腺病毒载体疫苗研究进展

腺病毒不整合到宿主基因组、具有极低的插入突变风险,因此腺病毒载体广泛用作基因治疗载体。此外,腺病毒载体诱导机体产生免疫应答,有较高的热稳定性,使其成为极具潜力的疫苗载体。2019年新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的暴发使人们更加关注腺病毒载体疫苗的应用。接种疫苗仍是预防、控制包括COVID-19在内传染病最经济有效的手段,目前已开发出多种基于腺病毒载体的疫苗。本文综述了腺病毒载体基本性质、免疫机制、临床应用以及研发进展。     

腺病毒载体的研究进展

近年来,随着基因治疗和重组疫苗研究的深入,作为其基础的载体的研究有了突飞猛进的发展.腺病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的一种病毒载体[1],本文就腺病毒载体的研究进展作一综述.     

腺病毒载体的研究进展

基因治疗正在成为肿瘤治疗的有效手段,用于携带外源基因的载体在肿瘤的基因治疗中发挥了重要作用。其中腺病毒载体因宿主范围广、感染率高、病毒相对容易制备且不会与受染细胞发生整合等诸多优点,成为基因治疗中应用最为广泛的载体系统。肿瘤的基因病毒治疗是指在肿瘤特异性增殖病毒中加入抗癌基因,将肿瘤的基因治疗与病毒治疗各自的优势结合起来,可靶向杀伤肿瘤细胞,保护正常细胞免受严重伤害。     

腺病毒载体及其应用

随着疾病分子水平机理研究的不断深入,基因治疗已成为很多疾病防治及医学研究工作新的切入点。理想的基因治疗方案需具备有效性与安全性,因此安全有效的基因转导载体及技术是决定基因治疗成败的关键。在众多的基因转导载体中,重组腺病毒载体能利用病毒自身感染宿主细胞的特点,简便有效地将目的基因导入靶细胞,并使其有效表达。而且腺病毒为DNA病毒,极少发生插入突变,载体操作方便、宿主广泛、容易增殖,并具有携带外源基因容量大,可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点,已被广泛用于多种疾病的基因治疗。本文拟就腺病毒载体的构建,载体效能…     

腺病毒分型诊断研究进展

人腺病毒(human adenoviruses,HAdVs)共有51种血清型,根据免疫学、生物化学等特性又可以分成6个亚型(A～F)[1].腺病毒可以感染呼吸道、肠道、眼睛、膀胱以及肝脏,并造成流行病传播.拥有正常免疫力的人感染腺病毒后一般会产生抗体,自行治愈;对于免疫力受到抑制的病患或者儿童来说,腺病毒感染可能是致命的[2].在过去数年中,腺病毒作为一种基因载体被广泛应用于基因治疗中,而腺病毒感染会阻碍这种基因治疗的疗效[3-4].在51种血清型当中,1～8,19,21,35血清型都与严重急性呼吸道疾病相关,其中7型腺病毒,和毒力相对较弱的3型是致病性最高的两种.这两种同为B类的腺病毒所导致的下呼吸道感染占所有腺病毒导致感染的50%[5].因此,及时、准确的对感染现病毒类型进行分型对于疾病的治疗是相当有必要的.     

腺病毒载体的PEG修饰及其特性研究

目的：本研究通过对腺病毒载体（Adv）进行聚乙二醇（PEG）修饰,以达到改善Adv在体内免疫原性较强、血液半衰期短的不足.方法：使用活化的甲氧基PEG对Adv衣壳蛋白质进行修饰得到PEG化Adv（PEG-Adv）,用A549细胞评价了PEG-Adv的抗体抵抗能力、基因转导能力,并以体内试验考察其半衰期.结果：用本实验方法可通过调整反应中的PEG量控制Adv的PEG修饰率,PEG-Adv的血液半衰期及抗体抵抗能力显著优于普通Adv.结论：Adv经PEG修饰后,可显著改善Adv血液半衰期短、易被抗体中和等缺点,对开发高效的、有理想药动学特征的Adv具有重要意义.     

