小鼠卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞上细胞周期蛋白D2的表达

目的检测在小鼠卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞(CCs)上细胞周期蛋白D2(CCND2)表达水平的变化,探讨其在卵母细胞成熟中的作用。方法从3周龄雌性ICR小鼠获取GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),体外培养至MⅡ期卵丘-卵母细胞复合体(MⅡ-COCs)。收集对应的CCs,分成GV-CCs和MⅡ-CCs二组,实时定量逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹方法检测CCND2mRNA和蛋白水平的表达;激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs成熟前后CCND2的亚细胞定位。结果 GV-CCs的CCND2mRNA相对表达量(7.03±1.11),显著高于MⅡ-CCs组(1.40±0.11)(P0.01);同样,GVCCs组CCND2蛋白相对表达水平(1.98±0.16)也显著高于MⅡ-CCs组(1.16±0.14)(P0.01)。免疫荧光显示,COCs中CCND2定位于CCs,卵母细胞亦有表达;CCs中CCND2主要定位于胞核,胞质中少量表达,且GV-CCs主要表达在内层CCs,而MⅡ-CCs则失去这种表达极性,同时MⅡ-CCs的表达强度较GV-CCs减弱。结论卵母细胞体外成熟培养过程中,其周围的CCs上CCND2表达水平下降,且伴随细胞定位的改变,提示CCs上CCND2与卵母细胞成熟密切相关,可能参与了卵母细胞成熟过程。     

卵丘细胞在卵母细胞发育过程中的作用

卵母细胞能否正常发育成熟是影响女性生育能力的重要因素,目前人们普遍认为,人类卵母细胞和卵丘细胞之间的相互交流,对于卵母细胞发育是不可或缺的。在卵泡窦腔形成过程中,颗粒细胞分化为壁颗粒细胞和卵丘细胞,卵丘细胞与其他卵泡细胞不同,具有本身独特的功能、促进排卵前卵母细胞的生长和成熟及支持排卵后卵母细胞功能的作用。本文主要对卵丘细胞的功能及在卵母细胞发育过程中的作用进行论述。     

猪体外成熟卵母细胞的卵丘扩散与胚胎发育能力的相关性

目的　探讨卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩散与其体外受精后胚胎发育能力的关系。　方法　取猪卵丘 卵母细胞复合体 (COCs)在体外进行成熟、受精和培养 ,在体外成熟培养液中添加不同直径卵泡 (<2 ,2～ 5和 >5mm)的不同浓度 (15%、5% )卵泡液。　结果　在含卵泡液的成熟培养液中培养 48h ,卵泡液明显抑制了COCs的卵丘扩散 (P <0 .0 5) ,但不影响第一极体的排出 ;COCs成熟培养 2 4h后 ,移入不含卵泡液的成熟培养液中继续培养 2 4h ,卵丘扩散显著高于对应的 48h培养组 (P <0 .0 5) ,但第一极体的排出率无显著差异 ;体外成熟过程中COCs扩散的卵丘面积与其受精后的胚胎发育能力 (发育到 2～ 4细胞、>4细胞和桑葚胚 /囊胚的百分率 )呈显著正相关 (P =0 .0 0 58,0 .0 0 0 1和 0 .0 3 4 8)。　结论　卵泡液对COCs的卵丘扩散有抑制作用 ,这种抑制作用与卵泡液的作用时间相关 ;在体外成熟过程中扩散的卵丘团面积可以作为预测卵母细胞受精后胚胎发育能力的参数     

小鼠成熟卵丘-卵母细胞复合体蛋白质谱图的建立

目的通过聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,全面展示小鼠成熟卵丘卵母细胞复合体(COC)的蛋白质表达谱。方法采用13cmpH3～10的非线性胶条进行双向凝胶电泳,分离成熟雌鼠COC总蛋白,并作质谱鉴定。结果获得了较高分辨率的小鼠成熟COC蛋白质表达谱图,并对胶上的3个蛋白点进行了质谱鉴定。结论蛋白质组学是全面分析COC蛋白表达的有效手段。成熟COC蛋白质表达谱的建立为研究卵泡发育机理提供了依据。     

