单耐利福平结核分枝杆菌耐药分子机制研究

目的 探讨单耐利福平结核分枝杆菌中耐药相关基因突变以及药物外排泵两种不同耐药机制的功能。 方法 从国家结核病参比实验室2007-2008年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐利福平的菌株23株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因rpoB突变情况。提取rpoB无突变菌株的RNA后反转录并采用real-time PCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量,对比菌株最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）实验结果,筛选可能与利福平药物外排相关的基因,并选用大肠埃希菌为模式生物,构建表达载体,检测过表达目的外排泵的大肠埃希菌对利福平的耐药程度以验证。结果 在23株单耐利福平的菌株中,有16株（69.6%）检测到rpoB突变,其中包括531位点突变9株,526位点突变6株及533位点突变1株。Ser531Leu、His526Asp表现为高浓度耐药,其MIC分别为192 μg/ml和256 μg/ml;而突变类型His526Gly、His526Leu、His526Arg和Leu533Pro表现为低浓度耐药,其MIC分别为0.75 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml和0.5 μg/ml。在rpoB未突变菌株中,通过real-time PCR发现Rv2936、Rv0783和Rv0933的转录水平与MIC呈正相关。在对照组和转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌中MIC均为 8 μg/ml,而转入pEASY-E1-Rv2936和 pEASY-E1-Rv0783的大肠埃希菌的MIC均有不同程度的提高,分别为32 μg/ml和16 μg/ml。结论 不同耐药突变类型导致的耐药程度不同,Rv2936和Rv0783可能是与利福平耐药相关的的药物外排泵基因。     

肛肠手术切口感染病原菌对喹诺酮类药物耐药性及机制分析

目的研究喹诺酮类药物对肛肠手术切口病原菌感染治疗效果及相关机制,为临床用药提供依据。方法选取2016年1月-2017年12月北京地区316例肛肠手术患者临床资料,无菌采集患者手术切口处脓液或分泌物,全自动微生物鉴定系统进行菌株鉴定,K-B纸片法测定受试菌株对萘啶酸、诺氟沙星,左氧氟沙星,环丙沙星和加替沙星敏感性。采用微量稀释法测定大肠埃希菌对萘啶酸、诺氟沙星,左氧氟沙星,环丙沙星和加替沙星敏感性。利用PCR方法检测大肠埃希菌gyrA、gyrB、parC、parE、OmpC和OmpF基因并进行测序。结果 316份标本中共有52份标本病原菌培养呈阳性,阳性率16.46%。分离出52株病原菌中革兰阴性菌46株,革兰阳性菌5株,真菌1株。革兰阴性菌中大肠埃希菌35株,变形菌属5株,克雷伯菌属4株,肠杆菌属2株;革兰阳性菌中葡萄菌属3株,肠球菌属2株;真菌为假丝酵母菌。经ESBLs确证试验共筛选出产ESBLs大肠埃希菌16株,检出率为45.71%。革兰阴性菌分离株对萘啶酸、诺氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星和加替沙星耐药菌株为:34、25、18、17和9株,耐药率分别为73.91%、54.35%、39.13%、36.96%和19.57%。革兰阳性菌分离株仅对萘啶酸和诺氟沙星耐药,分别为3株和1株。成功扩增出gyrA、gyrB、parC、parE、OmpC和OmpF基因。gyrA发生错义突变分别为Ser83→Leu、Ala84→Pro、Asp87→Asn和Asp87→Gly;gyrB发生错义突变分别为Phe361→Try、Glu470→Asp、Ser492→Asn;parC发生错义突变分别为Ser80→Ile、Glu84→Lys;parE发生错义突变分别为Asp420→Asn、Ala425→Val、Ser458→Ala;OmpC发生错义突变分别为Asp18→Glu,Val29→Lys和Ser64→Glu。讨论大肠埃希菌是肛肠手术切口感染的主要病原菌,大肠埃希菌喹诺酮类耐药决定区基因突变是对喹诺酮类抗生素产生耐药的主要原因,孔蛋白OmpC基因突变会导致大肠埃希菌对药物敏感性下降。     

