质粒DNA的能力,用MTT法在A293、B16、Hela细胞上对载体的细胞毒性进行评价,以及体外转染实验.结果:成功合成了以阿司匹林为配体的聚乙烯亚胺-β-环糊精复合材料,在N/P为4∶1时其能有效浓缩质粒DNA;而且其在A293、B16、Hela细胞上的毒性较低,在B16肿瘤细胞上表现出较高的转染效率.结论:以阿司匹林为配体的聚乙烯亚胺-β-环糊精复合材料是低毒、选择性高的非病毒基因载体.  相似文献   

3.
目的评估新型非病毒纳米基因载体聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)对软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2转染的有效性。方法体外培养软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2,MTT法观察并比较PEI-β-CyD和相对分子质量为25 000的聚乙烯亚胺(PEI25KDa)对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性。在不同的N/P(载体有效氮含量/外源基因有效磷含量)复合条件下,利用PEI-β-CyD和PEI25KDa分别转染C5.18细胞和C3H10T1/2细胞,倒置荧光显微镜结合流式细胞仪分析转染效率。结果 PEI-β-CyD对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性均小于PEI25KDa。PEI-β-CyD与PEI25KDa对C5.18细胞的转染效率比较,差异无统计学意义(P>0.05);PEI-β-CyD对C3H10T1/2细胞的转染效率显著高于PEI25KDa(P<0.05)。结论 PEI-β-CyD对于软骨细胞系C5.18及骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2是一种低毒有效的非病毒纳米基因载体,在软骨组织工程和细胞治疗研究及应用领域具有良好...  相似文献   

4.
目的:多肽MC10 (MARAKEGGGC)介导的聚乙烯亚胺-β-环糊精聚合物载体作为新型靶向性非病毒基因载体的研究.方法:低分子量的聚乙烯亚胺(PEI)通过羰二咪唑(1,1'-carbonyl-diimidazole,CDI)偶联β-环糊精(β-CyD)合成聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)作为载体骨架,用琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯[N-succinimidy-3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP]将MC10偶联到PEI-β-CyD上,制成新型转基因载体材料MC10-PEI-β-CyD.用核磁共振氢谱(1H-NMR)对载体的结构进行化学表征,凝胶电泳阻滞实验研究载体材料对质粒DNA的浓缩能力,透射电镜观察其浓缩质粒DNA后形成的微粒粒径.MTT法检测聚合物的毒性,用SKOV-3、A549和MCF-7细胞株进行体外转基因实验,确定MC10-PEI-β-CyD具有基因携带能力及靶向选择性.结果:成功地合成了MC10-PEI-β-CyD,且MC10-PEI-β-CyD在N/P为5时,能够有效浓缩质粒DNA,形成粒径约为(170±35)nm的微粒.结论:MC10-PEI-β-CyD具有低毒和高转基因效率,对Her-2受体的肿瘤细胞具有很好的靶向性.  相似文献   

5.
目的:选用聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸材料作为骨架偶联低分子量聚乙烯亚胺,以构建低毒、高效的新型非病毒性基因载体.方法:用聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸(PHPAG)为基本骨架,偶联低分子量的聚乙烯亚胺(PEI 1.8 kDa)形成聚-羟丙基-天冬氨酸-谷氨酸-聚乙烯亚胺(PHPAG-PEI 1.8 kDa)的载体材料.通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、粒径测定、凝胶体积排除色谱法(GPC)等化学物理方法,凝胶电泳阻滞实验、MTT细胞毒性实验、细胞转染等生物学实验,对聚合物的结构及性能进行研究.结果:成功合成载体材料PHPAG-PEI 1.8 kDa.通过1H-NMR证实材料PHPAG-PEI 1.8 kDa在5或6个氨基酸上能偶合1个PEI 1.8 kDa.GPC结果表明PHPAG、PHPAG-PEI 1.8 kDa 2种材料的分子量约为1.2×104.粒径检测结果显示,PHPAG-PEI/pDNA复合物的平均粒径为200 nm左右.凝胶电泳阻滞实验表明,PHPAG-PEI/pDNA复合物在N/P为3.5∶1时可以完全阻滞DNA.细胞毒性实验表明,在COS-7和A293 2种不同的细胞中,载体材料显示出较低的毒性,与对照组PEI 1.8 kDa相近.在B16细胞、Hela细胞上的转染实验表明,PHPAG-PEI/pCAG-Luc3的复合物在N/P为25∶1时的转染效率最高,高于对照组PEI 25 kDa.结论:PHPAG-PEI聚合物载体材料是一种有潜在用途的非病毒基因药物载体.  相似文献   

