siRNA 干扰雄激素受体相互作用蛋白 HSPBAP1对人前列腺癌 PC3细胞恶性表型的影响

目的：探讨siRNA干扰雄激素受体相互作用蛋白HSPBAP1对前列腺癌PC3恶性表型的影响。方法 siRNA干扰PC3细胞HSPBAP1的表达,检测细胞增殖、克隆形成、细胞周期及迁移和侵袭的变化。结果 siHSPBAP1组与对照组相比,增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力显著减弱（ P ＜0．05）, G0／G1期细胞数增多,S期和G2／M期细胞数显著减少（ P ＜0．05）。结论干扰HSPBAP1能够抑制前列腺癌PC3细胞的恶性表型。     

地高辛对前列腺癌LNCaP和PC3细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨地高辛对雄激素依赖和去势抵抗性前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制.方法 设立地高辛的浓度和时间梯度,分别作用于正常前列腺细胞株、雄激素依赖性及去势抵抗性前列腺癌细胞株LNCaP和PC3,流式细胞仪检测凋亡指数,MTT法检测细胞增殖速率;应用Western Blot技术检测HIF-1 α和VEGF的蛋白水平.结果 地高辛对LN-CaP和PC3细胞均有良好的抑制增殖及促进凋亡的作用(P＜0.05);Western Blot法检测提示地高辛干预组HIF-1α和VEGF的蛋白水平较未干预组明显降低(P＜0.05).结论 地高辛可抑制雄激素依赖及去势抵抗性前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡,作用机制可能是通过抑制HIF-1 α/VEGF这一信号通路来发挥作用.     

shRNA沉默GnT-Ⅴ基因表达对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的构建针对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnT-Ⅴ)的小片段发夹状RNA(shRNA)表达质粒,研究shRNA表达质粒沉默GnT-Ⅴ基因后对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对GnT-Ⅴ基因的小干扰RNA(siRNA)靶序列,构建shRNA表达载体并转染PC-3细胞,通过G418筛选,建立稳定表达GnT-Ⅴ基因的细胞株,采用RT-PCR和蛋白质印迹检测GnT-ⅤmRNA和蛋白的表达,并通过CCK-8增殖实验、流式细胞仪评价GnT-ⅤshRNA对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的影响。结果成功构建了GnT-ⅤshRNA表达质粒,且该质粒明显下调GnT-Ⅴ的表达;PC-3细胞GnT-Ⅴ/1079的mRNA和蛋白质水平的抑制率分别为76.5%和67.0%,对PC-3细胞呈明显抑制效应;CCK-8增殖实验显示,与对照组相比,PC-3GnT-Ⅴ/1079的增殖受到明显抑制(P<0.01),以48h为著;流式细胞仪检测结果表明,PC-3GnT-Ⅴ/1079的凋亡率明显增加(P<0.05)。结论 shRNA GnT-Ⅴ能显著降低GnT-Ⅴ基因的表达水平,从而有效抑制PC-3细胞增殖,并促进细胞凋亡,该GnT-Ⅴ的siRNA序列可能成为治疗前列腺癌的有效靶点。     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA(siRNA)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响. 方法 根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体.以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率.实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组.转染后24、48和72 h,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率. 结果 与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48 h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52%.实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强.转染48 h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13.6%±1.8%. 结论 在RNAi研究中,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值.     

siRNA蛋白抑制对LNCaP细胞增殖的影响作用

目的筛选针对α甲基-辅酶A消旋酶(AMACR)的小分子干扰RNA(siRNA),探讨该蛋白抑制后对前列腺癌细胞系LNCaP增殖的影响。方法设计并合成3对针对AMACR的siRNA序列,通过siPORTTMNeoFXTM转染LNCaP细胞;RT-PCR检测siRNA作用后AMACRmRNA的表达,Westernblot检测AMACR蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡。结果通过测定条带灰度值并分析,编号21030的siRNA可有效抑制AMACR表达约77%,有效抑制AM-ACRmRNA水平约60%,编号为113442和21203的siRNA均不能有效抑制AMACR表达。转染编号21030的siRNA可抑制LNCaP细胞增殖,但未发现明显的细胞凋亡。结论编号21030的siRNA可特异有效下调LNCaPAMACR基因表达,该蛋白抑制后可抑制LNCaP细胞增殖,为前列腺癌基因治疗提供新的思路。     