耐药基因和药物外排泵在广泛耐药结核分枝杆菌中的作用初探

目的 初步探讨2种主要的耐药机制在广泛耐药(XDR)MTB临床分离株中的作用.方法 提取XDR-MTB临床分离株基因组DNA,采用PCR法扩增耐药相关基因,测序后分析其突变位点.根据XDR-MTB分离株KZN605的15个特有单核苷酸突变位点设计引物扩增后测序比对.检测药物外排泵抑制剂利血平、羰基氰化氯苯腙和盐酸维拉帕米对XDR-MTB分离株最低抑菌浓度(MIC)值的影响.结果 10株XDR-MTB菌株在rpoB、katG和rpsL位点均检测到突变,9株分离株在gyrA位点检测到突变,2株在gyrB位点检测到突变,6株分离株在rrs位点检测到突变,未检测到tlyA位点突变;未检测到大部分KZN605株特异的单核苷酸突变位点;药物外排泵抑制剂利血平导致1株XDR-MTB分离株的氧氟沙星MIC值降至原MIC的1/16,其余MIC值均无明显变化.结论 耐药相关基因突变是XDR-MTB分离株耐药的主要机制,药物外排泵可能部分参与氟喹诺酮类药物的耐药机制.     

大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC调控基因的表达与季铵盐化合物抗性关系的研究

目的研究大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC的调控基因marR、marA、soxS、rob在季铵盐化合物(quaternary ammonium compounds,QACs)耐药中的作用。方法取6株大肠埃希菌临床分离株,应用苯扎溴铵进行诱导,采用琼脂稀释法检测菌株在加入外排泵抑制剂氰化羰基-3-氯苯腙(Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)前后对苯扎溴铵的敏感性;PCR扩增外排泵调控基因marR、marA、soxS、rob并测序;采用实时荧光定量PCR检测marR、marA、soxS、rob基因的转录水平。结果 5株诱导株的苯扎溴铵最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)较其亲代增高4～8倍;加入外排泵抑制剂后11株菌的苯扎溴铵MIC值较加入前下降50.00%～99.61%,且诱导后的菌株下降率显著高于诱导前(Z=-2.943,P=0.003),5株诱导株的MIC值较其亲代下降50.00%以上;4株诱导株marA基因的转录水平较其亲代增高17～33倍,5株诱导株marR基因的转录水平较其亲代增高1～10倍(P0.05);12株菌中有10株菌外排泵调控基因marR存在142位Tyr的缺失,11株菌marA基因存在145位Ser缺失和Met1Val突变,10株菌soxS基因存在Ser12Ala突变。结论 marA基因转录增加致外排泵AcrAB-TolC的高表达与季铵盐化合物对大肠埃希菌的抗性产生可能有一定关联。     

结核分枝杆菌对左氧氟沙星与莫西沙星的交叉耐药性及gyrA和gyrB基因突变分析

目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对左氧氟沙星(levofloxacin,LVF)与莫西沙星(moxifloxacin,MXF)的交叉耐药性,分析gyrA和gyrB基因突变位点分布及突变位点与耐药水平的关系。方法采用改良罗氏培养基检测MTB标准菌株H37Rv、66株LVF耐药和55株LVF敏感的MTB临床分离菌株LVF和MXF的最低抑菌浓度(minimal inhibition concentra-tion,MIC)。通过PCR直接测序法测定gyrA和gyrB耐药基因片段。结果 MXF的MIC比LVF低2~4倍,MXF抗MTB菌株的活性是LVF的2~4倍。MTB标准菌株H37Rv未见gyrA和gyrB基因突变。66株LVF耐药和55株LVF敏感菌株均存在gyrA AGC95ACC(Ser→Thr)突变;55株LVF敏感菌株gyrA和gyrB基因未见其他突变。66株LVF耐药菌株中,40株(60.6%)gyrAGAC94(AAC或GGC或GCC或CAC或TAC)(Asp→Asn或Gly或Ala或His或Tyr)突变;19株(28.8%)gyrA GCG90GTG(Ala→Val)和1株(1.5%)gyrA GCG90AAG(Ala→Lys)(未见报导)双碱基突变;3株(4.6%)gyrA TCG91CCG(Ser→Pro)突变;1株(1.5%)gyrB GAC500AAC(Asp→Asn)突变;2株(3.0%)呈gyrA GAC94(AAC或GCC)(Asp→Asn或Ala)与gyrB GGG551AGG(Gly→Arg)(未见报导)双位点突变。gyrA GAC94(AAC或GGC)(Asp→Asn或Gly)突变引起FQs药物较高水平耐药;GAC94GCC(Asp→Ala)和GCG90GTG(Ala→Val)突变引起FQs药物较低水平耐药。结论 LVF与MXF之间存在交叉耐药,MXF MIC随LVF MIC增高而增高,但耐药水平不同。GyrA基因突变位点可能与耐药水平有关,有可能根据基因突变的位点分析耐药水平。     