6.
目的:构建一种能有效抑制肿瘤,且具有一定转染效率的基因载体.方法:在二氯甲烷溶液中将PEG与PEI 600偶联,加入四氯化铂的乙醇溶液进行配位反应,生成PEG-PEI-Pt复合物.通过XRD、UV-VIS 和FT-IR对配位化合物进行结构表征.凝胶电泳阻滞实验测定PEG-PEI-Pt复合物对DNA的浓缩能力,MTT法测定其在Hela、B16、A293和COS-7细胞上的毒性,体外细胞转染实验测定其在A293和B16细胞上的转染率.结果:XRD、UV-VIS和FT-IR测定结果表明PEI 600与PEG的偶联和四氯化铂的配位成功.凝胶电泳组织实验表明PEG-PEI-Pt复合物在与DNA的质量比为0.4∶1时完全阻滞DNA的迁移;MTT结果表明四氯化铂的配位增加了复合物的毒性;体外转染结果表明该复合物的转染率比PEI 600高.结论:实验成功构建了络合四氯化铂的PEG-PEI基因新载体.  相似文献   

7.
目的:构建以香菇多糖为骨架材料键合低分子量聚乙烯亚胺的新型转基因载体,研究其在肿瘤细胞中的基因转染.方法:从香菇中提取香菇多糖作为载体骨架,1,1'-二羰基咪唑(CDI)作为交联剂,键合低分子量的聚乙烯亚胺(PEI 1.2 kDa)形成香菇多糖-聚乙烯亚胺(LNT-PEI)聚合载体材料.将叶酸(folic acid,FA)偶联到LNT-PEI上,形成具有肿瘤细胞靶向性的组装式基因载体LNT-PEI-FA.用核磁共振氢谱(1H-NMR)、傅里叶转换红外光谱(FT-IR)和热重分析(TGA)等对载体材料进行化学表征,以确定其结构.用凝胶电泳阻滞实验观察LNT-PEI-FA对质粒DNA的结合能力,MTT法检测聚合物的毒性,用TEM对LNT-PEI-FA/DNA复合物的粒径大小、形状等进行检测.在A293和B16细胞株上进行转染实验.结果:凝胶阻滞电泳结果显示,LNT-PEI-FA与DNA在W/W为1.8∶1时可以完全缩合DNA,在相同浓度下LNT-PEI-FA的毒性明显低于PEI 25 kDa;体外转染实验显示,在A293和B16细胞株上具有很高的转染效率,荧光素酶表达值分别为1×1010和1×107.结论:以香菇多糖为骨架材料键合低分子量聚乙烯亚胺形成的转基因载体是一种有潜在研究价值的新型非病毒转基因载体.  相似文献   

8.
用于基因递送的普朗尼克化聚酰胺-胺树状聚合物研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的合成P123修饰的聚酰胺-胺(PAMAM)聚合物,并研究其作为基因递送载体的可行性。方法合成及表征了普朗尼克P123修饰的PAMAM树状聚合物,选择A375、293T及HepG2细胞对其进行毒性实验(MTT法),选择HepG2细胞对其与质粒DNA形成的复合物进行转染实验,并与聚乙烯亚胺(PEI)以及未修饰的PAMAM进行比较。结果聚合物有较高的纯度,粒径电位结果表明复合物符合基因递送的要求,P123修饰PAMAM可以降低细胞毒性,增加细胞体外转染效率。结论 P123修饰的PAMAM是一种适用于基因递送的新型的聚合物载体。  相似文献   