ADAM17 siRNA和阿霉素联用对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用

目的 探讨ADAM17 siRNA联合化疗药物阿霉素（ADM）对人前列腺癌细胞株PC-3增殖和凋亡的影响。方法 用ADM处理 ADAM17 siRNA表达质粒稳定转染的PC-3细胞,采用噻唑蓝（MTT）比色法观察细胞增殖率,吖啶橙染色和流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率,并对凋亡蛋白caspase-3的活性进行对比分析。结果 ADAM17 siRNA和ADM单独及联合应用均能不同程度的降低PC-3细胞增殖率,上调凋亡率。FCM检测数据显示ADAM17 siRNA和ADM单独应用的细胞凋亡率分别为（6.2±1.4）%和（17.2±1.9）%,与ADAM17 siRNA和ADM联合应用的（36.4±3.7）%相比较,差异有显著统计学意义（P<0.01）,两者在诱导caspase-3活性方面也具有良好的协同增敏作用。结论 ADAM17 siRNA和ADM对人前列腺癌PC-3均有抑制细胞增殖和促进凋亡的效果,但两者联合应用效果更好。提示分子靶向用药的基因治疗和化疗联合治疗可能是提高疗效,减少前列腺癌术后复发转移风险的重要方法。     

TRPM8对前列腺癌细胞PC-3细胞增殖和迁移影响的研究

目的 探讨TRPM8对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞增殖和迁移能力的影响. 方法 PC-3细胞分别转染空载体pcDNA3和目的 基因TRPM8,筛选稳定表达细胞株;分别通过免疫荧光和钙成像检测TRPM8蛋白表达、分布以及功能;通过流式细胞术和划痕实验检测TRPM8对PC-3细胞周期和细胞迁移率的影响. 结果 免疫细胞化学和钙成像提示PC-3-TRPM8细胞表达有功能的TRPM8通道;TRPM8能诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,与PC-3和PC-3-vector细胞相比,处于G0/G1期的PC-3-TRPM8细胞显著增加(71.89%±3.43% vs 54.67%±4.59%、51.48%±3.54%,P＜0.05),易化饥饿诱导的细胞凋亡(12.56%±1.78% vs 4.67%±1.49%、5.28±1.35%,P＜0.05),并抑制细胞迁移(P＜0.01). 结论 TRPM8并不为PC-3细胞存活所必需,相反,高表达的TRPM8能抑制PC-3细胞的增殖和迁移,可能为前列腺癌治疗的一个新靶点.     

法舒地尔对前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响

目的 观察法舒地尔对人前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 不同浓度法舒地尔、顺铂及两药联合干预PC3细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot法检测Rock Ⅰ、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达情况.结果 与对照组相比,法舒地尔、顺铂单独或联合作用PC3细胞均可抑制细胞增殖,两药联合后抑制效果更显著;法舒地尔、顺铂联合用药可明显增强PC3细胞的凋亡;凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调,Caspase-3表达上调,法舒地尔可明显下调Rock Ⅰ蛋白表达.结论 法舒地尔可促进PC3细胞凋亡,其作用机制可能与法舒地尔抑制Rho激酶的表达有关.     

前列腺癌DU145细胞增殖和克隆形成与延伸因子1α基因表达的关系

目的 探讨延伸因子1α(EF-1α)基因表达与前列腺癌细胞株DU145细胞增殖、克隆形成等功能的关系. 方法 DU145细胞株分3组:对照组(未转染siRNA),转染对照组(转染随机siRNA)和实验组(转染EF-1α-siRNA).应用RNA干扰技术特异性调低DU145细胞株EF-1α蛋白质水平,并通过蛋白质印迹法验证.应用体外细胞功能分析技术,比较EF-1α蛋白质水平调低后DU145细胞增殖、克隆形成能力的变化和差异. 结果 应用RNA干扰技术实现了特异性调低前列腺癌细胞株DU145中EF-1α的水平.转染随机siRNA不影响DU145细胞中EF-1α蛋白质水平.调低DU145细胞EF-1α蛋白质水平后,实验组DU145细胞第4～7天增殖率较对照组下降45.9%、53.5%、35.3%和38.1%(P<0.05).实验组DU145细胞形成克隆数较对照组减少67.0%(P<0.01). 结论 调低EF-1α表达水平对前列腺癌细胞增殖、克隆形成等肿瘤相关生物学行为产生负面影响.EF-1α基因在前列腺癌靶向治疗中可能成为适当的靶基因.     