卵丘细胞上AIFM2和FDX1的表达及其与小鼠卵母细胞成熟的关系

目的检测小鼠卵母细胞体外、体内成熟过程中卵丘细胞(CCs)上线粒体相关凋亡因子2(AIFM2)和铁氧化还原蛋白1(FDX1)的表达,探讨其在卵母细胞成熟中的作用。方法从3周龄ICR雌性小鼠获取体内成熟卵丘-卵母细胞复合体(IVV-COCs)以及GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),并将GV期体外培养至MⅡ期卵丘-卵母细胞复合体(IVMCOCs)。收集对应的CCs,分成GV-CCs、IVM-CCs和IVV-CCs 3组。实时定量逆转录聚合酶链反应检测AIFM2和FDX1mRNA水平的表达,以GAPDH为参照;激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs的AIFM2和FDX1的亚细胞定位。结果IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2mRNA相对表达量[分别为(0.72±0.01)和(0.67±0.02)]显著高于GV-CCs组[(0.10±0.06)](P0.01);同样,IVM-CCs和IVV-CCs的FDX1mRNA相对表达量[分别为(1.58±0.35)和(1.82±0.34)]也显著高于GV-CCs组[(0.10±0.03)](P0.01);而IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2和FDX1表达水平均无显著性差异(P0.05)。免疫荧光显示,AIFM2和FDX1主要定位于CCs胞质中,在GV-COCs中各层均有表达,且GV期卵母细胞中也有表达;IVMCOCs和IVV-COCs中表达阳性的细胞数目较GV期增加。结论卵母细胞成熟后,其CCs上AIFM2和FDX1的表达升高,表明AIFM2和FDX1参与了卵母细胞成熟过程,有望作为预测卵母细胞成熟的生物标记物。     

多精受精中人卵丘颗粒细胞差异基因表达分析

目的 筛选人卵丘颗粒细胞中影响卵母细胞多精受精的差异表达基因。方法 筛选3名因输卵管因素导致继发不孕的患者为研究对象,长方案促排卵后,在授精前10 min,对每个卵母细胞外围的卵丘颗粒细胞进行切割,分装无菌管保存。卵冠丘复合体(OCCC)进行微滴授精,受精后17～18 h,观察受精情况;并根据卵母细胞受精情况分为多精受精组和正常受精组,收集两组对应的颗粒细胞。提取颗粒细胞总mRNA,构建cDNA文库并进行测序,将得到的数据进行生物信息学分析,筛选出差异表达基因,并将差异表达基因进行基因本体论(GO)分析和京都基因和基因组数据库(KEGG)分析。结果 与正常受精组比较,多精受精组中显著上调的基因有106个,显著下调的基因有33个。上调的基因主要涉及P53信号通路、PI3K-AKT信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路和HIPPO信号通路,其中基因BMP2、SESN3、CDK6、GRLF1(ARHGAP35)与多精受精有关。结论 与正常受精比较,多精受精时颗粒细胞存在差异表达的基因,对这些基因的进一步了解可能为后续开展异常受精的影响因素分析提供一定参考。     

卵母细胞授精前剥除部分卵丘细胞对体外受精-胚胎移植结局的影响

目的研究授精前剥除部分卵丘细胞的卵母细胞的受精、胚胎发育和临床结局。方法授精前用机械法剥除卵母细胞外包裹的部分卵丘细胞,每个卵母细胞采用微滴法单独受精(A组)。对照组(B组)采用常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)受精方式进行。比较两组受精率(2PN、1PN和3PN)、卵裂率(2PN、1PN和3PN)、优胚率、临床妊娠率、种植率和流产率。结果 A组和B组的受精率分别是76.51%和73.74%(2PN受精率分别是60.64%,61.62%;1PN受精率分别是1.61%,0.86%;3PN受精率分别是10.44%,9.69%)、卵裂率分别是98.95%和99.17%(2PN卵裂率分别是97.02,98.01%;1PN卵裂率分别是100%,85.71%;3PN卵裂率分别是100%,100%)、优质胚胎率分别是60.75%,62.68%、临床妊娠率分别是63.89%,61.76%、种植率分别是48.00%,38.78%、流产率分别是9.09%,11.90%。所有指标均无统计学意义。结论卵母细胞授精前剥除部分卵丘细胞不会影响IVF-ET的临床结局,为利用卵丘细胞进行非侵入性种植前遗传学诊断提供临床依据。     

