RNA干扰MeCP2对肺癌细胞A549增殖的影响

 目的 研究甲基化结合蛋白MeCP2对肺癌细胞A549增殖的影响。 方法 针对GeneBank中MeCP2基因的不同靶点,设计并合成两条DNA干扰序列,克隆到真核表达载体pSilencer-2.1-U6,构建能够转 录形成MeCP2-shRNA的重组质粒pSilencer-MeCP2,经PCR、测序鉴定正确后,稳定转染A549细胞,在mRNA和蛋白水平观 察两重组质粒对MeCP2的干扰作用,MTT法检测对细胞增殖能力的影响。 结果 成功构建两个针对MeCP2不同靶序列的shRNA真核表达质粒,两质粒在mRNA和蛋白水平可以使MeCP2表达明显下调,稳定转染两质粒的A549细胞增殖能力明显减弱。 结论 甲基化结合蛋白MeCP2参与了肺癌细胞的恶性增殖。     

肺癌A549细胞中RNAi抑制MeCP2表达的实验研究

目的:探讨RNA干扰下调MeCP2基因后对人肺癌A549细胞RASSF1A和C/EBPα基因表达及细胞增殖能力的影响. 方法:根据MeCP2的碱基序列设计并合成短发夹RNA(shRNA),构建质粒表达载体,用阳离子脂质体法体外转染A549细胞,筛选出稳定转染的细胞株,RT-PCR法检测MeCP2抑制效果及RASSF1A和C/EBPα表达,MTT法检测转染后细胞增殖能力.结果:成功构建了靶向MeCP2的真核表达载体pSilencer- MeCP2/Ⅰ和pSilencer- MeCP2/Ⅱ,与空白组和阴性组相比,pSilencer- MeCP2/Ⅰ和pSilencer- MeCP2/Ⅱ组均可有效抑制MeCP2基因mRNA的表达,抑制率分别为47.6%和70.3%.且在上述两组中 C/EBPα表达分别上调约115%和135%、细胞增殖能力明显减弱,与空白组和阴性组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而RASSF1A的表达在各组细胞中未见明显变化(P>0.05).结论:肺癌A549细胞中MeCP2基因的表达可被RNA干扰载体有效抑制,进而导致细胞中部分与增殖和凋亡相关基因的表达改变,细胞增殖能力减弱.     

靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

[目的]构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。[方法]针对cyclin E基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclin E shRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。[结果]酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对cyclin E的shRNA表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。[结论]成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因治疗的研究提供实验基础。     

整合素β1表达下调对非小细胞肺癌细胞迁移和黏附能力的影响

目的:构建整合素β1基因特异的RNA干扰质粒,探讨抑制整合素β1蛋白表达对非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)细胞生物学行为的影响.方法:根据GenBank数据库提供的整合素β1基因核苷酸序列,选择设计1条能转录短发夹RNA (small hairpin RNA,shRNA)的DNA序列,命名为17-2;同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为N.将设计序列与pUC19质粒载体连接,转化感受态大肠埃希菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒.2种重组质粒分别转染NSCLC耐药细胞株PC-9/AB2细胞,用G418筛选后挑选单克隆并扩增获得稳定转染株.荧光显微镜、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)和Western印迹法检测整合素β1 mRNA及蛋白表达水平.细胞划痕实验和黏附实验比较整合素β1对细胞迁移和黏附能力的影响.结果:G418筛选出稳定转染2种质粒的PC-9/AB2细胞,荧光显微镜下可见满视野带绿色荧光的细胞,转染17-2组细胞中整合素β1的mRNA及蛋白表达水平明显低于转染N组细胞及母细胞PC-9/AB2.划痕实验和黏附实验表明,整合素β1抑制可以使细胞迁移和黏附能力明显降低.结论:成功构建针对整合素β1基因的特异性shRNA真核表达载体,转染NSCLC细胞后可抑制整合素β1蛋白表达.整合素β1表达抑制后细胞迁移和黏附能力明显降低.     

