肺泡Ⅱ型上皮细胞的生长状况及其转分化的鉴定

目的 观察肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)体外培养的生长状况及转分化过程.方法 通过差速贴壁法对原代培养的AECⅡ进行分离、纯化,并将AECⅡ随机分为第0天、第2天、第4天、第6天、第8天8个时间点.利用倒置显微镜观察细胞生长情况,记录细胞数目,绘制生长曲线;锥虫蓝染色观察细胞活力;流式细胞仪观察细胞生长周期和细胞凋亡情况;电子显微镜观察细胞超微结构;采用免疫荧光技术,共聚焦显微镜观察肺表面活性蛋白(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)的阳性表达.结果 倒置显微镜下第 0天、第2天、第4天、第6天及第8天细胞数分别为(4.02±0.99)×108L-1、(10.41±0.24)×108L-1、(27.90±1.91)×108L-1、(27.12±0.85)×108L-1及(26.29±1.59)×108L-1,第2天与第0天、第4天与第2天细胞数比较差异均有统计学意义(Pa<0.05).第2天、第4天、第6天及第8天的细胞活力分别为(97.00±0.71)%、(97.20±0.84)%、(95.00±0.71)%及(92.80±1.30)%,第6天与第4天、第8天与第6天比较差异有统计学意义(Pa<0.05).细胞周期:空气组细胞G1期、S期细胞所占比率分别在第6天、第4天最高,但各时间点与前一时间点比较差异均无统计学意义(Pa>0.05).细胞凋亡:空气组Annexin-V+/PI-亚群在第4天所占比例最高,与第2天及第6天比较差异均有统计学意义(Pa<0.05);Annexin-V+/PI+亚群细胞所占比例在第8天时最高,但与第6天比较差异无统计学意义(P>0.05),而第6天与第4天比较差异有统计学意义(P<0.05).细胞超微结构:第6天时可见介于AECⅡ和AECⅠ之间的中间状态细胞,此类细胞在细胞表面有微绒毛,但胞质内无板层小体或胞质内有板层小体但细胞表面无微绒毛.免疫荧光:第6天可见部分细胞胞质内有呈绿色荧光的SP-C阳性表达,荧光强度较第2天、第4天减弱,伴有胞膜点状分布的呈红色荧光的AQP5阳性表达,细胞表达强度不等,表达AQP5相对较弱的细胞表达SP-C的强度相对增强.结论 原代培养的AECⅡ在培养早期增殖能力最强,细胞增殖分化能力在培养晚期降低.体外培养的AECⅡ有向AECⅠ转分化的能力.     

高氧暴露对新生鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化水平的调节作用

目的 研究体内及体外高氧暴露对Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC Ⅱ)转分化水平的影响,旨在阐明支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)肺上皮损伤的发生机制.方法 新生Wistar大鼠生后随机分为对照组(吸入空气)和模型组(吸入氧浓度为85％),于7d、14 d、21 d进行动物模型肺组织取材并分离AECⅡ.细胞标本检测Ⅰ型肺泡上皮细胞(type Ⅰalveolar epithelial cells,AEC Ⅰ)特异性标志物水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)及AECⅡ标志物表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)表达.从正常新生鼠肺分离的AECⅡ在体外原代培养24h后随机分为常氧组(21％ O2)和高氧组(85％ O2),培养48 h后收集细胞,应用免疫荧光双标染色观察AQP5和SP-C表达及定位,Western blot方法检测AQP5和SP-C蛋白表达水平,荧光实时定量PCR方法检测AQP5和SP-CmRNA表达水平.结果 BPD模型组大鼠AECⅡ中AQP5蛋白表达从7d开始较对照组增多,SP-C蛋白表达从14 d开始较对照组减少.模型组中AQP5 mRNA从7d开始表达增多,SP-C mRNA从7d开始表达减少(P＜0.05),且随高氧暴露时间延长两组间差异更加显著.由正常新生鼠肺分离的AECⅡ进行体外原代培养后,免疫荧光双染可见高氧组较常氧组AQP5表达增多,SP-C表达减少,双染细胞明显增多.蛋白和mRNA定量检测结果均提示高氧组较常氧组AQP5表达增多,SP-C表达减少(P＜0.01).结论 无论体内还是体外高氧暴露下,AECⅡ特异性标志物SP-C表达下调,而AEC Ⅰ特异性标志物AQP-5表达上调,提示AECⅡ过度转分化参与高氧肺损伤后的修复过程.     

