骨形态发生蛋白-7基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因转染对新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧时凋亡的影响.方法 体外培养的新生大鼠心肌细胞分为3组:正常对照组(C组)、缺氧-复氧组(HR组)培养的心肌细胞置于95%N2-5%CO2混合气体饱和的缺氧罐中缺氧2 h后,放回孵育箱中继续培养4 h;BMP-7基因转染组(BT组)将含pcDNA3.1-BMP-7基因的质粒在转染试剂作用下转染心肌细胞后72 h再行缺氧2 h,复氧4 h.每组重复8次.计数心肌细胞搏动次数,采用全自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶(LDH)活性.倒置显微镜下观察心肌细胞形态.采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况,免疫细胞化学方法测定Bcl-2、Bax蛋白的表达.结果 与c组相比,HR组和BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率增加,Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.05);与HR组相比,BT组心肌细胞LDH活性、细胞凋亡率降低,Bax蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调(P＜0.05).结论 BMP-7基因转染可减轻新生大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤,其机制可能与调控Bcl-2、Bax蛋白的表达,抑制心肌细胞凋亡有关.     

纳米粒子介导反义mTOR基因转染抑制移植静脉内膜增生

目的:观察以纳米粒子为载体的外源性反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法:应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载mTOR基因，制备纳米级粒子混合物。建立自体静脉移植模型72只，随机分成转基因组(转染以纳米粒子为载体的反义mTOR基因)，空载体组(单纯转染纳米粒子包载的空载体)和对照组(不予特殊处理)。分别于术后3，7，14，28d取材。检测mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达，以及血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。 结果:转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少(P<0.05)；转基因组内膜增生厚度于7，14，28d较其他组明显减少(P<0.01)；转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P<0.05)。结论:纳米粒子可以作为转基因载体。反义mTOR基因的表达能有效抑制自体移植静脉内膜的增生及促进VSMC凋亡。     

乙型肝炎病毒X基因转染人胆管癌细胞系及对端粒酶逆转录酶mRNA表达的影响

目的了解乙型肝炎病毒X(HBx)基因转染对胆管癌细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达影响,阐明HBx基因调节hTERT基因转录表达在胆管癌发生中的意义。方法体外培养胆管癌细胞QBC939,应用脂质体介导的基因转染技术,将含HBx基因的真核表达载体转染到胆管癌细胞中;转染36h后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达判定转染成功率,流式细胞仪检测转染率;收集细胞提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析转染后细胞内hTERT mRNA的表达变化,并通过细胞免疫化学和Western Blotting了解转染后胆管癌细胞内有无HBx蛋白的表达。结果转染含HBx基因表达载体和空载体的QBC939转染率为29．6％;转染HBx基因后hTERT mRNA表达量比未经转染或转染空载体的hTERT mRNA表达量明显增加;细胞免疫组化和Western Blotting也证实只在转染了HBx基因的胆管癌细胞有HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能上调胆管癌细胞hTERT mRNA的转录表达。     

氧化还原酶基因对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨氧化还原酶基因(WWOX)对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染甲状腺乳头状癌细胞株K1(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空质粒组)及未经转染(空白对照组)的K1细胞作为对照.合成针对WWOX的靶向小干扰RNA(WWOX siRNA组)转染甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1,以空白细胞(空白对照组)和转染脂质体试剂(脂质体对照组)作为对照组.采用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测转染前后WWOX基因mRNA水平.采用Western blot法分析WWOX基因对甲状腺乳头状癌凋亡相关蛋白的影响.结果 重组质粒组细胞中WWOX mRNA能稳定表达,是空质粒组及空白对照组细胞WWOX mRNA表达的4.5倍(P＜0.05).WWOX siRNA组WWOX mRNA表达明显下降,是对照组的0.2倍(P＜0.05).重组质粒组较空质粒组及空白对照组凋亡相关蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).相反,WWOX siRNA组与对照组比较,细胞凋亡相关蛋白表达明显下降(P＜0.05).结论 WWOX基因能促进甲状腺癌细胞的凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡信号通路有关.     