9.
《新乡医学院学报》2015,(7):611-613
目的探讨分支状聚乙烯亚胺(PEI)作为载体对不同细胞株的转染效率和细胞毒性。方法培养人类胚胎肾细胞293T、人上皮癌细胞Hela、小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12。悬浮转染p EGFP质粒与PEI的复合物,利用荧光细胞计数法分析转染效率;悬浮转染p Luc(luciferase基因来自Renilla)质粒与PEI的复合物,利用分光光度计分析各细胞的荧光素酶活性;采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法分析PEI对293T、Hela、BMSC和PC12细胞的毒性,分析转染效率和细胞毒性之间的相关性。结果293T、Hela、BMSC和PC12细胞的转染效率分别为(92.1±4.5)%、(29.2±3.4)%、(21.5±2.1)%和(17.0±3.2)%。293T、Hela、BMSC和PC12细胞的荧光素酶活性分别是2.87×108、3.35×107、1.94×107和1.08×107RLU·mg protein-1。293T、Hela、BMSC和PC12细胞转染效率排序:293T>Hela>BMSC>PC12细胞。同时,MTT比色法结果表明细胞毒性排序:293T>Hela>BMSC>PC12细胞。转染效率与细胞毒性呈正相关(r=0.865,P<0.05)。结论 PEI对不同细胞株的转染效率和细胞毒性存在一定的正相关性。  相似文献   

10.
目的:研究合成的以聚乙烯亚胺(PEI)为内核、聚赖氨酸(PLL)为外围的星形嵌段共聚物PEI-g-PLL的基因载体性能。方法:将PEI-g-PLL与pDNA复合形成PEI-g-PLL/pDNA复合物,并用琼脂糖凝胶电泳和zeta电位粒径分析仪表征;CCK-8法检测聚合物的HEK293细胞毒性;检测复合物在HEK293转染后Luciferase表达量以评价其转染效率。结果:PEI-g-PLL能复合pDNA形成尺寸约为200 nm的复合物,在HEK293中有较高的转染效率和较低的细胞毒性。结论:合成的PEI-g-PLL可用作潜在的基因载体。  相似文献   

11.
目的 制备巯基烷基化壳聚糖(TACS)载基因纳米粒,并对其体外相关性质进行初步研究.方法 复凝聚法制备TACS/pDNA复合纳米粒子,并用透射电镜对其的形态和粒径进行观察和表征;凝胶阻滞分析观察其对基因的保护情况;以Lipofectamine 2000转染试剂作为阳性对照,检测其对人胚胎肾细胞(HEK293)的转染活性;四嚷氮唑盐(MTT)比色法测定其对细胞活性的影响.结果 TACS/pDNA复合纳米粒子形态不很均一,粒径在390 nm左右;凝胶阻滞分析证明了载体能有效地包裹和保护基因不受DNase Ⅰ酶的消化;体外基因转染实验证实了TACS纳米粒子能够有效地转染HEK293,其转染效率远高于壳聚糖纳米粒子,略低于脂质体;MTT测定其对细胞活力影响甚微,对细胞的毒性明显低于脂质体.结论 TACS有望成为一种有价值的新型基因载体.  相似文献   

12.
目的:对四种非病毒型聚阳离子载体材料的理化性质、体外细胞学及体内性质进行研究.方法:合成聚乙烯亚胺-环糊精(PEI-CyD)、聚乙烯亚胺-聚天冬酰胺(PEI-PHPA)和烷基胺-聚天冬酰胺(PEE-PHPA)等三种聚阳离子材料,用1H核磁共振对载体材料的结构进行确定;凝胶电泳实验研究了载体材料对质粒DNA的浓缩能力;粒径分析仪测定了载体材料结合DNA后的粒径及表面电荷.用MTT法在COS-7、A549、HEK-293和C6等细胞株上测定了四种载体材料的细胞毒性;在HEK-293细胞株上进行了体外细胞转染实验.进行了四种载体材料体内毒性、组织分布和体内携带报告基因转染实验.结果:1H核磁共振证实了它们的结构.在N/P小于40时,载体材料的平均粒径在100 ~250 nm,表面电荷在10 ~ 35 mV,适合体外细胞的吞噬.体外细胞毒性表明,PEE-PHPA在C6、COS-7、A549和HEK293细胞上的IC50值分别为21.5、20.2、7.30和37.1μg/ml,PEI 25 kD的IC50值分别为15.8、18.3、11.4和36.7μg/ml,PEI-CyD和PEI-PHPA在实验所测定的浓度范围中,细胞的存活率高于60%.四种聚阳离子材料都具有较强的DNA缩合能力,且有较好的体外基因转染能力.体内急性毒性实验表明,PEI-PHPA、PEE-PHPA载体材料为低毒性载体材料,其LD50值大于500 mg/kg,血项指标表明PEE-PHPA载体材料对肝、肾功能有轻微影响,体内分布显示,四种聚阳离子载体材料在肾富集较高.结论:PEI-CyD、PEE-PHPA和PEI-PHPA聚阳离子载体材料均有较好的体外基因转染能力,能够携带报告基因在体内表达,其中PEI-CyD和PEE-PHPA是具有应用前景的非病毒性基因药物载体.  相似文献   

