筑巢式聚合酶链反应动态检测儿童微量残留白血病的研究

为探讨Ｔ细胞受体Ｖδ２－Ｄδ３基因重排检测对儿童急性淋巴细胞白血病分型诊断及微量残留病动态监测的意义，采用筑巢式聚合酶链反应技术，对４０例ＡＬＬ患儿进行了ＴＣＲ Ｖδ２－Ｄδ３基因重排的检测，并对其中３０例在其完全缓解后进行了ＭＲＤ的动态监测。     

急性白血病微量残留细胞定量分析及其临床意义

为了研究残留白血病细胞数量变化的临床意义，应用竞争性聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术定量检测急性淋巴细胞白血病患儿的ＴｃＲγ基因。结果：４９例患儿缓解后１～６４个月中共收集到１２６份骨髓标本，有３３例５１份标本检测到残留白血病细胞（０．００６％～３．３％），且残留白血病细胞数量呈逐年减少趋势。有６例患儿复发，其复发前残留白血病细胞的定量高于未复发组（复发组为０．５６％±０．４７％，未复发组为０．１７％±０．１１％，Ｐ＜０．０１）。提示：残留白血病细胞定量检测有助于指导治疗，判断预后。     

应用巢式聚合酶链反应诊断中枢神经系统白血病初探

应用巢式聚合酶链反应技术，扩增急性淋巴细胞白血病患儿脑脊液细胞中Ｔ细胞受体基因Ｖδ＿２Ｄδ＿３重排片段，作为白血病细胞克隆特异性标志，检测脑脊液中微量白血病细胞。结果：２０例患儿（３６份）脑脊液中有１２例（１５份）脑脊液标本阳性，阴性对照脑脊液未见特异扩增带。提示该法诊断中枢神经系统白血病，可能是一种敏感的方法。     

实时定量聚合酶链反应检测微小残留白血病的临床研究

目的 探讨并研究实时定量聚合酶链反应(RQ—PCR)技术定量检测小儿急性淋巴细胞白血病(ALL)微小残留病(MRD)的临床适用性和临床价值。方法 以免疫球蛋白重链(IgH)基因重排作为ALL的肿瘤标志,应用RQ—PCR、胚系探针策略,定量检测了34例B细胞ALL(B—ALL)患儿的MRD,并对其中的16例患儿进行了缓解期MRD的定量动态追踪观察。结果在34例B—ALL患儿的初治标本中IgH基因单克隆重排16例,对16例单克隆IgH重排靶基因进行序列分析发现,V片段使用最频繁的是V3家族,J片段使用最频繁的是J4和J6。在16个靶基因中,RQ—PCR的检测敏感度有9例为10-4,6例为10-5,1例为10-3,非特异性扩增见于6例患儿。16例初治患儿的标准曲线相关系数均为0.99以上,斜率均值为-3.34±0.37,截距均值为24.30±2.95。对16例患儿随访期样本的MRD动态追踪研究发现,复发患儿的MRD水平较高且复发前有动态增加。诱导化疗结束时的MRD水平与ALL高危因素无明显相关性(P>0.05)。结论 研究表明,RQ—PCR技术胚系探针策略检测ALL患儿的MRD具有临床适用性,随访期标本MRD的定量检测及动态追踪监测具有临床价值。     

急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测及临床意义

采用ＩｇＨ和ＴｃＲｙ基因重排两个标志相结合的方法，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测微小残留病（ＭＲＤ）。１８例急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）患儿在终止治疗后有９例检出ＭＲＤ。受检病例在检测后随访１．５～１０２个月，结果９例ＭＲＤ阳性者有３例于３～６个月内复发；而ＭＲＤ阴性的９例无１例复发，提示治疗终止后仍存在ＭＲＤ者以后有复发的危险，应进行定期监测；ＭＲＤ阴性可作为临床停药观察的一个客观指标。该方法检测ＭＲＤ简便、阳性率较高，适于临床应用。     

急性T淋巴细胞白血病微小残留病实时荧光定量聚合酶链反应检测的意义

目的　研究采用实时荧光定量聚合酶链反应 (RQ-PCR)技术检测具有tal-1缺失的急性T淋巴细胞白血病(T ALL)患儿骨髓微小残留病 (MRD)水平的可行性,并探讨不同时间点MRD水平在预后和临床治疗干预上的意义。方法　采用最常见的tal 1缺失断裂点sildb1-tal1db1,对 50例T-ALL患儿初治标本进行阳性筛选;应用RQ-PCR技术检测所有阳性患儿初治标本的敏感度,并对这些患儿化疗达完全缓解(CR)及其后不同时间点的骨髓标本进行MRD定量检测,并以极限稀释法检测结果进行比较;对上述两种方法分别检测出的结果进行相关回归分析。结果　 ( 1 )在 50例T-ALL患儿中,共检测出 10例阳性患儿; (2)采用RQ-PCR技术和极限稀释法分别检测患儿CR期及其后各个时间点的 28份标本,有 24份标本两种方法检测结果均大于 10-5,两种方法检测结果的相关性很好(r=0 898,P<0.001); (3)在规律治疗的 8例患儿中,CR时骨髓MRD水平高于 10-4的 3例患儿皆在化疗过程中复发,而低于 10-4的 5例一直未复发。结论　RQ-PCR技术是一项特异性强,重现性好、精确快速的MRD定量检测手段。不同时间点的MRD水平升高对预后的意义不同,对及时调整治疗方案、改善预后有重要价值。     