低浓度胶原酶差速消化法分离纯化小鼠Leydig细胞的研究

目的 建立简单快速获得Leydig细胞的分离纯化新方法.方法 分阶段应用低浓度胶原酶,采用差速消化法分离纯化小鼠睾丸内的Leydig细胞.将不同阶段获得的细胞分别培养,观察其原代生长情况.采用免疫荧光染色,观察培养的Leydig细胞内的标志性酶--3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、胆固醇侧链裂解酶(CYP11A1)和17α羟化酶(CYP17A1)的表达情况.结果 使用低浓度胶原酶短时间重复三次消化,以第二次消化获得的Leydig细胞纯度最高69.6%±4.16%,增殖能力最强.培养7 d后纯度增高至90%.原代培养的各个阶段均可检测到睾酮合成酶谱的表达.结论 应用低浓度胶原酶差速消化法可以获得大量高活力的Leydig细胞,原代培养效果理想,细胞功能保存完好.     

支气管肺发育不良新生鼠模型肺泡上皮细胞标志物的表达变化及意义

目的 研究高氧致支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)新生鼠模型中Ⅰ型肺泡上皮细胞(typeⅠalveolar epithelial cells,AECⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AECⅡ)特异性标志物表达变化及其意义.方法 80只新生Wistar大鼠,于生后12 h内随机分为模型组(吸入氧浓度为85%)和对照组(吸入空气),每组40只.于暴露第7、14、21天,分别进行肺组织HE染色观察病理学改变,免疫荧光双标染色观察AECⅠ标志物水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)及AECⅡ标志物表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)表达及定位,Western blot方法检测AQP5和SP-C的蛋白表达水平,real-time PCR方法检测AQP5和SP-C的mRNA表达水平.结果 模型组大鼠肺组织表现出肺泡数目减少,体积增大,结构简单化,肺泡间隔增厚,次级分隔减少等肺泡化障碍表现.免疫荧光双标染色可见,模型组AQP5及SP-C表达明显增多,表达位置紊乱,且双染细胞/SP-C阳性细胞的比例明显增高(P<0.001).与对照组比较,模型组中AQP5及SP-C蛋白表达从高氧暴露7 d开始增加,增高的趋势持续至21 d.模型组中mRNA表达水平,AQP5从暴露7 d开始,SP-C从14 d开始较对照组明显升高(P<0.05),且两组间差异随高氧暴露时间延长更加明显(P<0.05).结论 暴露高氧中的新生鼠BPD模型肺组织中,AECⅠ标志物AQP5及AECⅡ标志物SP-C均表达上调,发生转分化的AECⅡ明显增多,表明在BPD肺损伤后的修复中存在AECⅡ过度转分化现象.     

肺泡Ⅱ型上皮细胞原代培养及高体积分数氧-停氧对其细胞内钙离子水平的影响

目的 原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ),并动态观察高体积分数氧(高氧)-停氧对其细胞内钙离子([Ca2 ]I)的影响,为体外研究AECⅡ及阐明高氧肺损伤发病机制提供实验基础.方法 孕19 d SD大鼠麻醉消毒后超净台内剖腹取出所有胎鼠.用胎鼠肺组织进行AECⅡ分离、纯化及原代培养,倒置相差显微镜下观察其细胞的形态及生长状况.通过激光共聚焦显微镜观察其肺表面活性蛋白C(SP-C)免疫荧光的阳性表达鉴定AEC Ⅱ.鉴定为AECⅡ的细胞通以高氧(氧流量为3 mL/min,测氧仪检测氧体积分数为930～970 mL/L),持续约5 min后立即停氧,用激光共聚焦显微镜动态观察[ca2 ]I的变化情况,记录其随时间改变的动态变化曲线,同时观察钙离子荧光强度的变化并连续拍摄照片.结果 例置相差显微镜观察AEC Ⅱ呈岛状分布,铺路石状,细胞核及核仁明显,胞核圆形,胞浆内较多颗粒.激光共聚焦显微镜下可见AECⅡ胞浆中呈现绿色荧光的SP-C阳性表达.予AECⅡ高氧刺激时,[Ca2 ]I出现短暂下降后持续上升,上升至一定程度后又缓慢下降,甚至出现[Ca2 ]I耗竭现象,并维持该水平.予停氧刺激,[Ca2 ]I出现短暂下降后迅速上升,然后逐渐趋于平稳.随着[Ca2 ]I水平的增减,Ca2 荧光强度相应的增强或减弱.结论 高氧及给氧后停氧均可使[Ca2 ]I产生明显变化,可能是高氧导致AECⅡ损伤的重要途径之一.     