外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙对多重耐药大肠埃希菌的耐药性影响

目的 探讨外排泵抑制剂羰酰氰间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)对多重耐药大肠埃希菌的耐药性影响.方法 采用纸片扩散法(K-B法)进行71株大肠埃希菌对6种抗菌药物的药物敏感性检测,用PCR技术检测受试菌株携带的acrA和acrB基因,用常量肉汤稀释法测定2种氟喹诺酮类抗菌药物对大肠埃希菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations,MICs),并对比加入CCCP前后的MICs值.结果 71株大肠埃希菌对3类6种抗菌药物耐药,其中对环丙沙星耐药率最高(73.24％),对氨曲南耐药率最低(30.99％),耐药模式以多重耐药为主(52.11％);外排泵基因acrA和acrB在多重耐药菌株中阳性率高达91.89％和81.03％;加入CCCP前后多重耐药菌株和敏感菌株的MICs值变化差异有统计学意义.结论 主动外排泵抑制剂CCCP能够降低氟喹诺酮类抗菌药物对多重耐药大肠埃希菌的MICs.     

结核分枝杆菌DNA促旋酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物的相关性研究

目的 分析MDR TB结核分枝杆菌临床分离株的DNA促旋酶（gyr）基因突变特点,初步探究MDR-TB对氟喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变的相关性.方法 采用最低抑菌浓度（MIC）法筛选MDR-TB,对17株临床MDRTB菌株应用DNA直接测序法检测gyr基因的突变情况,分析细菌基因突变与耐药产生的相关性.结果 Mtb 1株标准菌株（H37Rv）未见gyr A亚单位基因（gyrA）和gyr B亚单位基因（gyrB）基因突变,所有17株临床菌株gyrA均存在95位AGC→ACC.12株耐环丙沙星和左氧氟沙星菌株中,10株gyrA产生了错义突变,突变率为83.3％;突变位点位于89位、90位、91位和94位;1株发生了gyrB突变,突变位点位于500位.耐莫西沙星的9株耐药株中,8株gyrA发生突变,占88.9％.结论 gyrA基因突变是Mtb对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA的错义突变主要发生在第89位、90位、91位、94位密码子上.     

中国部分地区产超广谱-β内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌qnrA基因的检测

目的明确我国部分地区产超广谱-β内酰胺酶（ESBL）大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中qnrA基因的存在状况。方法PCR扩增产ESBL菌株，包括263株大肠埃希菌和99株肺炎克雷伯菌的qnrA基因；测序分析其基因序列。琼脂稀释法测定10种抗菌药物对qnrA基因阳性菌株的最低抑菌浓度（MIC）。接合实验和Southern杂交进行基因定位。脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析qnrA基因阳性株的同源性。结果263株大肠埃希菌中有5株检出qnrA基因，占1，9％；99株肺炎克雷伯菌中有8株检出qnrA基因，占8，1％。13株qnrA阳性株中qnrA基因均位于可接合性质粒上。13株菌株同时携带CTX—M基因（1株CTX—M-9、5株CTX—M-14和7株CTX—M-24）。qnrA基因阳性的接合菌与受体菌J53相比，环丙沙星对前者的MIC较后者提高了4～133倍。11株环丙沙星耐药株（MIC≥4mg／L）均存在GyrA亚基的83位氨基酸和（或）87位氨基酸改变，其中8株对环丙沙星高水平耐药株（MIC≥16mg／L）同时存在ParC亚基的80位氨基酸改变。2株MIC分别为4mg／L和2mg／L的菌株GyrA和ParC两亚基均未发生改变。结论肺炎克雷伯菌中qnrA基因的携带率高于大肠埃希菌。qnrA基因单独作用仅导致低水平喹诺酮类耐药，合并gyrA和（或）parC突变导致喹诺酮类高水平耐药。     