13.
目的:构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽CP9修饰的聚乙烯亚胺(PEI),观察其理化特性和转基因功能。方法:通过琥珀酰亚胺-3-(2-嘧啶二硫)丙酸酯(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)]propionate,SPDP)将CP9偶联到PEI上,合成新型转基因载体CP9-PEI。用^1H-NMR和FT-IR验证CP9的偶联;用凝胶电泳阻滞实验、电镜和粒径检测,观察CP9-PEI浓缩质粒DNA的能力以及浓缩质粒DNA后形成的转染颗粒形态和粒径;通过CP9-PEI在人肝癌细胞株HepG2中的转染实验来验证CP9对PEI的转染效率的影响;通过游离CP9肽的竞争抑制实验验证CP9-PEI的整合素靶向功能。结果:CP9成功偶联到PEI上;CP9-PEI能有效浓缩质粒DNA,形成的转染颗粒形态为圆形或类圆形,在N/P比为10时,粒径约为200nm。CP9-PEI的转染效率是PEI的2倍,游离CP9肽能抑制CP9-PEI的转染效率。结论:修饰了CP9的PEI能有效增加转染效率,具有整合素的靶向能力,是一种具有应用前景的转基因载体。  相似文献   

14.
目的:研究氮磷比(N/P值)对非病毒基因载体聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,MSC)的影响,优化PEI/DNA复合物制备参数,为其应用于骨组织工程提供实验基础.方法:制备不同N/P值的含BMP-7基因的PEI/DNA复合物,测定复合物的粒径、Zeta电位以及PEI保护DNA抵御DNA酶消化的能力,检测复合物对MSC细胞的毒性以及转染表达BMP-7蛋白量.结果:当N/P值在3-30范围时,形成微粒粒径稳定在100 ~ 150 nm;当N/P值在5~ 30范围时,Zeta电位稳定在30 ~ 40 mV.当N/P值>3时,随着PEI的增加,PEI对DNA的保护功能增强.当N/P值为7~10时,可以获得最高的基因转染效率.当N/P值大于10时,细胞毒性明显增加.结论:N/P值为7~ 10时,含BMP-7基因的PEI/DNA复合物细胞毒性小,转染效率高.  相似文献   

15.
目的合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺聚合物作为非病毒转基因载体,并评价其毒性、压缩DNA的能力,携带报告基因转染细胞的能力。方法采用新方法合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合聚乙烯亚胺聚合物,通过核磁共振方法表征。将合成的新聚合物与DNA混合,得到新聚合物/DNA复合物,用琼脂糖电泳试验测定不同N/P比值形成复合物时对质粒DNA电泳的阻滞情况,评价其压缩DNA能力。透射电镜法检测复合物的大小,MTT法检测其对细胞的毒性作用,使用新聚合物携带报告基因转染细胞,并与PEI25000比较转染率。结果新聚合物压缩质粒DNA的能力随N/P比值增大而增强,在N/P比为6时可以完全阻滞质粒DNA的电泳,在N/P比为60时,复合物粒径约291 nm,复合物的表面电荷约14.6 m V。细胞毒性试验表明新聚合物与PEI25000相比毒性明显下降,携带报告基因转染MCF-7细胞转染效率与PEI25000相近。结论对叔丁基杯[4]芳烃酸聚乙烯亚胺新聚合物具有较强压缩质粒DNA能力,对细胞毒性低,转染效率高,是一种可应用于基因治疗的新型非病毒载体。  相似文献   

16.
PELA作为基因载体的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 研究可生物降解聚合物 PEL A作为控制释放的基因载体。方法 合成聚乳酸 -聚乙二醇二元共聚物(PEL A) ,包裹质粒 p CH110 ,探讨了 PEL A作为基因载体包裹 DNA的各种影响因素 ,这种控制释放体系的体外降解及释放行为以及对其细胞毒性及体外转染效率进行了测定。结果 制备的 PEL A微球平均粒径 1μm~ 3μm,包裹效率为6 2 %。采用包裹了质粒 p CH110的微球对 COS- 1细胞的细胞毒性及转染实验中得出 :PEL A的细胞毒性较小 ,转染效率较高 ,且能持续表达 96 h,缓释效果较明显。结论 可生物降解聚合物材料 PEL A作为基因载体具有较强的优越性  相似文献   