卵巢储备功能减退患者卵泡液外泌体对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的 探讨卵巢储备功能减退(DOR)患者卵泡液外泌体对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,以期为女性因DOR导致的生育功能降低和不孕症的发生提供新的科学实验数据。方法 选取SPF级4～6周龄C57BL/6J未孕雌性小鼠,收集未成熟卵母细胞并进行体外成熟培养;同时收集DOR患者卵泡液,并提取外泌体。利用Dio荧光标记外泌体后与小鼠未成熟卵丘-卵母细胞复合物(COCs)共孵育培养,观察外泌体摄入情况;通过添加不同浓度0、50、100和150μg/ml外泌体处理小鼠未成熟COCs 16 h观察卵丘扩展和第一极体排出情况,分析其对卵母细胞成熟的影响并筛选出最佳处理浓度;设置分组为体内成熟组(control)、外泌体添加组(exo+)和未添加组(exo-),各组成熟后的COCs利用qPCR检测卵丘扩展相关基因Has2、Tnfaip6和Ptgs2以及凋亡相关基因Bax、Bcl2的mRNA相对表达水平,分析各组间的差异。结果 (1)Dio标记的外泌体与小鼠COCs共孵育,卵丘颗粒细胞上能观察到明显的Dio荧光信号,证实COCs能够摄入外泌体;(2)不同浓度外泌体处理组的GV期卵母细胞百分比均显著高于0μg/...     

分泌型卷曲相关蛋白家族成员在多囊卵巢患者不同成熟度卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞中的基因表达

目的探讨在多囊卵巢综合征(PCOS)患者与非PCOS患者中,分泌型卷曲相关蛋白(sFRPs)家族成员基因在不同成熟度卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞上的表达差异。方法收集27例接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治疗的不育女性患者(其中11例PCOS患者,16例非PCOS患者),通过控制性促排卵治疗后,采用标准长方案促排卵,经阴道超声引导下穿刺取卵后,获得共198枚卵丘-卵母细胞复合体(PCOS患者98枚,非PCOS患者100枚);采用机械剥离法获取卵丘颗粒细胞,根据卵母细胞成熟度不同,将对应的卵丘颗粒细胞分为4组:非PCOS患者成熟卵母细胞周围的颗粒细胞组(CCN-MII),非PCOS患者非成熟卵母细胞周围的颗粒细胞组(CCN-MI+GV),PCOS患者成熟卵母细胞周围的颗粒细胞组(CCP-MII)和PCOS患者非成熟卵母细胞周围的颗粒细胞组(CCP-MI+GV)。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测部分sFRPs家族基因成员(sFRP1、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5)在PCOS及非PCOS患者不同成熟度卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞上的表达情况。结果 (1)PCOS患者中,在未成熟卵母细胞周围的颗粒细胞中sFRP4的表达显著高于在成熟卵母细胞周围的颗粒细胞中的表达,即sFRP4在CCP-MⅠ+GV组表达高于CCP-MⅡ组[(7.80±1.21)vs.(1.00±0.00)](P0.05);(2)在非PCOS患者中,sFRPs家族成员sFRP4和sFRP5在不同成熟度卵泡母细胞周围的卵丘颗粒细胞中表达变化显著,CCN-MⅠ+GV组中的表达量均显著高于CCN-MⅡ组[sFRP4(7.04±1.30)vs.(1.00±0.00)](P0.05)和[sFRP5(2.84±0.73)vs.(1.00±0.00)](P0.05);(3)sFRP4的表达在PCOS及非PCOS患者间成熟卵母细胞对应的颗粒细胞组间均无显著性差异。结论在PCOS患者中,仅sFRP4在卵丘颗粒细胞上的表达与卵母细胞的成熟度相关;而在非PCOS患者中,sFRP4和sFRP5的表达均与卵母细胞的成熟度相关,其表达量随卵母细胞成熟而降低。     