c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞的保护作用

目的 观察c-jun反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清刺激下大鼠心肌细胞的保护作用。方法 培养大鼠心肌细胞，分为：(1)正常对照组；(2)转染组：构建c-jun反义基因重组体并转染人心肌细胞，随后进行缺氧复合烧伤血清刺激；(3)非转染组：仅进行缺氧复合烧伤血清刺激，不作其他处理。于刺激后l、3、7h，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测c-jun mRNA的表达变化；用Western blot检测c-jun蛋白、肌钙蛋白T(TnT)和β-微管蛋白的表达变化；在光镜和电镜下观察心肌细胞形态结构改变。结果 (1)与正常对照组比较，非转染组c-jun mRNA与蛋白表达显，转染组较非转染组显下降。(2)与正常对照组比较，非转染组TnT与β-微管蛋白表达显下降，转染组较非转染组明显回升。(3)转染组心肌细胞骨架结构基本保持完好，偶见断裂与溶解。非转染组骨架网状结构紊乱、溶解与断裂，呈颗粒状。结论 缺氧复合烧伤血清刺激可使大鼠心肌细胞c-jun表达上调，进而引起心肌细胞损伤，c-jun反义基因重组体转染对该刺激条件下的心肌细胞具有保护作用。     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.     

反义雷帕霉素靶蛋白基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

目的:观察以纳米粒子为载体的反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法:应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载mTOR基因,制备纳米级粒子混合物。检测其包埋率、体外释放情况及粒子大小。建立自体静脉移植模型,随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组移植静脉转染以纳米粒子为载体的反义mTOR基因,空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体,对照组不予特殊处理。分别于术后3d、7d、14d、28d取材,常规HE、Verhoeff染色,RT-PCR、Westernblot检测mTOR基因的mRNA及蛋白的变化,TUNEL法观察血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。结果:转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少(P<0.05);转基因组内膜增生厚度7d、14d、28d较其他组明显减少(P<0.01);转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P<0.05)。结论:纳米粒子可以作为转基因载体,反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生,促进VSMC的凋亡。     

宫腔内脂质体转染技术在围着床期小鼠子宫内膜表达的研究

目的探讨宫腔内脂质体转染法对围着床期小鼠子宫内膜进行基因修饰的可行性。方法于小鼠妊娠第2天(D2),通过宫腔内脂质体转染法分别介导绿色荧光蛋白基因,Meis1表达基因、Meis1小分子干扰RNA(siRNA)及其各自对照空载体进入孕鼠子宫内,于转染后第3天(D5)荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹和免疫组织化学法检测Meis1基因在基因转染上调组及其对照组,下调组及其对照组的表达变化。结果绿色荧光蛋白可在小鼠子宫组织内表达;Meis1基因上调组其mRNA和蛋白水平明显高于对照组,而Meis1基因下调组其mRNA和蛋白水平明显低于对照组。结论宫腔内脂质体转染法可以介导外源基因在小鼠子宫中表达,并可对小鼠子宫内膜着床相关基因的表达进行调控。     

FasL基因转染对大鼠同种异体心脏移植的影响

目的 观察转染FasL基因在心脏移植中是否可以诱导出一定程度的免疫耐受.方法 取SD大白鼠为受体,Wistar大白鼠为供体,各68只,分成3组,Ⅰ组:20只,心脏直接进行移植;Ⅱ组:20只,单用多聚乙烯亚胺(PEI)转染心脏后移植;Ⅲ组:28只,供心移植前用PEI介导克隆大鼠FasL(rFasL)基因转染,质粒DNA(μg)∶PEI(μl)=20∶40.分别检测移植心脏存活时间、心肌组织的苏木素-伊红(HE)染色、FasL的表达、原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测心肌组织的原位细胞凋亡、Western blot法检测FasL蛋白水平.结果 (1)Ⅲ组移植心脏的存活时间为(17.8 ±0.6)d,较另2组明显延长(P＜0.01).(2)Ⅰ组和Ⅱ组心肌组织的FasL水平渐升高,但前3d均未超过40％,Ⅲ组FasL水平在移植后3 d即达较高水平(63.65 ±3.31)η％ (P ＜0.01).(3)随着移植时间的延长,Ⅲ组心肌组织细胞凋亡指数由(13.40 ±3.46)细胞数/mm2最终升至(48.90±6.91)细胞数/mm2(P＜0.05),凋亡细胞大多为浸润的炎性细胞,但Ⅰ组和Ⅱ组有大量的心肌细胞凋亡.(4)Ⅲ组FasL mRNA的转录强度和蛋白表达均比Ⅰ、Ⅱ组明显升高.结论 适当浓度的FasL基因转染移植心脏,可以诱导出一定程度的免疫耐受.     