47例儿童急性淋巴细胞白血病IgH和TCR基因重排

目的 检测４７例儿童急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）ＩｇＨ和ＴＣＲ基因重排，以便选择恰当的组合用于微小残留病（ＭＲＤ）的检测。方法 以Ｃｈｅｌｅｘ１００为介质，从初诊的ＡＬ患儿骨髓涂片中提取ＤＮＡ，借助聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测ＩｇＨ、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ和ＴＣＲγ基因重排。结果 在Ｂ－ＡＬＬ（４２例）中，ＩｇＨ、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ和ＴＣＲγ基因重排的检出结果分别为３２／４２例、１５／４２例、１９／     

降钙素基因甲基化PCR法检测儿童急性白血病微小残留病

本文用ＣＴ基因甲基化ＰＣＲ法结合限制性酶切和激光扫描条件对儿童急性白血病及其ＭＲＤ进行初步研究。初发或复发急性白血病４９例，完全缓解者１５例。结果８６％ＡＬＬ、８０％ＡＮＬＬ和２６．７％ＣＲ期的病人表现为降钙素基因５’端高度甲基化，提示本方法对检测急性白血病及其ＭＲＤ有一定的意义，对指导化疗、预防白血病复发和判断预后可能有帮助。     

应用流式细胞术检测微量残留白血病

应用流式细胞术（ＦＣＭ），结合免疫双标记技术，对１１３例次急性淋巴细胞白血病患儿进行了微量残留白血病（ＭＲＤ）检测。结果表明，ＦＣＭ结合免疫双标记技术检测ＭＲＤ敏感度可达到０．０１％，是一种简便实用、快速敏感的方法。ＭＲＤ检测对于判断预后以及制定个体化的化疗方案有重要意义。     

极限稀释PCR法对急性淋巴细胞白血病微小残留病的检测及意义

目的 探讨极限稀释定量ＰＣＲ法检测追踪急性淋巴细胞白血病（简称急淋,ＡＬＬ）患儿骨髓微小残留病（ＭＲＤ）变化的临床意义,方法 改良极限稀释定量ＰＣＲ方法,结果 敏感度平均为４拷贝,对２３例初治ＭＲＤ阳性的患儿在诱导治疗达到缓解（ＣＲ）时的ＭＲＤ定量检测结果显示：（１）ＣＲ时ＭＲＤ阴性１０例,其中８例在追踪期内亦持续阴性,另２例在追踪过程中ＭＲＤ转为阳性,经强化疗后ＭＲＤ渐减少至转阴;（２）ＣＲ时Ｍ     

流式细胞技术与PCR技术联用筛选儿童急性淋巴细胞白血病微量残留病标记

目的：微量残留病（MRD）监测是儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）早期治疗反应中最重要的预后因素之一。目前常用的MRD检测的方法主要有流式细胞术和PCR技术,但单用一种方法均不能为所有的患儿找到合适的监测标记,该研究探讨两种方法联合应用是否能为大多数ALL患儿找到合适的MRD监测标记。方法：联合应用流式细胞术和PCR技术筛选上海儿童医学中心2001年9月至2003年10月126例新发ALL患儿骨髓标本的异常免疫表型及抗原受体基因重排。结果：①106例B系-ALL患儿骨髓标本用四色流式细胞术进行了MRD免疫表型标记的筛选,其中11例标本未筛选出监测标记,阳性率为89.6％;有1个监测标记的标本为11例（11.6％）,至少有两个标记的标本占88.4％。②PCR技术筛选27例ALL骨髓标本抗原受体基因重排,26例至少有一个标记（占96.3％）,其中9例（34.6％）骨髓标本只有一个监测标记,17例（65.4%）至少有两个监测标记。在T系-ALL骨髓标本中,以TCRVγⅠ-Jγ1.3/2.3阳性最多,双等位基因重排发生阳性率较高;系性交叉抗原表达在B系-ALL骨髓标本中表达较高,达57.1％（4/7）。③两种方法联用能为121例（96.0％）的患儿提供合适的筛选指标。结论：流式细胞技术检测异常免疫表型与PCR技术检测抗原受体基因重排联用,可为绝大多数的ALL患儿找到合适的MRD监测指标;在抗原受体基因重排中,存在系性交叉抗原表达及双等位基因重排。［中国当代儿科杂志,2009,11（4）：246-250］     

