脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较

目的：对比脂质体与电穿孔法对 HepG2、SGC7901/ADM 两种细胞的转染效率。方法以 HepG2、SGC7901/ADM细胞为研究对象,采用脂质体法和电穿孔法分别转染pcDNA3．1‐EGFP质粒,流式细胞仪计算细胞存活率,借助绿色荧光标志蛋白eGFP测算转染效率。结果利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为（20．8±2．1）％,而电穿孔法转染效率增高至（49．6±2．5）％,二者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901/ADM细胞所获得的阳性转染率为（25．4±1．3）％,而电穿孔法转染效率增高至（52．6±2．1）％,二者比较差异亦有统计学意义（P＜0．05）。结论使用电穿孔法能明显提高大片段载体的转染效率。     

离体电转染pCAGGS．EGFP对小鼠视网膜神经节细胞的标记

目的：通过离体电转染将GFP对胚胎期小鼠视网膜神经节细胞（RGC）进行标记来观察其形态．方法：剥离胚胎小鼠E14的视网膜连同晶状体,放入定制的电转杯中进行电转染,以8～16V电压将pCAGGS—EGFP质粒导入RGC,体外培养视网膜1～5d,观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况。结果：以12V,50ms,950InS的间隔,5个脉冲转染效率最高,为81．25％：20～144h期间GFP依次由胞体向轴突、树突扩散分布。结论：在体外培养基中培养1～5d．pCAGGS—EGFP经过最适电压转染后能够在小鼠视网膜神经节细胞中持续扩散表达.     

小鼠肌肉内绿色荧光蛋白基因电转染

目的：将细胞电通透技术应用到DNA肌肉转染并确定达到高效电转染的参数条件。 方法：以增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因质粒作为报告基因,进行小鼠体内肌肉组织电转染实验,在部分参数固定情况下,某一参数发生变化,通过荧光显微镜观察、公式计算得出转染率,进行比较。确定转染的最佳电场强度、脉冲时值和质粒剂量。 结果：EGFP质粒15 μg注射到小鼠的胫前肌,在注入后给予如下参数,即电脉冲200 V•cm^-1,20 ms,1 Hz,8次,转染率最高,可达(73.2±7.2)%。EGFP质粒注射后不会在细胞外立即降解,注射质粒DNA 1 h内给予电脉冲不影响转染率;15 μg为最适当的DNA剂量;EGFP蛋白的表达,7 d达到高峰。结论：与单纯EGFP质粒肌肉注射相比,DNA肌肉电转染可极大地提高其转染率。     

MDR1/MRP反义寡核苷酸逆转胃癌细胞耐药的研究

目的:探讨MDR1/MRP反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodooxynucleotide,ASODN)片段逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药(Multidrugresistance,MDR)的作用.方法:经MDR1或多药耐药相关蛋白(Multidrugresistance-asscociated protein,MRP)ASODN分别或联合转染SGC7901/ADM细胞后,采用RT-PCR法检测MDR1mRNA和MRPmRNA的表达.免疫细胞化学检测SGC7901/ADM细胞内p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、MRP的表达,流式细胞术检测瘤细胞内Rh123的潴留状况,MTT法检测瘤细胞对阿霉素、卡铂等抗癌药的敏感性.结果:SGC7901/ADM细胞经ASODN转染12h后,MDR1和MRP mRNA的表达均降低,转染24h后下降最明显,48h后恢复至转染前水平.经转染ASODN48h后,SGC7901/ADM细胞P-gp、MRP的表达显著下降,瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于转染前,且联合转染MDR1和MRP ASODN后瘤细胞内Rh123的潴留量显著高于单纯转染组.SGC7901/ADM细胞在联合转染MDR1和MRP ASODN后对阿霉素、卡铂等化疗药物的敏感性明显高于单纯转染ASODN.结论:分别转染MDR1或MRP ASODN可部分逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM多药耐药,而联合转染2种ASODN则可显著提高瘤细胞耐药逆转效率.     

