Taqman实时荧光定量PCR快速检测白斑综合症病毒的方法研究

目的：建立一种快速、特异、灵敏的实时荧光定量PCR方法用于检测白斑综合病毒DNA，为控制对虾白斑综合症提供科学依据。方法：根据GenBank登录的白斑综合病毒株序列，使用生物学软件进行序列对比，在白斑综合症病毒保守区序列设计引物和Tagman探针并进行筛选。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化，提高了该方法的特异性、灵敏度和重现性等，并与标准方法(核酸探针点杂交)进行比对，对现场32份虾样进行了检测。结果：Tagman实时荧光定量PCR与标准方法的特异性符合率为100％，灵敏度超过标准方法的10000-100000倍，检测时间为标准方法的1／24，重现性良好(s=0．1-0．49，CV=0．78％-3．72％)，并能准确定量。结论：本研究建立的Taqman实时荧光定量PCR方法用于白斑综合症病毒检测具有特异、灵敏、快速、定量、重现性好等优点。     

从三疣梭子蟹中检出白斑杆状病毒的实验报告

白斑病毒是目前严重危害养殖虾类的病毒之一，今年4月份以来，我市一些养殖虾塘的对虾因感染了白斑病毒而大量死亡，我们对与其混养的三疣梭子蟹体内的白斑病毒带毒情况进行了检测，现将实验结果报告如下：     

3款荧光定量PCR仪检测甲型H1N1流感结果比较

[目的]比较3款荧光PCR仪对甲型H1N1流感样品检测结果的差异,为结果解释和仪器选择提供参考。[方法]对2009年8～12月间256份流感样标本同时采用3款荧光定量PCR仪(A、B、C)按照国家监测方案检测,定性结果进行卡方分析,定量结果采用方差分析及配对t检验。[结果]3款荧光定量PCR仪定性检测结果存在差异(χ2=19.554,P﹤0.001),其中仪器A、B检测结果无统计学意义(χ2=0.711,P=0.399﹥0.05),仪器A与C、仪器B与C检测结果差异有统计学意义(χ2=10.949,P=0.001,χ2=17.134,P﹤0.001)。定量检测结果与此类似。[结论]不同仪器对于甲型H1N1流感样品检测结果存在差异,在实际工作中应根据需要进行选择。     

荧光定量检测HBV—DNA临床分析

目的了解乙肝患者HBVDNA含量及HBV DNA阳性患者用药前后的疗效观察。方法应用荧光PCR扩增病毒核酸免疫技术定量检测6018例血清标本的HBVDNA含量。结果荧光定量PCR的特点与定性PCR主要区别在于荧光PCR即时反映扩增过程,采用内标法全封闭减少污染,高灵敏的自动化仪器对荧光的收集和分析能达到对原始模板量定量检测。结论用此方法可较准确及时地为临床提供科学的诊断依据,并对HBVDNA阳性病人用药前后提供可靠数据。     

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测西尼罗病毒

目的建立快速、敏感和特异的检测西尼罗病毒的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法，用于西尼罗病毒（WNV）疾病的早期诊断。方法采用RT—PCR扩增WNV基因片段，将其克隆至T载体，重组质粒测序并进行同源性分析；阳性质粒用于替代WNV，以阳性质粒为模板，建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法，并进行敏感性和特异性检测。结果经测序证实扩增片段属于WNV，所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR法可检测到10拷贝的西尼罗病毒RNA，而对其他黄病毒科成员日本脑炎病毒及登革热病毒的检测则为阴性，表明该方法特异。结论SYBRGreenⅠ荧光定量PCR简便快速，具有较高的敏感性和特异性，可以成为一种早期检测西尼罗病毒的新方法。     

基层单位筛查子宫颈癌方法探讨

目的:建立一种比较适用于基层医疗单位对子宫颈癌筛查的高效、便捷的方法,并初步探讨HPV-16,HPV-18与宫颈癌之间的关系。方法:2001年5月至2007年8月,对6802例年龄在18~65岁的厦门郊区妇女采用传统PCR检测HPV-DNA和宫颈脱落细胞涂片检查方法进行筛查,同时对HPV-DNA阳性标本进行高危险型HPV16、HPV18荧光定量PCR检测。结果:6802例宫颈脱落细胞普查中有宫颈原位癌29例、CIN(癌前病变)Ⅰ-Ⅲ级215例;PCR定性筛查这些标本中有783例阳性,阳性率为11.5%。对这783例阳性标本进行荧光基因分型和定量,发现209例HPV-16、18型阳性,在HPV-16、18型阳性的患者中宫颈原位癌22例(占75.8%)、CINⅠ-Ⅲ级153例(占71.6%),病毒定量值在3.6×103copies/ml到6.74×107copies/ml之间。结论:常规宫颈脱落细胞涂片检查联合HPV-DNA检测可提高宫颈癌前病变的检出率,适用于基层单位展开大规模子宫颈癌筛查,是一种高效、便捷的筛查方法。HPV16,HPV18与子宫颈癌具高度相关性。     