高体积分数氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞硫氧还蛋白及其还原酶表达的影响

目的 探讨高体积分数氧(高氧)对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)硫氧还蛋白(Trx)及硫氧还蛋白还原酶(TrxR)表达的影响.方法 无菌条件下取孕19 d SD大鼠的胎鼠肺组织,剪碎.采用1 g/L胰酶和1 g/L胶原酶消化19 d胎鼠肺组织块,经差速离心和反复贴壁法,分离、纯化、原代培养胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至亚融合状态时,随机分为空气和高氧组.于培养箱内静置30 min后,空气组置于同一室内空气中,高氧组通以1 000 mL/L纯氧(2 l/min)10 min;然后密封培养瓶,置培养箱中培养.二组分别培养12、24、48 h,倒置相差显微镜下观察高氧对其细胞形态及活性的影响;并采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其Trx mRNA和TrxR mRNA表达.采用SPSS 13.0软件进行组间两样本均数t检验.结果 细胞爬片上AEC Ⅱ纯度为(94±2)%,表明所获细胞适合研究使用.与空气组比较,随时间延长,高氧暴露各时间点AEC Ⅱ生长状态明显不良;悬浮细胞增多,但大多数细胞仍具有活力;高氧暴露可促使AEC ⅡTrx mRNA、TrxR mRNA表达增加,且二者分别于24 h(t=2.471 P=0.033)和48 h(t=2.916 P=0.015)表达最强.结论 高氧暴露可促使胎鼠AEC ⅡTrx mRNA和TrxR mRNA表达上调;Trx和TrxR的表达上调可能是高氧肺损伤的重要保护作用机制之一.     

婴幼儿血管瘤内皮细胞的体外培养及冻存

目的 研究婴幼儿血管瘤内皮细胞的体外分离培养及进行冷冻保存,探讨建立血管瘤内皮细胞库的可能性.方法 应用胶原酶消化结合免疫磁珠法分离获得血管瘤内皮细胞,以含20%胎牛血清的EGM-2培养液进行培养.vWF免疫荧光染色鉴定所培养内皮细胞及其纯度.按慢冻速融原则对血管瘤细胞进行液氮冻存、复苏,比较未冻存和复苏血管瘤内皮细胞的活力、形态、增殖能力、低密度脂蛋白摄取能力以及细胞凋亡率.结果 CD31免疫磁珠阳性分选获得高纯度的原代血管瘤内皮细胞,复苏后细胞存活率约为未冻存细胞的94.8%,二组细胞形态学无明显差异,生长曲线相似,增殖能力差异无统计学意义,冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高,但无统计学意义.结论 胶原酶消化结合免疫磁珠法能获得高纯度的血管瘤内皮细胞,冻存的血管瘤内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力,为血管瘤的后续实验研究提供了稳定的细胞来源.     