纳米粒子载体携带反义转化生长因子-β1基因的局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的探讨纳米粒子携带反义转化生长因子(TGF-)β1局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法45只大鼠制成自体静脉移植模型后,分成纳米粒子DNA组、纳米粒子空载体组和生理盐水对照组,进行局部定位转染,2周后观察移植静脉内膜的变化,应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Westernblot以及免疫组织化学等方法检测反义基因对内源性TG-Fβ1表达的影响。结果基因转染后两周,内膜厚度为(20.5±4.7)μm,明显小于两个对照组(P<0.01)。RTPCR和Westernblot结果表明,基因转染组的TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显低于空载体组及生理盐水对照组。结论纳米粒子可有效地作为基因的转移载体;纳米粒子携带反义TGF-β1可以减少内源性TGF-β1基因的表达,抑制细胞外基质(ECM)的合成,从而达到抑制内膜增生的目的。     

HyTK基因逆转录病毒重组质粒的构建及其在PA317细胞中的高表

目的:为开展逆转录病毒介导的HyTK基因治疗恶性肿瘤奠定实验基础。方法:利用逆转录病毒载体与潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的融合基因(HyTK)连接构建重组质粒pL(HyTK)SN,应用新一代的非脂质体基因转导系统FuGENETM6将构建的pL(HyTK)SN导入Ψ2单嗜性包装细胞并获得瞬间表达,继而再转染PA317双嗜性细胞。结果:获得高滴度重组病毒,上清逆转录病毒滴度为5.4×106cfu/ml。结论:所构建的HyTK基因可用于治疗恶性肿瘤。     

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目的 研究构建重组表达体系pCKM-mPTH质粒，寻找甲状旁腺功能低下症的基因治疗途径。方法 采用重叠聚合酶链反应(PCR)法、巢式PCR法及粘端连接法构建pCKM-mPTH质粒，以脂质体转染骨骼肌细胞，用β-actin半定量和放免法分别测定其在细胞内外的表达。结果 嵌合基因pCKM-mPTH质粒测序完全符合已知核苷酸序列，并完成定点突变，转染骨骼肌细胞后，β-actin半定量法测得mPm在细胞内成功高效表达，放免法测得24h克隆细胞培养液中甲状旁腺激素蛋白的含量为26．37ng／L。结论 成功构建了SD(Sprague Dew-ley)大鼠重组基因表达体系pCKM-mPTH质粒，并证实其在骨骼肌细胞中有高效表达。     

人生长激素基因的克隆、高效表达及纯化

目的 研究人生长激素(hGH)基因在原核中的高效表达、纯化及鉴定。方法 设计带双酶切位点引物,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得hGH cDNA片段,并亚克隆入pUC19质粒中进行 DNA序列测定。将 hGH cDNA片段克隆入原核表达载体 pBV220中进行表达。表达产物经 7mol/L 盐酸胍裂解变性、复性、层析等一系列纯化研究,纯化产物经SDS-PAGE电泳,高压液相色谱法(HPLC)纯度分析及活性测定,并通过N末端氨基酸序列测定鉴定表达产物。结果 RT-PCR扩增所得片段大小与预期值一致。pBV220-hGH表达产物经SDS-PAGE电泳显示,分子量为 22×10~3与预计结果相符。rhGH表达量占菌体总蛋白量的 40％。表达产物纯化后,纯度达 97％以上,比活性大于 3.0 IU/mg。纯化产物经 N末端 15个氨基酸测定验证,为重组人生长激素。结论 成功构建了 pBV220-hGH原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,表达产物经纯化得到纯度≥97％的 rhGH,比活性大于 3.0 IU/mg。该研究为 rhGH的中试生产奠定了基础。     