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??Abstract??Objective To explore the feasibility of monitoring minimal residual disease ??MRD?? in childhood acute lymphoblastic leukemia ??ALL?? by detection of cloned IgH and TCRγ gene rearrangements using multiplex polymerase chain-reaction ??PCR?? and automated fragment analysis. Methods In this 1??3 matched case-control study?? 4 cases of very early bone marrow relapsed non-high risk ALL ??relapsed group?? and 12 cases of non-relapsed non-high risk ALL as control ??control group?? were enrolled in the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from Jan. 2009 to Dec.2011. All patients were treated with Guangdong 2008 ALL protocol. Bone marrow samples were collected at four time points: at diagnosis?? the end of induction?? the beginning of reinduction and the third month of maintenace treatment. Cloned IgH and TCRγ gene rearrangements were amplified by multiplex PCR. The clonality of PCR production was analyzed by GENEMAPPERID softwares. Detectable clonality of IgH/TCRγ was defined as MRD positive. Results At diagnosis?? the frequency of cloned IgH and TCRγ in all patients was 100% and 56%. The positive rate of MRD was found to have no statistical difference between two groups at the end of induction?? while the difference of the MRD positive proportion between the two groups was statistically significant at the beginning of reinduction and the third month of maintenane therapy?? which was much more higher in relapse group than that of control group. Conclusion Detection of monoclonal IgH/TCRγ gene rearrangements by multiplex PCR with automated fragment analysis can be used as a method to monitor MRD during treatment for childhood ALL.     

应用实时聚合酶链反应技术检测儿童呼吸道标本中的呼吸道合胞病毒

目的建立实时聚合酶链式反应（PCR）技术检测儿科呼吸道标本中呼吸道合胞病毒（RSV）的方法.方法（1）根据RSV N基因序列设计合成分别用于扩增RSV A亚型和B亚型的TaqMan探针和引物,建立实时PCR方法,进行灵敏度和特异性检测.（2）采用实时PCR检测61例RSV检测阳性的冻存标本和103例新收集的呼吸道标本,并与病毒分离、间接免疫荧光、巢式PCR结果相比较.结果（1）实时PCR对A亚型RSV检测的灵敏度为5.25 pfu,B亚型为3.75 pfu,与巢式PCR相同.（2）实时PCR检测其他呼吸道病毒阳性标本,结果均为阴性;A亚型和B亚型之间无交叉.（3）实时PCR检测其他方法检测过的RSV阳性的冻存标本61例,A亚型（30例）阳性为27例（90%）,B亚型（31）阳性为27例（87.1%）.（4）103例新鲜标本中,实时PCR检出RSV 35例（A亚型7,B亚型28）,阳性率34.0%,其中巢式PCR阳性31例,阳性率30.1%;间接免疫荧光阳性22例,阳性率21.4%;病毒分离阳性9例,阳性率8.7%.实时PCR阴性的68例,其他方法均为阴性.实时PCR与三种方法的一致性检验,一致率在74.76%～96.12%（P均＜0.01）;差异性检验结果说明,实时PCR阳性检出高于间接免疫荧光和病毒分离（P均＜0.01）,而与巢式PCR差异无统计学意义（P＞0.05）.结论实时PCR检测儿科鼻咽分泌物标本中RSV的方法,敏感性、特异性和可重复性好,可用于急性呼吸道感染患儿标本中的RSV检测.     

16SrRNA基因PCR加反相杂交检测细菌DNA方法的建立与初步应用

目的探讨聚合酶链反应(PCR)加反相杂交技术在细菌DNA检测中的应用。方法以16SrRNA基因为靶序列,设计引物及寡核苷酸探针,采用PCR法加反相杂交检测标准菌株及临床标本细菌NDA。结果对20种标准菌株进行PCR扩增,均出现371bp长度的DNA片段,敏感性试验可检测出1×10-12g的细菌DNA,与人基因组及病毒无交叉反应;22份血培养阳性标本及4份脑脊液培养阳性标本均扩增出371bp长度DNA条带,反相杂交区分革兰阳性或阴性细菌与培养结果相符。结论16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检则细菌DNA,具有特异、敏感、快速、准确的特点,可为细胞感染的临床诊断提供依据。     

儿童急性T淋巴细胞白血病微小残留病检测的临床意义

目的：探讨急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）患儿微小残留病（MRD）监测的临床指导价值。方法采用多参数流式细胞术对2006年1月1日-2008年12月31日在北京儿童医院治疗的60例T-ALL患儿在治疗不同时间点进行追踪监测,分析不同MRD水平患儿的临床特征及预后。结果诱导治疗第33 d MRD≥1×10-4组患儿易复发,P＝0.03;诱导治疗第33 d MRD＜1×10-4组患儿预计5年无事件生存率（EFS）为100％,而MRD≥1×10-4组患儿5年EFS为（62.5±7.1）％,两组之间差异有显著性（P＝0.018）。结论监测T-ALL患儿MRD水平在评估早期治疗反应、监测复发以及估计预后中具有重要临床价值。