儿童松质骨成骨细胞体外培养

目的 探讨儿童松质骨成骨细胞体外培养条件，为儿童骨组织工程研究选择种子细胞。方法 均取自先天性髋脱位患儿加盖手术时多余髂骨，术前证实患儿无代谢性骨病，未服激素类等药物。取材在手术时进行，男1例，女3例，年龄3～7岁。骨块保持无菌，置于无血清培养液中，4℃冰箱存放，2～4h内分离骨细胞。将髂骨松质骨剪碎成骨粒，经胰蛋白酶初步消化后，采用胶原酶Ⅱ分次消化法，获取原代成骨细胞，将原代成骨细胞置于含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养，经传代、纯化后，绘制细胞生长曲线。成骨细胞的鉴定采用改良Goraori碱性磷酸酶(ALP)钙钴法染色、ABC法Ⅰ、Ⅲ型胶原染色及放射免疫法测定骨钙素含量。培养期间应用倒置相差显微镜观察细胞形态。结果经酶消化法得到的儿童成骨细胞，呈梭形，较饱满。原代细胞胞体较小，传代后可呈多角形、梭形或不规则形，胞浆内可出现黑色颗粒。ALP染色阳性率45％。初次酶消化后的松质骨块经培养后，还可以多次消化得到更加纯化的成骨细胞。结论 采用胰蛋白酶及胶原酶的多次消化法获取原代细胞，经培养、传代后，可得到较为稳定、纯化的儿童松质骨成骨细胞。     

免疫磁珠分离羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的实验研究

目的 探讨免疫磁珠分离羊水来源OCT-4阳性胎儿干细胞的可行性.方法 采用免疫磁珠细胞分选法去除羊水细胞中CD44和SSEA4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿干细胞间接得到分离,体外培养扩增后,观察细胞生长特性,免疫荧光染色计算OCT-4阳性胎儿干细胞得率,Real-TimePCR比较分离前后OCT-4表达量的差异,免疫组化检测NANOG、AKP、MAP-2、NGFR和Myosin等细胞因子的表达.结果 经免疫磁珠分离的细胞接种12h内贴壁生长,形态呈梭形,部分呈多角形,融合后形成辐射状排列.免疫荧光染色OCT-4阳性细胞得率为(90.15±8.25)%,Real-TimePCR检测结果显示分离后细胞OCT-4的表达量较未分离细胞和MSC有显著性差异(P＜0.01).原代培养可获得(1～2)×107个细胞,3代可获得(2～4)×108个细胞,传至10代以后细胞的增殖能力下降.免疫组化结果显示OCT-4阳性胎儿干细胞表达NANOG、AKP、MAP-2和NGFR等细胞因子.结论 免疫磁珠细胞分选法可以从羊水中分离出OCT-4阳性的胎儿干细胞,分离后的细胞保持干细胞原有特性及生物学特征,可作为组织工程种子细胞.     

新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离培养与鉴定

目的 探讨新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养及鉴定方法 ,为早产儿肺损伤体外研究提供实验手段.方法 取出生24 h内新生Wistar大鼠肺组织,用胰酶和胶原酶消化,经离心和免疫吸附法纯化后培养.采用透射电镜和免疫荧光技术进行鉴定.结果 体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞18～24 h贴壁,呈多角形,岛状生长.培养24～48 h细胞体积增大,胞浆内颗粒明显,72 h后细胞内颗粒减少,6～7 d细胞失去正常形态.透射电镜可见特异性结构板层小体,免疫荧光可见表面活性蛋白C表达.结论 该方法 是一种有效分离和纯化新生鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法 ,可用于肺泡Ⅱ型上皮细胞功能及早产儿肺损伤的体外研究.     

早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞与成纤维细胞共培养模型的建立

目的建立早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,为研究肺发育和肺损伤时AECⅡ和LF的相互作用提供实验基础。方法分离、纯化胎鼠AECⅡ和LF,通过插入式培养皿和培养板来构建AECⅡ-LF共培养模型。AECⅡ以5×105／mL的密度接种到6孔板中,LF以1×106／mL的密度接种到PCF插入式Millicell培养皿中,以6孔板中不放入套皿单独培养的AECⅡ为对照。用倒置显微镜观察AECⅡ形态和基本生长情况,台盼蓝染色了解细胞成活情况,免疫细胞化学染色法检测AECⅡ Ki67表达。结果早产大鼠AECⅡ和LF共培养模型成功构建。共培养2 d与单独培养2 d相比,AECⅡ的形态、活力和增殖无明显差异。共培养4 d,AECⅡ仍可保持其细胞形态,细胞数目、细胞活力;AECⅡ Ki67表达较单独培养4d 明显增加。结论体外构建的早产大鼠AECⅡ与LF共培养模型,部分模拟了体内微环境。AECⅡ和LF共培养体系有利于保持 AECⅡ的增殖和分化功能,可用于体外研究肺发育和肺损伤时AECⅡ和LF的相互作用。     