纯化结肠癌组织基因表达谱的变化

目的通过构建纯化正常结肠上皮组织和结肠癌组织基因表达谱筛选结肠癌相关基因。方法应用激光捕获显微切割-线性扩增-全基因组基因芯片流程对结肠癌组织及其相应正常结肠上皮组织进行实质细胞纯化并构建基因表达谱，筛选差异表达基因。结果纯化正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞分别有14939和15276条基因表达。肿瘤组织差异表达基因中4倍以上者208条，其中上调基因72条，下调基因136条。上调基因前20条和下调基因前20条中，10条基因的表达变化在结肠癌中的意义已被证实，另有13条基因的表达变化在其他肿瘤研究中与以前报道一致。结论细胞纯化技术结合基因芯片构建基因表达谱可准确、高效的筛选结肠癌差异基因。     

携带融合基因CTLA4-Ig重组腺病毒载体的构建及表达

目的　为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导移植免疫耐受的研究 ,构建携带融合基因CTLA4 Ig的重组腺病毒载体。方法　构建含人CTLA4 Ig的重组腺病毒载体质粒pShuttle Tracker CMV CTLA4 Ig ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1 △E1、△E3共转化大肠杆菌BJ5 183 ,经细菌内同源重组 ,获得重组腺病毒质粒pAd Tracker CTLA4 Ig ,转染 2 93细胞 ,制备携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,体外感染L O2细胞 72h后ELISA检测其外分泌性表达。 结果　获得携带CTLA4 Ig的重组腺病毒 ,滴度为 6× 10 1 3 PFU L ;在其感染的L O2细胞培养上清中能检测到可溶性重组蛋白CTLA4 Ig的表达 (P N =4.6 ,阳性 )。结论　制备的重组腺病毒在体外能有效感染L O2细胞 ,受感染细胞能表达、分泌可溶性的融合蛋白CTLA4 Ig ;为进行体内移植免疫耐受的基因治疗研究奠定基础。     

妊娠早期小鼠子宫内膜原癌基因H-ras的表达

目的 :本实验检测原癌基因 H-ras的转录和翻译水平在妊娠早期小鼠子宫内膜的表达规律。方法 :采用反转录聚合酶链反应 ( RT-PCR)、免疫转移印迹 ( Western-blot)和免疫斑点印迹 ( Dot-blot)法。结果 :原癌基因 H-ras在妊娠早期小鼠子宫内膜的表达呈现两个峰值 ,分别为妊娠的第 1和第 6、7天。结论 :提示原癌基因 H-ras参与了胚泡着床过程及胚胎的早期增殖与分化过程     

CD基因联合GM-CSF基因对胰腺癌治疗作用的实验研究

目的：观察自杀基因CD联合GM—CSF基因的抗胰腺癌作用。方法：应用逆转录病毒方法转导CD和GM—CSF基因。皮下接种胰腺癌细胞TD2，肿瘤局部注射重组表达的pVITR02-CD-GM—CSF，然后连续10d给予5-氟胞嘧啶（5-Fc）300mg／kg治疗，观察肿瘤的生长情况。结果：CD／5-Fc联合GM—CSF治疗后，小鼠肿瘤体积显著缩小，存活期明显延长，与对照组以及GM—CSF组和CD／5-Fc组比较差异有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01），且肿瘤瘤体内CD8^＋细胞浸润增加，MHC—Ⅰ和B7—1表达明显增加。结论：CD基因联合细胞因子基因GM—CSF可增强CD的抗肿瘤作用，其疗效要好于GM—CSF或CD基因单独治疗。     