PSF1在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞增殖的影响

目的检测PSF1在结肠癌组织中的表达,探讨RNA干扰沉默PSF1表达对人结肠癌细胞增殖的影响及其可能的机制。方法收集2004年5月至2006年12月间经病理确诊的40例结肠癌标本．采用Westerllblot检测标本中PSF1蛋白表达水平;应用脂质体法将靶向PSF1的短发夹RNA（shRNA）干扰质粒转染人结肠癌细胞株LOVO、HT．29和HCT116,Westernblot法检测PSF1蛋白表达变化．分别应用MTY法、软琼脂克隆形成实验及荧光定量PCR检测转染PSF1shRNA干扰质粒对结肠癌细胞增殖活性、锚定非依赖性生长能力及PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达的影响。结果结肠癌组织中PSF1蛋白相对表达量为0．485±0．113,显著高于正常黏膜组织的0．056±0．014（P〈0．01）。转染PSF1sbRNA干扰质粒后,LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF1蛋白表达水平均显著下降（P〈0．05）,细胞增殖能力显著降低,软琼脂克隆形成率明显下降。与阴性对照组及正常生长组细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染PSF1shRNA干扰质粒后．LOVO、HT-29和HCT116细胞中PSF2、PSF3和SLD5mRNA表达均明显下降（P〈0．05）。结论PSF1与结肠癌的发生发展具有一定关系。利用RNA干扰技术能有效抑制结肠癌细胞中PSF1表达。并抑制结肠癌细胞增殖。PSF1基因有望成为结肠癌靶向治疗的新靶点。     

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶在前列腺癌LNCaP细胞株中的表达及意义

目的 探讨多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymease,PARP]对雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞株增殖和凋亡的影响. 方法 将LNCaP细胞株分组培养并应用PARP抑制剂5-氨基异喹啉酮(5-AIQ)处理,蛋白印迹法检测LNCaP细胞内PARP表达的变化,四甲基偶氮唑盐法检测PARP表达抑制后对LNCaP细胞增殖的影响及其时间效应和剂量效应的关系,流式细胞仪检测5-AIQ对LNCaP细胞凋亡的影响. 结果 与空白组相比,浓度为500及1000μmol/L的5-AIQ处理48 h后LNCaP细胞内PARP的表达分别降低至65.3％和22.4％,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).PARP表达抑制后,LNCaP细胞增殖也受到明显抑制.随着药物浓度依次增加,细胞增殖抑制率逐渐增加,处理24 h后细胞增殖抑制率从(2.85±2.03)％升至(41.23±5.42)％,处理48 h后细胞增殖抑制率从(19.80±4.34)％升至(55.67±1.47)％,处理72 h后细胞增殖抑制率从( 25.67±0.63)％升至(65.81 ±1.62)％,组间抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05);同样,当药物浓度维持不变时,随着作用时间延长,细胞增殖抑制率也明显升高,细胞增殖的抑制作用与5 - AIQ剂量增加和作用时间延长呈正相关关系.浓度为500及1000 μmol/L的5-AIQ处理48 h所诱导的LNCaP细胞的早期、晚期和总凋亡率分别为23.6％、4.6％、28.2％和31.8％、6.3％、38.1％,与空白组相比差异均有统计学意义(P＜0.05),且随着剂量增加,诱导细胞凋亡的作用增强.结论 抑制PARP的表达可以明显抑制LNCaP细胞增殖,并诱导LNCaP细胞的凋亡.PARP有望成为前列腺癌治疗的一个新靶点.     