促炎症细胞因子对新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞相关生长因子表达的影响

目的 建立出生后1～3 d新生猪肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)体外分离纯化及鉴定方法,探讨促炎症细胞因子对AEC-Ⅱ长因子(GFs)的影响,比较不同消化酶溶液、纯化方法获得细胞产量、活力及AEC-Ⅱ纯度的差异.方法 原代培养AEC-Ⅱ24 h给予不同浓度IL-1β、IL-6刺激48 h,观察AEC-Ⅱ增殖变化,RT-PCR检测胰岛素样生长因子-1(IGF-Ⅰ)、血小板源性生长因子(PDGF)、表面活性物质蛋白(SP)-A及-B mRNA的表达情况,并检测IGF-Ⅰ抗体对AEC-Ⅱ增殖及SP-A、SP-B mRNA表达的影响.结果 30000 U/L弹力蛋白酶/0.1%胰酶在37℃下消化新生猪肺组织20 min获得细胞产量为(5.33±0.54)×106/g(肺重+心重),显著高于其他各组(P<0.01).免疫黏附法纯化AEC-Ⅱ产量明显高于Percoll法,为(38.0±28.0)×106/头新生猪.AEC-Ⅱ原代培养24～96 h状态最佳.随IL-1β、IL-6刺激浓度升高,AEC-Ⅱ增殖能力及IGF-Ⅰ及SP-A mRNA表达水平降低,但PDGF、SP-B mRNA的表达无明显变化.IGF-Ⅰ抗体刺激下,AEC-Ⅱ增殖能力及SP-A、SP-B mRNA表达水平均降低.结论 IL-1B、IL-6可能通过调节AEC-Ⅱ中IGF-Ⅰ mRNA的表达影响细胞的增殖及功能.     

γ泌肽酶抑制剂对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch信号通路的影响

目的 探讨γ泌肽酶抑制剂在肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)与肺成纤维细胞(LF)共培养胎鼠模型中对Notch信号分子表达的影响.方法 应用Millipore插入式培养皿和Costar 6孔板构建AEC Ⅱ/LF共培养胎鼠模型.应用免疫组织化学法分别检测其细胞表面标志物表面活性蛋白C(SP-C)鉴定AEC Ⅱ、LF.锥虫蓝拒染实验检测AECⅡ、LF活力后将γ泌肽酶抑制剂加入最低必需培养基(MEM)(终质量浓度为0.2 g/L)作为实验组,未加入者为对照组.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)在基因和蛋白水平检测二组在培养24、48、72、96 h AECⅡNotch受体、转录调节因子DNA结合蛋白(CBF-1)及转录因子分裂增强子(HES-1)表达.采用SPSS 11.5软件进行组间t检验和组内单因素方差分析.结果 原代培养AECⅡ纯度(94.7 ±1.9)%,细胞活力为(96.2 ±2.5)%;LF纯度(97.2±1.4)%,细胞活力为(98.5 ±2.6)%.实验组CBF-1 mRNA及CBF-1蛋白在24、48、72、96 h与对照组比较均无显著变化(Pa＞0.05),实验组Notchl mRNA在24、48、96 h,Notch3 mRNA在48、72、96 h较对照组均显著降低(Pa＜0.05),HES-1 mRNA及蛋白在各时间点均显著降低(Pa＜0.05,0.01).结论 γ泌肽酶抑制剂可部分阻断胎鼠AEC Ⅱ发育中的Notch信号通路传导,其机制可能通过非CBF-1依赖途径.     