肠粘连引起肠梗阻的基因水平研究

目的通过分析基因层面的差异表达,以探讨与肠梗阻相关的发病基因和治疗靶基因。方法在基因表达公共数据库（geneexpressionomnibus,GEO）中收集到10个样品的基因表达数据,其中小鼠粘连小肠组织术后1、3、7、和14d时间点的基因芯片数据共8个,小鼠正常小肠组织芯片数据2个,应用基因本体论（geneontology,GO）富集分析和微阵列显著性分析（significanceanalysisofmicroarray,SAM）方法,分析10个样品的基因表达情况,并对差异表达的基因进行功能注释和生物学分析。结果肠粘连的发生伴随着大量应答刺激的基因表达上调,且这些基因产物都分布在细胞膜上。分析术后不同时间点的基因表达情况发现,Hmgcs2基因的表达上调出现在术后3～14d,融助5基因的表达上调出现在术后14d。结论粘连的发生可能与应答刺激的基因及其分布于细胞膜上的基因产物有关,Hmgcs2和s抚幼5基因可能与因粘连而导致的其他并发疾病的发生有关。这为发现肠梗阻潜在的治疗靶点提供了依据。     

增生性瘢痕相关基因的筛选

目的　利用基因芯片技术寻找增生性瘢痕形成过程中的相关基因 ,并发现相关基因间的相互关系 ,探讨增生性瘢痕的机理。方法　选择 6例标本 ,3例增生性瘢痕与 3例正常皮肤 ,分成 3组 ,提取各个标本的总DNA ,制成荧光标记的cDNA探针 ,与含 4 0 0 0个人类靶基因的芯片 ( 15 0 0个为已知基因 ,2 5 0 0个为未报道或未知功能的基因 )杂交 ,经扫描、生物信息学分析比较两种组织间的差异表达。结果　增生性瘢痕与正常皮肤的差异表达基因在 3组间仅出现 1次的有 3 96个、重复 2次出现的有 186～ 2 4 2个、共同出现的有 116个 ,其中上调 10 8个、下调 8个 ,涉及 13大类基因 ,包括抑癌与原癌基因、细胞凋亡、细胞骨架与运动蛋白、细胞周期类蛋白等 ,有些为已知基因 ,有些仍未知其功能。结论　基因芯片扫描对研究增生性瘢痕有效可靠 ,发现多种基因参与了增生性瘢痕的形成过程     

p53、bcl-2、c-erbB-2在胃癌及癌前病变中表达的意义

目的：研究p53、bcl-2、c-erbB-2基因在胃癌及癌前病变中的表达，探讨其与胃癌发生的关系。方法：采用免疫组化SABC法，检测p53、bcl-2、c-erbB-2基因蛋白在98例胃癌、39例肠上皮化生、40例不典型增生和20例正常胃粘膜中的表达。结果：①p53在胃癌中的阳性表达率为55．1％，早期胃癌和进展期胃癌分别为50．0％，55．4％；在肠上皮化生中的表达率为12．8％，与早期胃癌比较有统计学差异（P〈0．05），随不典型增生程度的加重p53的表达率逐渐升高，依次为5％，20％，60％，其中轻中度与重度不典型增生差异有统计学意义（P〈0．05），而在正常胃粘膜中未见p53表达②bcl-2在正常胃粘瞑中有弱阳性表达（10．0％），在不典型增生中为50．0％，在胃癌中为44．9％，不典型增生与胃癌中的表达均显著高于正常胃粘膜（P〈0．05）。③c-erbB-2在胃癌中的阳性表达率为55．1％，其中在早期胃癌中的表达率较低（16．7％），在重度不典型增生和进展期胃癌中的表达率较高，分别为60．0％和57．6％，二者与早期胃癌比较差异有统计学意义（P〈0．05）。④c-erbB-2表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关（P〈0．05），与胃癌分化程度无关（P〉0．05）；bcl-2表达与胃癌的分化程度有关（P〈0．05），低分化者bcl-2表达率高，与淋巴结转移，浸润深度无关（P〉0．05）；p53表达与上述临床病理因素均无关（P〉0．05）。结论：p53，bcl-2，c-erbB-2参与了胃粘膜的癌变过程。