乙肝病毒X蛋白通过激活JAK2/STAT3信号通路调节肾小管上皮细胞凋亡

 目的：观察乙肝病毒X蛋白(HBx)对肾小管上皮细胞凋亡的作用,并探讨其在乙型病毒肝炎相关性肾炎(HBVGN)发病中的分子机制。方法：将构建好的HBx真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx转染至体外培养的人肾近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中。Western blotting法检测转染后目的蛋白的表达及JAK2/STAT3信号通路的活化。细胞免疫荧光检测STAT3及p-STAT3表达水平。CCK-8法检测细胞增殖活性。Hoechst 33342染色观察细胞的形态学改变。透射电镜观察细胞的超微结构及凋亡。Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：转染目的基因HBx后,p-JAK2及p-STAT3表达水平均显著增加;同时,细胞增殖明显受抑。透射电镜、Hoechst 33342染色及Annexin V/PI双染流式细胞术检测发现HBx促进HK-2细胞凋亡。AG490（JAK2/STAT3信号通路阻断剂）孵育后能够部分阻断JAK2/STAT3信号通路,减少HBx所致细胞凋亡。结论：HBx通过激活JAK2/STAT3信号通路导致肾小管上皮细胞凋亡,可能参与了HBV直接损伤肾组织的致病机制。     

Netrin-1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的:研究netrin-1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法:用高糖培养人肾小管上皮HK-2细胞,real-time PCR和Western blot测定细胞中netrin-1的表达水平。用过表达netrin-1慢病毒感染HK-2细胞,检测其对高糖环境下HK-2细胞中netrin-1表达的影响。流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定cleavedcaspase-3蛋白水平,2,4-二硝基苯肼法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸法检测培养液中丙二醛(MDA)含量,ELISA法测定培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果:高糖处理后的HK-2细胞中netrin-1的mRNA和蛋白水平均明显下调(P 0.05)。过表达netrin-1慢病毒能够上调高糖环境下HK-2细胞中netrin-1的表达水平(P 0.05)。高糖可促进肾小管上皮细胞分泌IL-1β和TNF-α,提高细胞培养液中LDH和MDA的水平(P 0.05),使肾小管上皮细胞的caspase-3活化并诱导细胞凋亡;上调netrin-1的HK-2细胞经高糖诱导后,细胞分泌的IL-1β和TNF-α减少,细胞中活化的caspase-3蛋白水平降低,培养液中LDH和MDA水平降低,细胞凋亡减少(P 0.05)。结论:上调netrin-1减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和炎性损伤,减少细胞凋亡。     

BDNF-AS/miR-145-5p轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响CSCD

目的探讨脑源性神经营养因子反义RNA(brain-derived neurotrophic factor-antisense, BDNF-AS)对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响和可能机制。方法体外培养肾小管上皮细胞HK-2, 分别转染BDNF-AS小干扰RNA、miR-145-5p模拟物或共转染BDNF-AS小干扰RNA和miR-145-5p抑制剂, 之后采用30 mmol/L葡萄糖干预转染后的细胞24 h, 用RT-qPCR法检测细胞中BDNF-AS和miR-145-5p的表达, 用CCK-8法检测细胞增殖, 流式细胞术检测细胞凋亡, Western印迹法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达, 酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中IL-1β和IL-6的水平。用双荧光素酶报告基因实验验证BDNF-AS和miR-145-5p的调控关系。结果高糖处理促进了HK-2细胞中BDNF-AS的表达(P<0.05), 而抑制了miR-145-5p的表达(P<0.05)。干扰BDNF-AS或过表达miR-145-5p降低了高糖诱导的HK-2细胞抑制率、凋亡率及Bax蛋白、IL-1β和IL-6的表达(P<0.05), 促进了Bcl-2蛋白的表达(P<0.05)。干扰miR-145-5p逆转了干扰BDNF-AS对高糖诱导的HK-2细胞增殖、凋亡及IL-1β和IL-6表达的影响。BDNF-AS可靶向结合并负调控miR-145-5p。结论干扰BDNF-AS可能通过靶向负调控miR-145-5p促进高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖, 并抑制细胞凋亡及炎症因子表达。     