上调基因-4对结肠癌细胞增殖的影响

目的 探讨上调基因-4(URG-4)对结肠癌细胞增殖的影响.方法 筛选高表达URG-4的结肠癌细胞.构建URG-4基因siRNA的逆转录病毒载体及阴性对照,经PT67细胞包装后,获得可表达人URG-4基因siRNA逆转录病毒及阴性对照.RT-PCR和Western blot法检测MKN45、SW480、LoVo、HCT116、HT29细胞中URG-4 mRNA和蛋白表达水平,筛选稳定转染细胞株.分别使用重组病毒(干扰组)、原始病毒(阴性对照组)和等量PBS(空白对照组)转染结肠癌LoVo细胞.MTT法检测各组结肠癌LoVo细胞生长情况.计量资料比较采用单因素方差分析和t检验.结果 测序结果证实表达siRNA的逆转录病毒成功构建.URG-4 mRNA在MKN45、SW480、LoVo、HCT116和HT29细胞中的相对表达量分别为0.58±0.02、0.63 +0.03、0.81±0.01、1.01±0.02和0.91±0.04;URG-4蛋白相对表达量分别为0.73±0.02、0.85士0.03、1.42 +0.01、0.80 +0.03和0.80+0.04.结肠癌LoVo细胞高表达URG-4.干扰组中URG-4 mRNA表达为0.55±0.03,显著低于阴性对照组的1.15±0.02和空白对照组的1.15±0.01(t=-5.179,-9.285,P＜0.05).干扰组URG-4 mRNA的抑制率为52.6％.干扰组中URG-4蛋白表达为0.82 +0.05,显著低于阴性对照组的1.46士0.07和空白对照组的1.54 ±0.04(t=-4.239,-3.704,P＜0.05).干扰组URG-4蛋白的抑制率为43.6％.各组结肠癌LoVo细胞呈指数生长.与阴性对照组比较,第3～6天干扰组细胞增殖受到明显抑制,差异有统计学意义(t=-6.436,-6.045,-6.434,-4.285,P＜0.05).结论 干扰URG-4表达能够抑制LoVo细胞的生长.     

干扰磷脂爬行酶1基因表达对结直肠癌细胞增殖和粘附的影响

目的 探讨PLSCR1在结直肠癌细胞增殖和粘附过程中的作用.方法 常规培养3株结直肠癌细胞,采用免疫细胞染色和免疫印迹法筛选PLSCR1高表达的细胞株.设计三条RNA干扰片段及一条阴性对照片段,稳定转染高表达PLSCR1的结直肠癌细胞株,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法验证干扰结果,筛选出对PLSCR1蛋白抑制率最高的干扰片段,通过MTT方法来评估转染后结直肠癌细胞增殖能力的变化,采用细胞粘附实验来评估转染后结直肠癌细胞粘附能力的变化.结果 免疫细胞染色提示LoVo细胞株高表达PLSCR1,与免疫印迹法结果相一致;转染siRNA-390后,LoVo细胞株PLSCR1的mRNA抑制效果最为明显,抑制率为88.4％,免疫印迹法检测进一步验证siRNA-390片段抑制PLSCR1蛋白表达最为显著.MTT法、纤连蛋白,粘附和层连蛋白检测显示,siRNA-390干扰下调PLSCR1的表达后,细胞生长变缓,粘附能力下降.结论 干扰PLSCR1能显著抑制肿瘤的增殖和粘附能力,提示PLSCR1可能在结直肠癌浸润和转移中具有一定作用.     

细胞周期对Fas/APO-1在前列腺癌细胞系PC-3M中表达的影响

目的研究细胞周期对ＰＣ３Ｍ细胞表面Ｆａｓ／ＡＰＯ１蛋白表达的影响。方法采用直接免疫荧光流式细胞术对前列腺癌细胞系ＰＣ３Ｍ未同步化的细胞,及经改良的笑气阻断及ＴｄＲ双阻断方法同步化的不同细胞周期细胞表面Ｆａｓ／ＡＰＯ１表达情况进行检测。结果未同步化的ＰＣ３Ｍ细胞Ｆａｓ／ＡＰＯ１表达阳性率为３４２０％;ＰＣ３Ｍ细胞系不同细胞周期的细胞表面Ｆａｓ／ＡＰＯ１表达明显不同,以Ｓ期最高达８５０５％,Ｇ１及Ｍ期较低,分别为３３２％和４９５％。结论细胞周期对细胞表面Ｆａｓ／ＡＰＯ１的表达情况有明显影响。深入研究细胞周期对肿瘤细胞Ｆａｓ／ＡＰＯ１表达情况的影响,对于采用Ｆａｓ／ＡＰＯ１系统途径治疗恶性肿瘤有重要意义。     

Survivin siRNA纳米载体的制备及其对胰腺癌细胞生物学特性的影响

目的：利用纳米技术和基因干扰技术设计并合成携载survivin siRNA的纳米载体,探讨survivins iRNA纳米微粒对人胰腺癌细胞BXPC-3增殖和凋亡的影响。方法：体外培养人胰腺癌BXPC-3细胞,将BXPC-3细胞随机分为4组：生理盐水组、不含基因的纳米微粒组、survivin siRNA组和s urvivins iRNA纳米微粒组。RT-PCR检测survivin mRNA的表达;Wes tern blot法检测s urvivin蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测细胞增殖情况。结果：细胞培养72 h后,survivin siRNA纳米微粒组细胞的survivin mRNA和蛋白表达均低于其他3组（P〈0.05）。survivin siRNA纳米微粒组细胞增殖明显受抑制,生长缓慢,而细胞凋亡率高于其他3组（P〈0.05）。结论：survivin siRNA纳米微粒能够有效减少胰腺癌BXPC-3细胞survivin mRNA和蛋白的表达,提高肿瘤细胞的凋亡,显著抑制BX-PC-3细胞的增殖。     