多药耐药大肠埃希菌老年患者分离株抗菌制剂11种外排泵基因研究

目的了解多药耐药大肠埃希菌中外排泵基因的存在情况。方法微量稀释法检测耐药菌株的药敏结果,采用聚合酶链反应（PCR）扩增法,检测11种抗菌制剂外排泵基因：emrB、emrD、emrE、mdfA、sugE、mdtI、tehA、oqxA、qacE△1、qacEs、mr-2等11种抗菌制剂外排泵基因,扩增产物纯化后基因测序。结果大肠埃希菌对阿米卡星耐药率为60%,对复方新诺明耐药率为95%,对第三代头孢菌素耐药率为100%（均为产ESBLs菌株）,外排泵基因检出率分别为emrB 95.0%、emrD 75.0%e、mrE 50.0%、mdfA 80.0%、sugE 70.0%、mdtI 80.0%、qacE△1 80.0%、tehA 80.0%、oqxA 15.0%,qacE、smr-2基因均未检测到,最少者检出1种基因,最多1株检出9种基因。结论本组分离的大肠埃希菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素等抗菌药物呈多重耐药,可能与细菌携带多种抗菌制剂（包括灭菌剂、消毒剂、抗菌药物等）外排泵基因相关。     

多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组耐药基因检测

目的检测1株多耐药大肠埃希菌NB8株的遗传学背景。方法病原分离自2012年4月宁波市第一医院住院患者尿液,作16S rDNA和gyrA基因测序、BLASTn比对确认为大肠埃希菌,采用Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM两种大规模并行测序仪进行全基因组分析,再行人工测序。最后NB8株和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌耐药基因的比较基因组学研究。结果多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组测序得到一条推定的染色体序列,长4 550 369 bp (内含14个缺口),得到一条推定的质粒序列,长635 377 bp(内含33个缺口)。从NB8株全基因组数据中挖掘出了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、四环素类、多粘菌素的耐药基因,并挖掘出接合性质粒、转座子、插入序列、整合子的遗传标记,以及5大类外排泵基因。结论多耐药大肠埃希菌NB8株遗传学背景明确,主动外排机制增强也会导致或者增强NB8株的耐药性。质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件可以使细菌的耐药性得以快速传播,使受体菌表现为多重耐药。     

重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA与rrs基因突变特征分析

目的分析重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA、rrs基因突变特征及其与氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卡那霉素耐药(kanamycin,Km)的关系。方法对89株耐多药结核分枝杆菌的Ofx耐药相关基因gyrA和Km耐药相关基因rrs进行序列测定,分析其基因突变特征。结果89株MDR结核分枝杆菌中有50株对Ofx耐药,其中46株(92.00%,46/50)gyrA基因发生突变,突变位点包括74、89、90、91和94位密码子;22株耐Km菌株中,19株(86.36%,19/22)发生rrs基因突变,突变类型均为A1401G。Ofx、Km耐药株的gyrA、rrs基因突变率明显高于相应敏感株的基因突变率,两者之间的差异有统计学意义(χ²=62.937,P<0.001;Fisher双侧P<0.001)。结论gyrA基因90、91、94位密码子突变是重庆市耐多药结核分枝杆菌Ofx耐药的主要机制;rrs基因A1401G突变则是Km耐药的主要原因。     