脂多糖对人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体复合物表达的影响

观察脂多糖(LPS)对体外培养人近端肾小管上皮细胞IL-18及其受体表达的影响,以初步探讨IL-18在肾小管-间质炎症损伤过程中的作用。以不同浓度LPS(0.01、0.1、1、5、10μg/ml)处理人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)24 h、36 h及48 h,然后应用RT-PCR及ELISA测定IL-18及其受体α链(IL-18Rα)和β链(IL-18Rβ)mRNA及蛋白的表达水平变化。静息培养的HK-2细胞表达IL-18 m RNA和蛋白、IL-18Rα和IL-18Rβm RNA,LPS促进HK-2细胞IL-18 mRNA和蛋白的表达及IL-18Rα和IL-18RβmRNA的表达,并呈剂量和时间依赖趋势。肾小管上皮细胞可能既是IL-18的产生者,又是IL-18的靶细胞之一,炎症状态下肾小管上皮细胞通过IL-18自分泌方式参与肾小管-间质的炎症损伤过程。     

干扰维生素D3上调蛋白1通过调控Shh影响高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨维生素D3上调蛋白1(VDUP-1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制。方法:人近端肾小管上皮HK-2细胞用高糖处理后,real-time PCR和Western blot检测细胞中VDUP-1的水平。HK-2细胞转染VDUP-1小干扰RNA,real-time PCR和Western blot检测抑制效果。高糖条件培养VDUP-1表达下调的HK-2细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western blot检测细胞中音猬因子(Shh)信号通路关键蛋白Patched 1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)、锌指蛋白Gli2和Shh的水平。用外源性Shh处理HK-2细胞,Western blot检测Ptch1、Smo和Gli2的水平。用外源性Shh处理VDUP-1表达下调的HK-2细胞,高糖处理后,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养液上清中TNF-α含量。结果:高糖处理后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平升高(P 0. 05)。转染VDUP-1小干扰RNA后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平下降(P 0. 05)。与正常培养的细胞相比,高糖处理后HK-2细胞凋亡率显著升高,细胞中caspase-3和caspase-9活性明显升高,TNF-α含量亦明显升高(P 0. 05);下调VDUP-1表达后的HK-2细胞经高糖处理后细胞凋亡率显著降低,细胞中caspase-3和caspase-9活性也明显降低(P 0. 05)。高糖培养后细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平下降,而下调VDUP-1表达部分拮抗高糖对HK-2细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh表达的影响。外源性Shh可以促进细胞中Ptch1、Smo和Gli2的表达,抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和分泌TNF-α,与下调VDUP-1共同抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。结论:干扰VDUP-1表达可能通过激活Shh信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和分泌TNF-α。     

C-反应蛋白诱导人肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨与微炎症状态相应的C-反应蛋白(CRP)水平是否诱导肾小管上皮细胞凋亡。方法:以微炎症状态相应的CRP浓度刺激HK-2细胞。采用AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。采用Hoechst 33258染色观察肾小管上皮细胞凋亡的形态学改变。比色法检测细胞caspase-3活性。Real-time PCR检测促凋亡基因bax、抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达。结果:CRP呈剂量和时间依赖性地诱导HK-2细胞凋亡,细胞凋亡在CRP浓度为10 mg/L时达高峰,在20 mg/L时则以晚期凋亡和坏死为主。Hoechst 33258细胞核染色显示CRP作用的HK-2细胞呈现染色质浓缩、碎裂或染色质边集等细胞凋亡的特点。CRP增高细胞caspase-3的酶活性、上调促凋亡基因bax的表达和下调抗凋亡基因bcl-2的表达。结论:CRP轻度增高可诱导肾小管上皮细胞凋亡。     

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。     

STAT1的SUMO4修饰在高糖诱导的肾小管上皮细胞上皮-间叶性转化中的作用

目的探讨STAT1的SUMO4修饰与人近端肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化的关系。方法将HK-2细胞分为空白对照组(NG,5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖)、SUMO4-siRNA(转染SUMO4 siRNA)组、NC-siRNA(转染scrimble siRNA)组、UBC9-siRNA(转染UBC9 siRNA)组。采用免疫细胞化学、Western blot法检测E-cadherin、α-SMA、vimentin等的表达;双荧光素酶报告基因分析检测STAT1的转录活性;免疫共沉淀检测STAT1的SUMO4修饰。结果高糖刺激后,HK-2细胞中E-cadherin表达降低,而vimentin与α-SMA表达增高(P<0.05);高糖上调STAT1的SUMO4修饰;不论是SUMO4 siRNA转染还是UBC9 siRNA转染,均能显著提升STAT1的活性(P<0.01);同时SUMO4 siRNA转染可部分逆转高糖导致的E-cadherin和α-SMA表达变化(P<0.05)。结论抑制STAT1的SUMO4修饰增加STAT1的活性,缓解了高糖诱导的HK-2细胞的上皮-间叶性转化。     