深圳市某校一起诺瓦克病毒性胃肠炎疫情调查分析

目的:调查以发热呕吐、腹泻为主要症状的胃肠炎的病因,查找传染源,以采取相应的控制措施。方法:采用流行病学调查方法对病例进行调查,对病人以及食堂员工肛拭、粪便以及环境样品采用实时荧光PCR进行定性检测。结果:经诺瓦克病毒基因检测,学生样本3例阳性;教师食堂员工样本阴性;环境样本1例阳性。6月15、19日对73名学生食堂员工进行诺瓦克病毒基因检测,分别有7例(9.6%)和5例(6.9%)阳性。25日,再次对73名食堂员工进行检测,全为阴性。通过测序分析比对,从食堂员工以及学生中检测出的诺瓦克病毒为同一型诺瓦克病毒。结论:该校学生胃肠炎是由诺瓦克病毒感染引起,学生食堂员工带毒是引起此次诺瓦克病毒发生流行的传染源。     

RT—PCR法与病毒分离结合快速检测腮腺炎病毒核酸

目的结合病毒分离技术，运用RT—PCR法对腮腺炎病毒的核酸进行检测，为快速确诊提供参考。方法采用中国疾病预防控制中心提供的RT-PCR法，结合病原学检测技术对2010—2013年已检测出的腮腺炎病毒进行复检。结果对近4年分离到的18份腮腺炎病毒分离液进行检测，病毒核酸结果均为阳性；应用病毒分离技术检测，有15份为阳性，经中国疾病预防控制中心鉴定为F基因型。结论该方法比病毒分离方法敏感性高，所需时间短，仅需要5～6个小时即可得出结果，为可靠的实验室诊断方法。     

荧光定量PCR在孕妇HCMV感染检测中的应用研究

目的使用荧光定量PCR检测孕妇尿液中HCMV-DNA,提高该人群中病毒检出率。方法对广西南宁和桂林两地共600名孕妇进行尿液HCMV-DNA检测,同时进行血清HCMV-IgG和HCMV-IgM检测,对比以上两种方法在产前诊断中的应用价值。结果尿液HCMV-DNA阳性率为8.50%(51/600),血清HCMV-IgG阳性率为98.8%(593/600),HCMV-IgM阳性率为1.83%(11/600)。结论相对于传统的酶联免疫检测法,荧光定量PCR可明显提高孕妇病毒检出率,并且提供定量数据,同时使用荧光定量PCR和ELISA将为临床提供更加准确的实验室诊断结果。     

ELISA法检测乙肝两对半与荧光定量PCR检测HBV-DNA的比较

乙型肝炎病毒是当今流行最广泛,危害最严重的病毒性肝炎之一,相当一部分乙肝携带者可以发展成慢性肝炎,需要接受病毒治疗.目前多以其血清感染标志物乙肝两对半及HBV-DNA定量,作为临床分析和判断乙肝患者病情、疗效及预后的主要依据,但由于两对半的组合模式复杂多样,导致部分患者的HBV感染复制状况难以判断,而HBV-DNA是乙肝病毒感染和复制的特异性指标,是表明其具有传染性的最有力的证据.但是受到实验室要求较高的严格限制,尚无法普及检测,为了进一步探讨乙肝两对半与HBV-DNA定量结果之间的关系.本文对ELISA法检测乙肝两对半与荧光定量PCR检测HBV-DNA的比较进行分析比较.     

沙眼衣原体DNA的荧光定量PCR检测

沙眼衣原体(CT)的实验室检测技术主要分为细胞培养观察包涵体的经典细胞生物学方法；免疫学方法和以核酸扩增技术为代表的分子生物学检测方法。长期以来一直以前者作为沙眼衣原体感染诊断的金标准，但该方法操作复杂，技术要求高，所需时间长，所受影响因素多，因此，一直未得到普遍应用。本实验采用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitatire PCR，FQ-PCR)方法，检测沙眼衣原体，克服了上述缺点，取得了较好的效果。现报告如下。     

水中诺如病毒浓缩与应急检测研究

目的探索适合于基层实验室开展的水中诺如病毒浓缩与应急检测的方法,评估钙离子法对水体中诺如病毒的富集效果及检测灵敏度,为水源性诺如病毒突发疫情的病原检测提供可靠的检测数据。方法将不同浓度的指示病毒(GⅡ型诺如病毒)加入到不同水样中,用钙离子法进行富集,用荧光定量PCR检测,根据富集前后的病毒浓度,评估方法的回收率;根据不同梯度的检测值,评估方法的灵敏度。同时制备不同的模拟水样进行荧光定量PCR检测。结果钙离子法的平均回收率为81.6%,检测灵敏度为模拟样本中病毒浓度为10 copy/μl。而10份不同模拟水样荧光定量PCR检测阳性9份。结论钙离子法浓缩水样中的诺如病毒,回收率与灵敏度均较高,操作简单;同时,荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点,适用于基层实验室开展水体中诺如病毒的应急检测。     