体内、外成熟卵母细胞的胚胎冷冻-复苏后发育能力的比较

目的比较体外与体内成熟卵母细胞受精后第3天胚胎冷冻-解冻后的发育能力。方法体外成熟组的胚胎来源于在本生殖中心行未成熟卵体外成熟(IVM)治疗的患者(6例)。体内成熟组为同期行常规卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗的患者(22例)。两组患者胚胎移植后多余的胚胎按慢冻法进行冷冻保存。冻胚移植周期时冷冻胚胎按快融法解冻,体外培养约24 h后行胚胎移植。结果体外与体内成熟卵母细胞的胚胎冷冻-解冻后的复苏率、解冻培养后的可移植胚胎率以及临床妊娠率均无显著差异。结论人未成熟卵母细胞在体外培养系统中完成细胞核和细胞质成熟的同时,细胞膜的成熟可能也较充分,受精后的胚胎能够一定程度地耐受冷冻-解冻过程中面临的各种损伤,复苏后,仍能继续发育和着床并获得妊娠。     

The effect of helium-neon laser irradiation on in vitro maturation and fertilization of immature bovine oocytes

A study was made of the effects of low power laser irradiation on in vitro oocyte maturation rates and subsequent fertilization of immature bovine oocytes. Immature bovine oocytes from cows sacrificed at a slaughterhouse were irradiated with Helium-Neon laser (HeNe laser) irradiation at an energy density of 0.4 and 2.0 J cm^–2. An oocyte group was left untreated, serving as control group. All oocytes were matured and fertilized in TCM-199 medium supplemented with 20% fetal calf serum (FCS). Maturation and fertilization rates obtained in the irradiated oocytes group were lower (p<0.001 andp<0.05, respectively) than those of the control group. Furthermore, the laser-treated oocytes showed important degenerative changes on both cytoplasm and chromosomes in comparison with untreated control oocytes which showed a homogenous cytoplasm and disperse chromosomes. It is concluded that the application of HeNe laser irradiation at 0.4 and 2.0 J cm^–2 energy densities has a detrimental effect on in vitro maturation and fertilization process of immature bovine oocytes.     

外源性褪黑素在人类未成熟卵母细胞体外成熟中的应用研究

目的通过在体外成熟（IVM）培养基中加入褪黑素,探索外源性褪黑素在人类未成熟卵母细胞IVM中的作用,以期优化人类未成熟卵母细胞IVM的培养体系。方法在人类未成熟卵母细胞IVM培养体系中添加不同浓度的褪黑素,以排出第一极体作为判断其核成熟的标准,比较不同浓度下的核成熟率。结果与对照组（褪黑素0mol／L）相比,外源性褪黑素在10^-11mol／L、10^-9mol／L和10^-7mol／L时人类未成熟卵母细胞的核成熟率有提高,但只有褪黑素在10^-9mol／L时人类未成熟卵母细胞的核成熟率呈显著性提高（63．6％VS．40．9％,87．7VS．54．2％,68．2％VS．45．5％,90．4VS．69．4％）（P〈0．05）;当外源性褪黑素浓度增加到10。mol／L和10。mol／L时,人类未成熟卵母细胞的核成熟率显示稍低于对照组,差异无统计学意义（P〉0.05）,但与10^-11mol／L、10^-9mol／L和10^-7mol／L组相比则呈显著性降低（P〈0．05）。结论外源性褪黑素在适当浓度时可以促进人类未成熟卵母细胞的核成熟,而在浓度超出一定范围时,则可能对卵母细胞的核成熟造成负面影响。     