需肌醇酶1介导的内质网应激通路参与高氧所致早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡

目的探讨需肌醇酶1(IRE1)介导的内质网应激通路与高氧暴露肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)凋亡的关系。方法原代培养早产大鼠AECⅡ,随机分为空气组和高氧组,建立高氧细胞损伤模型。在24、48及72h收集细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态变化;AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR及Westernblot分别检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、IRE1、X盒结合蛋白1(XBP1)及C/EBP同源蛋白(CHOP)m RNA及蛋白表达;免疫荧光检测CHOP表达。结果随着给氧时间延长,高氧组AECⅡ伸展呈不规则形,出现空泡样改变;高氧组AECⅡ凋亡率与同时间点空气组比较明显增加(P0.05);随着氧暴露时间延长,高氧组GRP78、IRE1、XBP1及CHOPm RNA及蛋白表达升高,且较同时间点空气组明显上升(P0.05);高氧组CHOP荧光强度高于同时间点空气组。高氧组CHOP蛋白表达与AECⅡ凋亡率、IRE1及XBP1蛋白表达呈显著正相关(r=0.97、0.85、0.88,均P0.05)。结论高氧所致AECⅡ凋亡可能是通过激活IRE1-XBP1-CHOP通路来实现。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养与鉴定

目的通过改进和优化神经干细胞(NSCs)的体外培养方法,为进一步研究NSCs的生物学行为提供基础。方法孕14 d的美国癌症研究所(ICR)小鼠,无菌条件下剪取前脑皮质,采用机械法分离原代细胞进行培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代和培养。以1%胎牛血清诱导分化。应用免疫荧光方法行巢蛋白(nestin),β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对培养的细胞进行鉴定。结果从胚胎小鼠前脑皮质中分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈nestin免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-tubulinⅢ和GFAP阳性细胞。结论机械法分离胚胎小鼠前脑皮质细胞,机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代和培养,能够成功获得胚胎小鼠前脑的NSCs。     

人类胎儿和新生大鼠小肠上皮细胞的分离培养方法

人类胎儿和新生大鼠小肠上皮细胞的分离培养方法戴定威，吴圣楣，廖贤平，李敏采用胎龄４～５个月经水囊引产的胎儿和出生后６天内Ｗｉｓｔａｒ大鼠的小肠，联合应用粗胶原酶和中性蛋白酶消化小肠组织小块，可简便快速地获取大量活率高的小肠上皮细胞。牛皮胶原或鼠尾胶原...     

骨髓间充质干细胞在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的分化

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)在先天性脊椎裂胎鼠脊髓中的存活与分化,探寻细胞替代治疗先天性脊椎裂的方法。方法用贴壁培养法进行大鼠MSC原代培养并传代,携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒转染第3代骨髓MSC。将转染的MSC注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中。母鼠孕20 d时取先天性脊椎裂胎鼠的脊椎,固定脱水后做冷冻切片,免疫荧光方法检测脊髓中EGFP阳性MSC中巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果骨髓MSC中CD90阳性细胞占99%,CD44阳性细胞占95%,不表达CD34。腺病毒-EGFP转染骨髓MSC的转染率为61%。致畸组显性脊椎裂胎鼠占64.3%。移植的MSC存在于脊髓表面或进入脊髓中,部分细胞变为长梭形或多角形。免疫荧光法检测结果显示移植到脊髓中的MSC可表达神经干细胞的标志物Nestin和神经胶质细胞的标志物GFAP。结论带有EGFP的MSC经细胞移植后能在胎鼠脊髓内存活,并能分化为神经干细胞和神经胶质细胞。     

免疫磁珠法及羟乙基淀粉法分离脐血单个核细胞的比较

目的：该实验比较了CD133免疫磁珠法及羟乙基淀粉法分离脐血单个核细胞（MNCs）的特点,探讨一种相对较好的MNCs分离方法。方法：取2007年10月至2008年3月新疆医科大学第一附属医院足月妊娠健康产妇的脐血15份,每份脐血分别用羟乙基淀粉沉淀法、CD133免疫磁珠法处理。分离后计数并在倒置显微镜下观察原代细胞的生长情况及其形态特征,原代第30天通过流式细胞仪检测CD34阳性率。结果：羟乙基淀粉沉淀法、CD133免疫磁珠组得到的MNCs数量分别为（15.23±4.30）×106/mL,（0.066±0.027）×106/mL（P＜0.05）。羟乙基淀粉沉淀法所得细胞大多悬浮生长,传代后生长缓慢;CD133免疫磁珠法的细胞生长状态良好,其CD34阳性率分别为10.1％、0.5％。结论：羟乙基淀粉沉淀法是一种高效的脐血细胞分离方法,但细胞生长状态欠佳;而 CD133免疫磁珠法所获细胞纯度较高,可根据不同要求选用相应分离法。［中国当代儿科杂志,2009,11（9）：757-760］     