新型液相芯片系统在食源性致病菌快速检测中的应用研究

目的:评估一种新型液相芯片系统应用于食源性致病菌进行快速检测的可行性。方法:使用荧光多重PCR技术以及液相芯片检测系统对食源性致病菌进行快速检测。结果:荧光多重PCR技术结合液相芯片检测系统能够对多种食源性致病菌在8 h内实现定性和半定量检测,其灵敏度、特异性、抗干扰能力明显优于传统方法。结论:基于荧光多重PCR技术的液相芯片系统操作简便、干扰少、检测结果准确可靠,能够应用于食源性致病菌快速检测。     

实时荧光定量PCR技术及其在生命科学领域中的应用(一)

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术是在PCR定性技术基础上发展起来的用不同荧光定量核酸的技术,具有敏感性高、重复性好、速度快、操作简便和污染少等优点。本文综述FQ-PCR技术的原理、特点、目前常用FQ-PCR仪、定量方法、实验条件及实验中的主要影响因素及FQ-PCR技术在生命科学领域中的应用和研究进展。     

实时荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌研究中的应用

<正>核酸扩增技术特别是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)可对不同来源的核酸进行定性检测,但需在PCR反应终止后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,这不仅无法准确定量,而且还容易发生交叉污染,产生假阳性。     

实时荧光定量PCR技术及其在生命科学领域中的应用(二)

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)技术是在PCR定性技术基础上诞生起来的用不同荧光定量核酸的技术,具有敏感性高、重复性好、速度快、操作简便和污染少等优点。本文综述了FQ-PCR技术的原理、特点、目前常用FQ-PCR仪、定量方法、实验条件及实验中的主要影响因素及FQ-PCR技术在生命科学领域中的应用和研究进展。     

实时荧光PCR检测诺瓦克病毒的应用研究

目的应用实时荧光PCR方法对诺瓦克病毒性急性胃肠炎进行快速检测，为疾病预防控制提供准确可靠的实验诊断依据。方法采集一起急性胃肠炎暴发流行患者的1份粪便、5份肛拭和1份呕吐物，进行实时荧光PCR检测。结果实时荧光PCR检测有1份病人粪便和1份病人肛拭样本中诺瓦克病毒核酸呈阳性。结论这是一起由诺瓦克病毒感染引起的急性胃肠炎暴发流行。     

移植患者外周血单个核细胞与血浆中HCMV-DNA检测结果比较

目的研究移植患者血浆与外周血单个核细胞中HCMV-DNA的检测结果比较。方法采用实时荧光定量PCR方法对425份移植患者分别做血浆及外周血单个核细胞(PMBC)中巨细胞病毒检测,对两组的定性和定量结果分析比较。结果血浆样本阳性62份(占14.59%),PMBC为43份(占10.12%),两组差异有统计学意义。其中两者均阳性为35份,PMBC阳性但血浆阴性为8份,血浆阳性但PMBC阴性为27份,两组又有较高的阴性(92.93%)和阳性(81.40%)符合率。并对定量结果进行分析比较,PMBC检测结果灵敏度明显高于血浆。结论相较于常规的免疫法和pp65,血浆中巨细胞病毒核酸定量测定对于巨细胞病毒活动性感染的诊断具有高度的灵敏性和特异性,PMBC中巨细胞病毒核酸定量检测的高灵敏度对于血浆学检测具有补充辅助意义。同时检测,能够更好地提高移植患者巨细胞病毒的检出率。     

新型冠状病毒核酸检测样本DNA污染鉴别方法研究

目的 采用不同实时荧光PCR方法检测各类型DNA污染模拟样本,分析检测方法性能,为在新型冠状病毒(简称新冠病毒)核酸检测中鉴别DNA污染提供依据。 方法 取实验室保存的新冠病毒RNA核酸样本和新冠病毒阳性质控品(含病毒序列的质粒样本),按不同比例混合,并进行梯度稀释,制成模拟样本。分别使用实时荧光RT-PCR、灭活逆转录酶前加样并去除RT步骤的PCR(PCR Set 1)和灭活逆转录酶后加样并去除RT和灭活步骤的PCR(PCR Set 2)三种不同方法,使用同一型号设备对同一批模拟样本进行检测。记录并分析检测结果,确定最佳的DNA污染判断方法。 结果 新冠病毒RNA核酸样本中,相比实时荧光RT-PCR,PCR Set 1下所有样本的Ct值增高2-4个循环,PCR Set 2中除原始样本N基因阳性外,均为阴性。新冠病毒DNA污染样本三种方法检测Ct值无明显差异。含等量DNA污染的混合污染样本和含梯度DNA污染的混合污染样本三种方法检测显示Ct值存在差异。三种方法检测不同新冠病毒基因,变化规律无明显差异。 结论 PCR Set 1和PCR Set 2两种方法均可用于鉴别DNA污染,特别是PCR Set 2方法对各浓度的DNA污染均有较好的区分能力。     

PCR技术在致病菌检测中的应用

[目的]聚合酶链反应(PCR)技术以其具有的特异性强；灵敏度高，快速准确，自动化高的特点，被广泛的应用于医学、生命科学、农业科学、环境科学、考古学等领域。PCR技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径；对传染性病原菌的诊断提供了快速、灵敏的检测手段。为此，对国内应用PCR技术检测致病菌的研究成果作一综述，供同行借鉴。