过表达P21减轻顺铂诱导的HK-2细胞损伤

目的:探讨P21在顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)及Western blot法检测顺铂诱导的肾小管上皮细胞(HK-2细胞)中P21的表达水平。在HK-2细胞中过表达P21后,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力及细胞凋亡;Western blot检测急性肾损伤标志物肾损伤因子1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的表达及细胞凋亡效应蛋白caspase-3的表达;此外,还同时检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的蛋白水平及蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、真核翻译起始因子2α(e IF2α)的磷酸化水平以反映细胞内质网应激相关信号通路的活性。结果:在肾小管上皮细胞中,顺铂可剂量及时间依赖性上调P21的mRNA及蛋白表达。过表达P21可逆转顺铂诱导的HK-2细胞凋亡,并使KIM-1、NGAL、GRP78、p-PERK、p-e IF2α、CHOP和cleaved caspase-3的蛋白水平明显减少。结论:过表达P21可减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞急性损伤,其机制可能与调控HK-2细胞内质网应激信号通路,抑制细胞凋亡有关。     

炎症对脂肪酸负荷的肾细胞FAT/CD36表达的影响

目的: 观察炎症是否干扰脂肪酸负荷的肾细胞[人系膜细胞(HMCs)和肾小管上皮细胞HK-2]脂肪酸转运蛋白(FAT/CD36)的表达。方法: 分别给予不同浓度软脂酸(0 mmol/L、0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.32 mmol/L)处理HMCs和HK-2细胞24 h。采用实时定量PCR和Western blotting方法检测细胞FAT/CD36的mRNA及蛋白的表达。进一步选取0.04 mmol/L软脂酸联合炎症因子(25 μg/L TNF-α或20 μg/L IL-6)处理肾细胞24 h后,观察炎症因子对肾细胞FAT/CD36 mRNA及蛋白表达的影响;油红O染色及酶比色法检测细胞甘油三酯(TG)水平;ELISA检测细胞游离脂肪酸(FFA)含量。结果: 软脂酸呈浓度依赖性上调HMCs和HK-2细胞FAT/CD36 mRNA和蛋白表达。炎症因子明显刺激脂肪酸负荷的肾细胞FAT/CD36 mRNA和蛋白表达进一步增加。油红O染色及胞内TG和FFA含量测定显示炎症因子促进肾细胞脂质积聚。结论: 炎症上调脂肪酸负荷的肾细胞FAT/CD36表达,加重胞内脂质积聚。     

人血清白蛋白对近端肾小管上皮细胞骨调素和CD44表达的影响

目的：研究人血清白蛋白能否刺激人近端肾小管上皮细胞产生骨调素（OPN）和CD44。方法： 用人血清白蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞系（HK-2细胞），分不同时间（0-48 h）、不同浓度（0.1-10 g/L）两组，以RT-PCR方法分别检测两组细胞表达的OPN mRNA，以Western blotting分别检测两组细胞表达的OPN。用免疫荧光法、激光共聚焦显微镜观察1 g/L的人血清白蛋白刺激HK-2细胞24 h、48 h后OPN、CD44的表达。结果： 人血清白蛋白刺激HK-2细胞上调表达OPN mRNA和蛋白，呈时间和剂量相关性。CD44的表达与OPN同步。 结论： 人血清白蛋白可刺激HK-2细胞表达OPN与CD44。     

单核巨噬细胞对肾小管上皮细胞的活化作用及其机制初探

目的:观察外周血单核巨噬细胞(MO/MAC)条件培养基(M-CM)对肾小管上皮细胞(RTEC)直接作用的生物学效应并探讨可能的作用机制。方法:应用正常人外周血M-CM刺激人近端肾小管上皮细胞(HK-2),以[³H]-TdR掺入法检测HK-2细胞DNA合成、Westernblot法检测骨桥蛋白(OPN)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达、间接抑制ELISA法检测纤连蛋白(FN)分泌。进一步采用白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β₁(TGF-β₁)中和抗体进行拮抗。结果:①M-CM可促进HK-2细胞DNA合成、α-SMA表达及FN分泌。②TGF-β₁中和抗体(5mg/L)与M-CM同时作用于HK-2细胞,其α-SMA表达和FN分泌均明显低于M-CM单独作用组。③IL-10(20μg/L)与M-CM同时作用组的HK-2细胞,α-SMA表达和FN分泌亦明显低于M-CM组;IL-10预孵育MO/MAC组,HK-2细胞α-SMA表达也明显低于M-CM组。结论:单核巨噬细胞可直接诱导肾小管上皮细胞增殖、表型转化以及分泌细胞外基质增加;其分泌的TGF-β₁及炎性细胞因子可能参与介导上述效应。     