人体外与体内成熟卵母细胞发育潜能及妊娠结局的观察

目的观察体外成熟(IVM)与体内成熟人卵母细胞的发育潜能和妊娠结局。方法69例多囊卵巢或多囊卵巢综合征不育患者,分别行IVM治疗49个周期(IVM组)和体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗29个周期(IVF组)。结果IVM组卵母细胞成熟率为65.4%。IVM组和IVF组受精率和卵裂率分别为62.1%和77.2%,60.2%和91.2%,两组受精率无显著性差异(P>0·05),IVM组较IVF组卵裂率降低非常显著(P<0.01)。IVM组和IVF组临床妊娠率和种植率分别为26.5%和12.6%,41.4%和22.9%,IVM组临床妊娠率和种植率较低,但两组无显著性差异(P>0.05)。IVM组和IVF组卵母细胞受精后D2≥4细胞和D3≥6细胞胚胎数占受精卵数(2PN)的比例分别为24.5%和19.4%,67.0%和66.4%,IVM组较IVF组胚胎发育速度慢,两者有非常显著性差异(P<0.01)。IVM组D3优质胚胎形成率(23.7%)较IVF组(58.2%)为低,亦有非常显著性差异(P<0.01)。结论人卵母细胞IVM将成为一种选择性的辅助生殖技术。人卵IVM较体内成熟卵母细胞受精后2PN至卵裂期发育阻滞发生率高,胚胎发育速度慢和优质胚胎形成率低。     

The application of in vitro maturation of oocytes in the infertile patients with polycystic ovarian syndrome

<正> Objective:To evaluate the effects of in vitro maturation(IVM)of oocytes in the infertile pa-tients with polyeystic ovarian syndrome(PCOS).Methods:The infertile patients with PCOS who underwent IVM or IVF/ICSI from January2004 to August 2005 were studied retrospectively.68 unstimulated cycles(48 cases)underwentIVM as IVM group,42 cycles(39 cases)underwent IVF/ICSI as control group.Main outcomesincluding the number of oocytes retrival,the rates of fertilization,embryo cleavage,implanta-tion,pregnancy,miscarriage,ovarian hyperstimulation syndrome(OHSS)and multiple pregnan-cy were assessed.Results:No FSH was administered in IVM group and the mean number of FSH used was(25±6.2)ampoules in control group.When compared with control group,women in IVM grouphad significant increase in fertilization rate(70.7% versus 63.9%)and decrease in cleavage rate(87.9% versus 99.4%)and ovarian hyperstimulation syndrome(0 versus 7.1%).No significantdifferences between IVM group and control group were found in the number of oocytes obtained,implantation rate,clinical pregnancy rate,miscarriage rate and multiple pregnancy rate.Conclusion:Our results suggested that for infertile PCOS women who required assisted con-ception treatment,IVM is a more economical method with less OHSS complication than that ofconventional IVF treatment.     

血管生成素样蛋白基因1和2(ANGPTL1、2)在多囊卵巢综合征患者卵丘颗粒细胞上的表达

目的探讨血管生成素样蛋白基因1和2(ANGPTL1和ANGPTL2)在成熟的卵丘颗粒细胞(CCMⅡ)上表达与多囊卵巢综合征(PCOS)的相关性。方法共募集就诊于烟台毓璜顶医院生殖中心80例不育女性的CCMII样品,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定体外受精-胚胎移植(IVF-ET)促排卵治疗后38例实验组PCOS妇女(CCMII=148)和同期42例对照组(non-PCOS)妇女(CCMII=152)的卵丘颗粒细胞(CC)的ANGPTL1mRNA和ANGPTL2mRNA差异表达。结果 PCOS妇女CCMII中ANGPTL1表达水平低于non-PCOS妇女,但无统计学差异(P0.05);而PCOS妇女CCMII中ANGPTL2表达水平高于non-PCOS妇女,具有统计学差异(P0.05)。结论 ANGPTL1在PCOS患者CCMII上的表达无明显变化,推测ANGPTL1与PCOS患者的疾病发生无相关性。但PCOS患者CCMII上ANGPTL2明显升高,提示其可能参与PCOS患者的致病过程,影响卵巢内正常微环境,进而影响卵泡的正常发育。     