先天性肾盂输尿管连接部梗阻患儿积水肾脏中水通道蛋白1-4的表达

目的 观察先天性肾盂输尿管连接部梗阻患儿积水肾脏中水通道蛋白l-4(aquaporin,AQP1-4)的表达及其与积水程度之间的关系.方法 收集22例接受肾盂成形术和肾造瘘术的先天性肾盂输尿管连接部狭窄(pyeloureteral junction obstruction,PUJO)患儿的肾组织标本,并将其按照静脉肾盂造影(intravenous pyelography,IVP)显影时间的长短分为两组.轻度肾积水组(10例;IVP60min内显影)和重度肾积水组(12例,IVP 60min内不显影).8例正常肾组织标本来自于肾母细胞瘤周围正常肾组织.免疫组织化学技术检测AQPl-4在正常肾脏和积水肾脏中的表达与定位.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AQP1-4 mRNA在正常肾脏和积水肾脏中的表达水平.结果 AQP1阳性着色主要分布于肾小球毛细血管内皮细胞、近曲小管的上皮细胞及髓袢降支细段上皮细胞胞质,AQP2阳性着色主要分布于肾脏集合管上皮细胞胞膜和胞质,AQP3阳性着色主要分布于肾脏集合管主细胞的基底侧,AQP4阳性着色主要分布于肾内髓集合管上皮细胞基底侧.而积水肾脏AQP1-4表达均有不同程度下降.RT-PCR显示重度肾积水中AQPl-4的相对表达量显著低于轻度肾积水和正常对照组(AQP1:0.194±0.118比0.598±0.092比0.858±0.122;AQP2:0.247±0.089比0.566±0.105比0.976±0.134;AQP3:0.426±0.126比0.741±0.074比1.006 ±0.084;AQP4:0.171±0.115比0.420±0.081比0.739±0.201;P＜0.01).结论 AQP1-4在先天性PUJO患儿积水肾组织中的表达水平降低,且随着积水程度的加重而下降,表明其在肾积水发展的过程中可能与肾脏浓缩稀释功能的下降有一定的关系.     

Matrigel胶对高氧损伤早产鼠肺泡Ⅱ型细胞黏着斑激酶表达变化及其对肺泡Ⅱ型细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨人工重组基底膜Matrigel胶对高氧暴露下早产鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial CellⅡ,AECⅡ)黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表达变化及其对AECⅡ增殖、凋亡的影响.方法 原代培养早产鼠AECⅡ,建立高氧细胞模型,采用免疫印迹分析Matrigel胶对AECⅡFAK蛋白、磷酸化FAK( FAK- Tyr397)蛋白、FAK mRNA表达的影响,以了解Matrigel胶对FAK活性的调节作用;并进一步用细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫细胞化学法和原位缺口末端标记(TUNEL)法分别检测FAK抑制和激活状态下AECⅡ增殖和凋亡状况.结果 接种于Matrigel胶后,AECⅡFAK蛋白、FAK-Tyr397蛋白及FAK mRNA表达水平均明显增加;与空气对照组比较,高氧暴露12h时,AECⅡPCNA表达强度明显下降(0.1498±0.009 vs 0.0953±0.006,P＜0.05),TUNEL标记细胞明显增多(1.232 ±0.6 Vs 13.40±3.2,P＜0.01);接种于Matrigel胶后AECⅡ凋亡指数差异无统计学意义,而PCNA表达强度明显增强(0.1498±0.009 Vs 0.1921±0.008,P＜0.01).与高氧组比较,高氧+Matrigel组AECⅡPCNA表达明显增高(0.0953±0.006 Vs0.1125±0.012,P＜0.05),凋亡指数明显下降(13.40±3.2 Vs 7.641±1.6,P＜0.05).结论 高浓度氧抑制AECⅡ增殖、诱导其凋亡,并抑制AECⅡFAK的表达;Matrigel胶具有抑制AECⅡ凋亡、促进AECⅡ增殖作用,对高氧暴露下AECⅡ具有保护作用,且与其促进FAK表达和活化有关.