小RNA干扰DDR2基因表达对肝星状细胞的影响

目的 探讨siRNA干扰大鼠盘状结构域受体2(discoidin domain receptor2,DDB2)基因对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的影响,评估DDR2在肝纤维化发生中的作用.方法 (1)化学合成3对针对DDR2基因的siRNAs,转染肝星状细胞株(HSC-T6),筛选抑制效率最高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株HSC-T6分为3组:正常组(normal,N组)、阴性对照组(negative control,NC组)和干扰组(siRNA-DDR2,SI组).将筛选的抑制效率最高的siRNA以脂质体法转染HSC-T6细胞株,以RT-PCR检测其DDR2,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原(collagen-Ⅰ)的mRNA表达,Western blot检测DDR2蛋白表达变化;同时四唑盐(MTT)法检测细胞增殖情况.结果 (1)868位点的siRNA抑制效率最高;(2)与正常组相比,siRNA-DDR2转染组DDR2和α-SMA的mRNA表达均显著下降(分别t=6.43,t=7.34,均P<0.01),DDR2蛋白的表达亦显著降低(t=4.49,P<0.01),同时HSC的增殖能力也显著降低(t=18.32,P<0.01);相反,阴性对照组与正常组相比,DDR2、α-SMA的mRNA表达以及DDR2蛋白和HSC的增殖能力则无明显改变.结论 siRNA-DDR2能显著抑制HSC的活化与增殖,进而抑制纤维化发生,具有潜在的抗纤维化作用.     

miR-1303靶向抑制LPAR3对肾癌786-O细胞增殖和迁移的影响及机制研究

目的:探讨微小RNA(miRNA)-1303通过靶向调控溶血磷脂酸受体3(LPAR3)的表达抑制肾癌786-O细胞增殖和迁移的机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测肾癌细胞株(A498、ACHN、786-O、OS-RC-2)及正常肾小管上皮细胞HK-2中miR-1303的相对表达量。将miR-1...     

鞘氨醇激酶1表达下调对肿瘤Hela细胞增殖和细胞凋亡的影响及其机制

目的 观察鞘氨醇激酶1(SphK1)表达下调对肿瘤Hela细胞增殖和细胞凋亡的影响,并探讨其分子机制.方法 将SphKl siRNA和对照siRNA转染肿瘤Hela细胞,转染后将细胞分为3组:未转染组、siRNA对照组和SphK1 siRNA组.应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot技术检测转染SphK1 siRNA后SphK1 mRNA和蛋白的表达.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和流式细胞术分别检测3组细胞增殖和细胞凋亡的变化.进一步利用Westem blot技术检测与细胞增殖和细胞凋亡密切相关蛋白的表达.结果 SphK1 siRNA组中SphK1 mRNA和蛋白的相对表达水平(分别为0.153±0.037和0.123±0.037),显著低于未转染组(分别为1.000±0.000和0.688±0.049)和siRNA对照组(分别为0.932±0.039和0.673±0.057)(P＜0.05).细胞增殖结果表明,与未转染组和siRNA对照组比较,SphK1 siRNA组中Hela细胞的增殖明显受到抑制(P＜0.05).流式细胞结果表明,SphK1 siRNA组中Hela细胞早期凋亡细胞数比率为(23.85±0.72)％,显著高于未转染组(11.67±1.02)％和siRNA对照组(11.85±0.71)％,差异有统计学意义(F=211.451,P＜0.05).Western blot检测结果表明,SphK1 siRNA组中p21、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3( Caspase-3)和Caspase-9蛋白的相对表达水平(分别为0.381±0.025、0.406±0.041和0.374±0.035),显著高于未转染组(分别为0.127±0.039、0.064±0.023和0.115±0.039)和siRNA对照组(分别为0.125±0.034、0.060±0.018和0.126±0.038)(P＜0.05).结论 SphK1可能与宫颈癌的发生发展密切相关,其表达下调介导的增殖抑制和细胞凋亡可能与p21、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的上调密切相关.