福建省耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物表型耐药与gyrA基因突变特征分析

目的 了解福建省耐多药(Multi-drug resistant, MDR)结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones,FQs)的gyrA基因突变特征,为FQs耐药菌株的快速分子药敏检测提供基础科学数据。方法 收集来自福建省2010-2011年和2008-2009年耐药监测点的所有MDR Mtb临床菌株,采用常规比例法进行FQs敏感性试验。PCR扩增包含gyrA耐药决定区的基因片段,测序后比对分析。结果 共收集到MDR结核分枝杆菌临床菌株119株,经常规药敏试验,氧氟沙星(Ofloxacin,Ofx)的耐药率为26.89%,左氧氟沙星(Levofloxacin,Lfx)耐药率为25.21%,莫西沙星(Moxifloxacin,Mfx)耐药率为11.76%。FQs敏感株gyrA基因未检测到突变。gyrA基因在Ofx耐药菌株的突变率为84.38%(27/32),Lfx耐药菌株的突变率为83.33%(25/30), Mfx耐药菌株的突变率为92.86%(13/14)。gyrA基因突变为点突变,共发现有5种突变类型,以Asp94Gly,Asp94Asn和Ala90Val为主。结论 福建省MDR-Mtb对FQs耐药的主要原因是gyrA基因突变,最常见的突变位于第94位,第90位和第91位密码子。     

江西省结核分枝杆菌耐二线抗结核药的分子学特征

目的 初步明确江西省耐二线抗结核药相关基因突变的特征,评价等位基因特异性多重PCR（multiplex allele-specific polymerase chain reaction,MAS-PCR）检测二线抗结核药耐药性的可行性。 方法 采用DNA测序方法和MAS-PCR技术,对江西省52株耐二线抗结核药的结核分枝杆菌进行耐药相关基因突变位点检测。 结果DNA测序分析：39株耐氧氟沙星（Ofx）菌株中,32株存在gyrA基因错义突变,2株发生gyrB基因错义突变。29株耐卡那霉素（Km）或卷曲霉素（Cm）菌株中,22株为rrs1401位点A→G突变。52株耐二线抗结核药的结核分枝杆菌,40株为北京基因型（76.92%,40/52）,其中17株北京基因型菌株发生gyrA-GAC94GGC突变（42.50%,17/40）,19株北京基因型菌株发生rrs-A1401G突变（47.50%,19/40）。北京基因型与基因突变类型gyrA-GAC94GGC和rrs-A1401G无明显相关性（χ²=1.16、1.92,P值均＞0.05）。MAS-PCR检测Ofx耐药株的敏感度为61.54%（24/39）,检测Km或Cm耐药株的敏感度为79.31%（23/29）。 结论 gyrA基因94位密码子突变是江西省结核分枝杆菌Ofx耐药的主要机制; rrs-A1401G突变则是Km或Cm耐药的主要原因。MAS-PCR方法对于快速检测二线抗结核药的耐药性有一定的临床应用价值。     

感染性心内膜炎链球菌耐药基因检测与分析

目的通过分析感染性心内膜炎链球菌的耐药基因,以便有效控制链球菌耐药性的进一步发展,从而为感染性心内膜炎的治疗提供依据。方法从感染性心内膜炎患者血培养标本中分离链球菌,提取DNA,采用PCR方法检测耐药基因,并作测序分析。结果 PCR检测链球菌9种耐药基因,其中gyrA、parC、tetM基因扩增均阳性,且同源性较高。所有菌株的tetM基因同源性均为100%。有3株发生突变,突变位点分别为81位、87位和79位,且突变株均对氟喹诺酮类抗菌药物耐药。链球菌耐药基因编码氨基酸序列比对图显示,gyrA第81位由丝氨酸(Ser)突变为精氨酸(Arg),parC第87位由精氨酸(Arg)变异为亮氨酸(Leu),parC第79位由丝氨酸(Ser)突变为苯丙氨酸(Phe),因而可能导致耐药性的产生。结论分离自感染性心内膜炎患者的链球菌含有gyrA、parC、tetM基因,这3种基因可能与链球菌的耐药性有关。     

结核分枝杆菌耐利福平药物机理的初步研究

目的通过诱导试验观察结核菌产生耐利福平药物的全过程,初步分析结核菌耐该药的机理。方法采用诱导试验、聚合酶链反应—单链构象多态性(PCR-SSCP)和序列分析,对经不同药物浓度传代培养后的结核菌强毒株（H₃₇Rv）和36株临床耐药分离株进行分析。结果在诱导到第7代时,H₃₇Rv的PCR-SSCP电泳出现异常,经测序证实在513位点发生基因突变。36株临床耐药分离株中有23株发生突变,为63.9% (23/36);其中有5株与诱导株基因突变位点相同。结论用药物不间断的刺激结核菌,是产生结核菌耐利福平药物的重要原因。