MDR1反义寡核苷酸逆转胃癌耐药的研究

目的探讨MDR1反义寡脱氧核苷酸(Antisense oligodooxynucleotide,ASODN)片段逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM耐药的可行性。方法经MDR1 ASODN转染SGC7901/ADM细胞后,采用MTT法检测瘤细胞对阿霉素抗癌药的敏感性;采用流式细胞术检测细胞周期的改变、细胞内Rh123的潴留状况;采用免疫细胞化学检测MDR1蛋白质表达水平的变化。结果SGC7901/ADM细胞经MDR1 ASODN转染48小时后,对阿霉素化疗药物的敏感性增强,细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50)由转染前的16.82μg/ml降至2.66μg/ml;与未经转染的SGC7901/ADM相比,ASODN/LF转染后出现明显的细胞周期阻滞,大量细胞被阻滞于S期;瘤细胞内RH123的潴留量显著高于转染前;瘤细胞内P-gp、MRP的表达显著下降。结论转染MDR1 ASODN可部分逆转人胃腺癌耐药细胞SGC7901/ADM耐药。     

电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

目的 通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件.方法 通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞.利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24 h后的转染效率.结果 在低电压模式下,脉冲电压320 V、质粒浓度为20 μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)％,细胞存活率为(74.30±3.01)％.结论 优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础.     

反义Survivin核酸对荷瘤裸鼠放疗敏感性影响的初步研究

目的 探讨反义Survivin核酸(anti-pcDNA3-svv)对荷瘤裸鼠放疗敏感性的影响.方法 采用电转染法转染胃癌细胞系SGC7901,观察转染组(SGC7901-SVVanti)和未转染组(SGC7901)在体内(裸鼠)和体外(细胞水平)对放射线敏感性的不同;采用免疫组化SP法对比转染组和未转染组裸鼠肿瘤中Survivin蛋白表达的不同.结果 SGC7901-SVVanti组细胞随着照射剂量的升高,细胞存活率明显低于SGC7901组,其IC50分别为(718.7±1.6)cGY和(1654.1 ±1.2)cGY,差异具有统计学意义(P＜0.05);相同剂量的X线照射裸鼠后,SGC7901-SVVanti组裸鼠的肿瘤缩减率明显高于SGC7901组裸鼠,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 Survivin反义核酸可以在体内、外水平增加荷胃癌细胞裸鼠对放射线的敏感性;抑制Survivin蛋白在裸鼠肿瘤中的表达.     

电穿孔转染SD大鼠神经干细胞条件优化

目的 以原代培养的SD大鼠神经干细胞为研究对象,优化电穿孔转染条件.方法 通过设置不同的电压、脉冲时间、电压脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的靶向大鼠β-catenin基因的siRNA质粒导入SD大鼠神经干细胞,48 h后观察并比较神经干细胞的转染效率,确定最佳电转染条件.结果 300V电压、60μs脉冲时间或300V电压、80μs脉冲时间的转染条件下,SD大鼠神经干细胞可获得较好的转染效率,分别为(62.21±11.56)％和(53.34±9.0)％.结论 电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化,可以提高SD大鼠神经干细胞的电转染效率     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染+丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义(F=6 250.510,q=56.992、51.613,P<0.01)。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

电穿孔法转染人树突状细胞条件的优化

目的:通过电穿孔法将带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorscent proteinEGFP)的真核表达载体pIRES2-EGFP(IRES2 internal ribosome entrysite 2 内部核糖体进入位点2)质粒导入未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC),探讨不同电穿孔条件对imDC电转染率和存活率的影响.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为imDC.在大肠杆菌中扩增pIRES2-EGFP质粒,选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量等.应用电穿孔仪将pIRES2-EGFP质粒导入未成熟树突状细胞,荧光显微镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数.0.4%锥虫蓝(trypan blue)染色,计数电转染后细胞存活率.结果:当imDC浓度为5×10<'6>/mL与6/μg DNA质粒混合,设定电转染仪电压为300 V、脉冲时间为500 μs时,其电转染率到最高,细胞存活率最高,转染后24 h明显表达,48 h后表达最强.结论:在适当的电压、脉冲时间下,选择适当的细胞浓度、DNA剂量,在转染后的一定时间范围内,电穿孔法转染imDC可使目的基因获得较高的转染率,且细胞死亡最少.电转染提供了外源基因转染imDC的可行技术.