HBsAg腺病毒疫苗载体的构建

目的:构建含HBsAg基因的重组复制缺陷型腺病毒疫苗载体.方法:以pEcob-6为模板,PCR扩增目的基因HBsAg,腺病毒穿梭载体PAd-track-cmv与HBsAg经T4连接酶连接,重组为PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒;腺病毒骨架载体质粒PAd-Easy-1再与PAd-track-cmv-HBs在大肠杆菌BJ-5183中同源重组为PAd-Easy-1-HBs质粒.结果:PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒经上海基康生物技术公司进行DNA测序,结果与预期结果相同,含有完整的HBsAg目的基因.PAd-Easy-1-HBs用Pac-1酶切,Pac-1能将载体切成两个片段,大片段约为30 kb,小片段约为3 kb.结论:HBsAg腺病毒疫苗载体构建成功,为进一步研究PAd-track-cmv-HBs诱发抗HBV免疫打下了基础.     

基因治疗与腺病毒载体

基因治疗与腺病毒载体张德礼，逯好英，郭庆福，高步先，朱关福（中国军事医学科学院基础医学研究所，北京１００８５０）８０年代末以来，人类基因治疗从基础研究步入临床试验，预计本世纪末将成为一种新的常规治疗方法。迄今，经美国国立卫生研究院（ＮＩＨ）批准进入临...     

腺病毒介导胸苷激酶基因治疗肝癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导胸苷激酶基因联合抗病毒药物对人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）的杀伤作用。方法：利用腺病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）导入体外培养的ＨｅｐＧ２中,再加入羟基无环鸟苷（ＧＣＶ）,观察其对ＨｅｐＧ２细胞的杀伤效应。结果：在感染复数（ＭＯＩ）小于１００或ＧＣＶ浓度小于４００ｕｇ／ｍｌ范围内,单独应用载体或ＧＣＶ,对培养细胞的形态与存活率均无明显影响。当两者合并应用时,ＧＣＶ在     

抗腺病毒载体单克隆抗体的制备及其初步鉴定

目的 研制抗腺病毒载体(Adv)表面蛋白的单克隆抗体(McAb).方法 将Adv以Al(OH)3佐剂化,常规免疫BALB/c小鼠.采用细胞融合技术制备抗Adv McAb;采用ELISA、免疫细胞化学及Western blot法对McAb进行筛选与鉴定.结果 共获得6株可稳定分泌特异性McAb的细胞(A4H11、A8C7、F1H5、G1D2、G4E3、H2G8),其染色体数目为102～106条,所分泌McAb均属IgG1亚类,持续3个月适应培养仍能保持其稳定的抗体分泌能力.腹水抗体的ELISA效价在1∶106～1∶108之间;Western blot结果显示6株McAb均与来自腺病毒载体及野生3、5、7型腺病毒抗原提取物中分子量约为114 kD的多肽反应,据此推测它们均是抗ADV-TK六邻体蛋白的McAb.结论 成功制备出6株抗腺病毒载体六邻体单克隆抗体,为腺病毒载体应用于肿瘤基因治疗的临床前研究提供物质基础.     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。     

PTEN基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含PTEN基因的重组腺病毒载体,为PTEN进行肺腺癌的基因治疗奠定基础。方法用PTEN引物VT415和VT416扩增PTEN基因后,分别用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切PCR-PTEN和PSUCMV,回收并纯化PTEN cDNA小片断和PSUCMV的大片断,使两者连接获得含有PTEN基因的重组穿梭质粒载体PSUCMV-PTEN;采用细胞内同源重组方法构建PTEN基因重组腺病毒载体,将质粒PSUCMV-PTEN与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbghe3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经PCR鉴定,扩增病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩,测定病毒滴度。结果经双酶切和PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒命名为VSUCMV-PTEN,TCID_（50）法测定病毒滴度为1.0×10^10pfu/ml。结论成功构建了含PTEN基因的重组腺病毒载体Ad-PTEN,为下一步体内外实验证实PTEN对肺癌的抑制作用研究打下基础。     