卵母细胞体外成熟技术在多囊卵巢综合征不育妇女中的应用

目的评价未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)技术对多囊卵巢综合征(PCOS)不育患者的治疗效果。方法对2004年1月至2005年8月PCOS不育患者在本中心行IVM或常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)、卵胞浆内单精子注射(ICSI)的周期作回顾性分析。分为无药物刺激的IVM观察组共48例、68个周期,与IVF/ICSI组39例、42个周期,比较两组的获卵数、受精率、卵裂率、种植率、临床妊娠率、流产率、卵巢过度刺激综合征(OHSS)及多胎发生率。结果IVM组与IVF/ICSI组比较,IVM组未采用卵泡刺激素(FSH),IVF/ICSI组FSH用量为(25±6.2)支;受精率分别为70.7%及63.9%(P<0.01);卵裂率分别为87.9%及99.4%(P<0.01);OHSS分别为0及7.1%(P<0.05),差异均具统计学意义。两组的获卵数、种植率、妊娠率、流产率、多胎率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论IVM技术对难治性PCOS不育患者是一种较为节约,且不发生OHSS的有效辅助生育技术。     

体外受精周期中卵泡发育阻滞患者应用未成熟卵体外成熟培养的临床观察

目的观察常规体外受精(IVF)中卵泡发育阻滞患者采用未成熟卵体外成熟(IVM)培养治疗结果。方法常规IVF治疗患者11例,在促排卵过程发生卵泡发育阻滞时,取卵行IVM培养成熟后,卵母细胞行卵胞浆内单精子注射(ICSI)以获得受精卵并最终实现胚胎移植。统计分析未成熟卵的成熟率、卵母细胞的受精率、胚胎的发育情况及临床结果。结果共获取卵母细胞128枚,其中成熟卵21枚,行ICSI后15枚正常受精,获10枚正常卵裂胚胎,全部移植3例,均未妊娠;107枚未成熟卵,经IVM、ICSI和体外培养后,成熟率、受精率、正常卵裂率及优质胚胎率分别为72.9%、75.6%、78%及39.1%,胚胎移植后3例临床妊娠(新鲜周期2例,冻融周期1例)。结论常规IVF控制性超促排卵(COH)过程中,发育阻滞的卵泡在体外适宜的培养条件下仍有成熟、受精、继续发育的能力,并最终实现临床妊娠。IVM技术是改善IVF中发生卵泡发育阻滞患者结局的措施之一。     

卵母细胞体外成熟在IVF—ET周期中降低OHSS风险中的应用

目的探讨卵母细胞体外成熟培养（IVM）在体外受精-胚胎移植（IVF—ET）周期中降低卵巢过度刺激综合征（OHSS）风险的应用价值。方法51例IVF长方案超排卵过程中出现OHSS早期征象时,充分知情后按患者意愿分成两组,实验组为即刻停药并于当天注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）36h后取卵,改行卵母细胞IVM治疗的21个周期;对照组为继续按常规治疗的30个周期。比较两组促性腺激素（Gn）用药天数、用药量、受精率、周期取消率、临床妊娠率及OHSS发生率。结果两组年龄、不育年限、基础内分泌、受精率、优质胚胎率、临床妊娠率均无统计学差异（P〉0．05）,但实验组的卵泡刺激素（FSH）总用量、FSH用药天数、获卵数、OHSS（中、重度）发生率均低于对照组（P％0．05）,并且实验组周期ET取消率也显著低于对照组（P〈0．05）。结论在常规IVF周期超排卵中,当出现OHSS早期征象时改行卵母细胞IVM可显著减少促排卵药物的使用量,降低OHSS的发生风险及周期移植取消率,同时获得较好的临床妊娠率。