17.
目的 在聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)树状大分子与DNA形成复合物的基础上添加透明质酸(hyaluronic acid,HA)形成三元纳米复合物,研究其基因递送性能的改变.方法 配制不同电荷比的三元纳米复合物,测定其粒径和电位;选择MCF-7和MDA-MB-231细胞进行转染效率的测定,选择B16和MCF-7细胞进行细胞毒性的测定.结果和结论 形成的三元纳米复合物大小均一,结构稳定.与单纯的PAMAM载体相比,增加HA提高了转染效率,降低了细胞毒性,适合用于基因的递送和转染.  相似文献   

18.
目的研究腺病毒(Ad)介导mIFN-β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性.方法用Ad为载体将mIFN-β基因导入B16细胞,观察mIFN-β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变.结果当MOI为50~100,即可获得较高的转染效率,达90%±1%,转染细胞能表达分泌mIFN-β并具有生物学活性;AdmIFN-β感染对B16细胞的增殖能力无影响,但能显著提高细胞表面MHC-Ⅰ类抗原的表达.结论 Ad载体具有较高的转移效率,并能使其携带的mIFN-β基因有效表达;AdmIFN-β转染的B16细胞的免疫原性显著增强.提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的.  相似文献   

19.
目的:考察硬脂酸(SA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI)的细胞毒性及转染siRNA的性能.方法:硬脂酸通过羧基与伯氨基脱水缩合嫁接到PEI分子上;激光粒度仪检测粒径及zeta电位;MTT法评价PEI被修饰后的细胞毒性;流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标仪检测材料转染siRNA的性能.结果:修饰产物PEI-SA结合核酸分子前后粒径分别为(61.2±22.4) nm和(70.9±41.4)nm,zeta电位分别为(25.5±4.5)mV和(18.0±4.5) mV; PEI-SA浓度低于64μg/mL时没有细胞毒性,而修饰前的PEI浓度高于8 μg/mL时就有明显的细胞毒性;PEI-SA对siRNA的转染效率最高可达(94.7±1.3)%,高于修饰前PEI组及脂质体组;转染进入细胞的siRNA量随siRNA的浓度升高及转染时间增长而增多.结论:硬脂酸对PEI的修饰,降低了PEI的细胞毒性,增高了转染效率.PEI-SA可以作为一种有效的非病毒基因载体.  相似文献   

20.
目的:合成以金刚烷甲酸阿霉素(Ada-Dox)为客体,聚乙烯亚胺PEI600-γ-羟丙基环糊精(γ-hy-PC)为主体的超分子纳米材料,观察其理化特性和转基因功能.方法:通过主客体相互作用将Ada-Dox组装到γ-hy-PC材料上,制成γ-hy-PC/Ada-Dox的载药纳米粒子.用1 H-NMR、NOESY、UV-Vis、XRD、TGA对其结构进行表征,粒径和电势的测定和凝胶电泳阻滞实验观察其浓缩质粒DNA的能力,在人肝癌细胞BEL-7402和SMMC-7721细胞上对载体材料的细胞毒性进行评价,并进行细胞迁移和细胞形态学鉴定实验,在HEK293细胞上进行体外转染实验以及在BEL-7402细胞上进行细胞吞噬实验.结果:1H-NMR、NOESY、UV-Vis、XRD、TGA证实成功地合成了γ-hy-PC/Ada-Dox复合物;UV-Vis测得其载药量分别是0.5%和5.5%;载药量0.5%和5.5%的γ-hy-PC/Ada-Dox分别在N/P为3和4时可以浓缩质粒DNA;MTT实验结果显示材料的毒性均低于PEI 25 kDa;细胞迁移与H/E染色实验表明合成的材料都有一定的抗肿瘤活性;体外转染实验显示,γ-hy-PC具有较高的转染效率,且随着载药量的增加,转染效率逐渐降低;细胞吞噬实验结果表明γ-hy-PC/Ada-Dox可同时携带药物和FAM-siRNA进入细胞.结论:成功地合成了γ-hy-PC/Ada-Dox复合物,并表现出一定基因转染效率和抗肿瘤活性.  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号