一种重组腺病毒载体产生及操作的新方法

目的建立一种快速、高效的产生腺病毒的实验方法。方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)装在穿梭质粒，线性化后与腺病毒骨架载体一起电穿孔转染大肠杆菌，使之同源重组，产生病毒基因组质粒。后Pac酶切，脂质体介导转入293细胞以包装出病毒。扩增后收获病毒，氯化铯密度梯度离心纯化，空斑试验测滴度。结果52个大肠杆菌克隆，其中有1个发生同源重组，产生腺病毒基因组质粒pAdEGFP，转染293细胞，荧光显微镜下产生绿色荧光。病毒纯化后达10^11pfu／ml。结论大肠杆菌内质粒间同源重组的方法可以高效、简便、快捷地产生重组腺病毒载体，是一种很好的制备重组腺病毒载体的方法。     

mING基因的腺病毒载体的构建与表达

目的构建鼠ING4（肿瘤生长抑制因子4）的腺病毒载体，获得鼠ING4（mING4）重组腺病毒子，为ING4进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-mING4重组质粒为模板，PCR扩增miNG4，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV质粒上，PmeI线性化重组质粒pAdTrack-CMV-mING4，与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，经PacI线性化后转染293细胞，收获腺病毒重组病毒子，RT-PCR鉴定，并用MTT法检测mING4对肝癌细胞SMMC7721的作用。结果成功构建mlNG4的重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，获得了mING4重组病毒子。结论mING4的重组腺病毒表达载体可抑制SMMC7721细胞的生长。     

人白介素24腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建人白介素24（hIL-24）的腺病毒载体,获得hIL-24重组腺病毒子,为hIL-24进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-hIL-24重组质料为模板,PCR扩增hIL-24,酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack—CMVR质粒上,PmeI线性化重组质粒pAdTrack—CMV-hIL-24,与腺病毒质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-hIL-24,经Pacl线性化后转染QBI-293A包装细胞。收获腺病毒重组病毒子,RT-PCR和Western—blotting鉴定。结果测序结果显示hIL-24序列正确,RT—PCR和Western-blotting检测到了hIL-24的表达。结论成功构建人白介素24的重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack,CMV—hIL-24。获得了人白介素24重组病毒子Ad-hIL-24。     

阳江市某小学腺病毒感染暴发的调查

目的了解阳江市某小学儿童腺病毒感染暴发的流行特征及病因,为控制疫情提供依据。方法现况调查和病例对照研究。结果某小学儿童腺病毒感染罹患率为6．3％;患者以7～8岁的儿童为主;15例样本中有12例检测出腺病毒IgM抗体阳性;病例组与对照组进行统计学比较,两者的游泳因素暴露率有显著性差异。结论游泳可导致腺病毒感染暴发疫情发生．应加强泳池的消毒。     

重组腺病毒TGF-β的扩增及病毒滴度检测

目的：探讨高效扩增腺病毒载体的方法。方法：用人胚胎肾细胞株扩增重组腺病毒，并测定病毒滴度。结果：扩增病毒滴度约为5×10^8pfu／mL。结论：用人胚胎肾293细胞株扩增重组腺病毒，在不进行任何浓缩时可达到较高病毒滴度，为腺病毒介导的基因转载提供了有效途径。     

含CD基因的腺病毒载体制备及体外抑瘤效果观察

目的：制备含胞嘧啶转氨酶（CD）基因的重组腺病毒（Ad-CD)并进行体外肿瘤的自杀基因治疗。方法：构建含CD或LacZ基因的重组腺病毒载体。在293细胞内重组包装后,体外感染小鼠结肠癌细胞株C26,并给予不同浓度的前药氟胞嘧啶（5-FC）进行肿瘤杀伤效果观察。结果：重组腺病毒载体构建成功。用制备的Ad-CD液感染C26细胞,并予以不同浓度5-FC后,肿瘤细胞生长受不同程度抑制,而对照组细胞和原位转LacZ基因的C26细胞的生长未出现明显的变化。结论：应用腺病毒载体转CD基因进行体外肿瘤治疗效果明显,为自杀基因应用于体内结肠癌的基因治疗研究奠定基础。