三七总皂苷对马兜铃酸I诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：探讨三七总皂苷（total saponins of panax notoginseng, PNS）对马兜铃酸I（aristolochic acid I,AAI）诱导的人肾小管上皮细胞株HK-2转分化的影响。方法：应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化；免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的表达；ELISA法测定培养细胞上清液中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）的含量。结果：AA I诱导组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态；胞浆内大量表达α-SMA，其积分光密度值增加（P<0.05）；细胞培养上清液中TGF-β1含量均增加，且呈时间依赖性（P<0.05）。不同剂量PNS治疗可减轻AA I诱导的细胞形态学改变，不同程度的抑制α-SMA的表达和TGF-β1的分泌，且呈剂量依赖性（P<0.05）。PNS对照组HK-2细胞形态学、α-SMA表达和TGF-β1分泌与空白对照组比较均无明显变化。结论：AA I可通过促进TGF-β1的分泌诱导肾小管上皮细胞转分化，促进细胞外基质α-SMA的合成；PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用，减少α-SMA的表达，该作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的。     

RTN1A通过ERK信号诱导肾小管上皮细胞分泌VEGF和IL-8并促进糖尿病肾病肾纤维化

目的:探讨网状蛋白1A(RTN1A)对肾小管上皮细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素8(IL-8)及糖尿病肾病(DN)肾纤维化的影响及潜在机制。方法:构建DN小鼠模型,并检测其血糖、肾脏指数、尿微量白蛋白和肌酐清除率进行验证; Western blot检测RTN1A、p-ERK、ERK、细胞因子VEGF和IL-8以及肾脏纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)的表达;高糖处理人肾小管上皮细胞株HK-2模拟体内DN细胞,Western blot和ELISA检测ERK信号蛋白、纤维化标志物及细胞因子分泌变化;高糖联合沉默RTN1A或ERK抑制剂PD98059处理24 h,检测细胞因子的分泌和纤维化蛋白的变化。结果:DN小鼠模型中血糖、肾脏指数、尿微量白蛋白和肌酐清除率均明显高于对照组,说明DN模型构建成功; DN模型小鼠中RTN1A及其下游蛋白p-ERK的水平显著增加,并且细胞因子VEGF和IL-8及纤维化标志物α-SMA和FN也显著增加;高糖处理HK-2细胞后,细胞中RTN1A及其下游蛋白p-ERK水平升高,细胞因子VEGF和IL-8及纤维化标志物α-SMA和FN也显著升高;而ERK抑制剂PD98059处理与沉默RTN1A结果一致,p-ERK、VEGF、IL-8、α-SMA和FN均明显降低。结论:RTN1A可能与DN发生发展有关。沉默RTN1A可能通过ERK信号抑制DN肾炎症反应及纤维化。RTN1A可能是一个有效的治疗靶点。     

Parathyroid hormone induces epithelial-to-mesenchymal transition via the Wnt/β-catenin signaling pathway in human renal proximal tubular cells

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) has been shown to play an important role in renal fibrogenesis. Recent studies suggested parathyroid hormone (PTH) could accelerate EMT and subsequent organ fibrosis. However, the precise molecular mechanisms underlying PTH-induced EMT remain unknown. The present study was to investigate whether Wnt/β-catenin signaling pathway is involved in PTH-induced EMT in human renal proximal tubular cells (HK-2 cells) and to determine the profile of gene expression associated with PTH-induced EMT. PTH could induce morphological changes and gene expression characteristic of EMT in cultured HK-2 cells. Suppressing β-catenin expression or DKK1 limited gene expression characteristic of PTH-induced EMT. Based on the PCR array analysis, PTH treatment resulted in the up-regulation of 18 genes and down-regulation of 9 genes compared with the control. The results were further supported by a western blot analysis, which showed the increased Wnt4 protein expression. Wnt4 overexpression also promotes PTH-induced EMT in HK-2 cells. The findings demonstrated that PTH-induced EMT in HK-2 cells is mediated by Wnt/β-catenin signal pathway, and Wnt4 might be a key gene during PTH-induced EMT.