CD147 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的针对CD147基因的不同部位,构建不同CD147 shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制CD147的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆.方法用DNA重组技术将针对人CD147基因的不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGE-1中,构建CD147 shRNA表达质粒载体pGE-1 CD147shRNA1、2、3.用阳离子脂质体介导转染人卵巢癌高转移细胞系HO-8910pm,经G418筛选后获得克隆进行鉴定.结果3个CD147 shRNA表达载体pGE-1CD147shRNA1、2、3经PCR、限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.半定量RT-PCR、Western blotting均证实:转染细胞8910 pm/pGE-1 CD147shRNA,与亲本细胞相比,CD147的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降.结论成功构建了CD147 shRNA表达载体pGE-1 CD147shRNA,并筛选出特异而高效地阻断CD147表达的克隆.此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础,并对shRNA设计靶序列的选择有一定指导意义.     

靶向SATB1基因的短发夹RNA诱导肺癌A549细胞凋亡

目的:探讨靶向SAT B1(special AT-rich sequence-binding protein-1)基因的短发夹RNA (short hairpinRNA,shRNA)对肺癌A549细胞凋亡的影响及其可能的机制.方法:构建靶向SATB1基因的shRNA重组质粒SATB1-shRNA,采用脂质体法将其转染至A549细胞;分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测A549细胞中SATB1、Bcl-2、Bax mRNA和SATB1、Bcl-2、Bax、caspase 3蛋白的表达水平FCM检测A549细胞的凋亡率.结果:成功构建了SATB1-shRNA重组质粒;SATB1-shRNA转染A549细胞后,SATB1、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达下调,Bax mRNA和Bax、caspase 3蛋白表达上调(p＜0.05).SATB1-shRNA转染组细胞凋亡率[(14.18±1.59)％]较对照组[(1.84±0.57)％]明显增加(P＜ 0.01).结论:SATB1-shRNA可显著下调肺癌A549细胞中SATB1基因的表达水平并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2基因表达所引起的级联效应有关.     

短发夹RNA靶向沉默TPX2基因促进人肺腺癌A549细胞凋亡及其相关机制

目的:探讨靶向Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein2,TPX2)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其可能机制。方法:构建靶向TPX2基因的shRNA重组载体,将其转染至肺腺癌A549细胞中,RT-PCR检测细胞中TPX2、Aurora-A、p53和Bcl-2mRNA的表达,蛋白质印迹法检测TPX2蛋白的表达,FCM检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果:成功构建重组载体pMagic4.1-shRNA-TPX2。将pMagic4.1-shRNA-TPX2转染至A549细胞后,TPX2、Aurora-A和Bcl-2mRNA的表达水平明显下调,p53mRNA的表达水平明显上调,TPX2蛋白的表达水平明显下调,细胞凋亡率明显增加,细胞阻滞于S期,与空白对照组(未转染组)和阴性对照组(转染pMagic4.1-shRNA-NC)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:靶向TPX2的shRNA能促进肺腺癌A549细胞的凋亡,其作用可能与上调p53表达和下调Bcl-2表达有关。     

肺癌A549细胞中RNAi抑制MeCP2表达的实验研究

目的：探讨RNA干扰下调MeCP2基因后对人肺癌A549细胞RASSF1A和C/EBPα基因表达及细胞增殖能力的影响。方法：根据MeCP2的碱基序列设计并合成短发夹RNA（shRNA）,构建质粒表达载体,用阳离子脂质体法体外转染A549细胞,筛选出稳定转染的细胞株,RT-PCR法检测MeCP2抑制效果及RASSF1A和C/EBPα表达,MTT法检测转染后细胞增殖能力。结果：成功构建了靶向MeCP2的真核表达载体pSilencer-MeCP2/Ⅰ和pSilencer-MeCP2/Ⅱ,与空白组和阴性组相比,pSilencer-MeCP2/Ⅰ和pSilencer-MeCP2/Ⅱ组均可有效抑制MeCP2基因mRNA的表达,抑制率分别为47.6%和70.3%。且在上述两组中C/EBPα表达分别上调约115%和135%、细胞增殖能力明显减弱,与空白组和阴性组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）,而RASSF1A的表达在各组细胞中未见明显变化（P〉0.05）。结论：肺癌A549细胞中MeCP2基因的表达可被RNA干扰载体有效抑制,进而导致细胞中部分与增殖和凋亡相关基因的表达改变,细胞增殖能力减弱。     

shRNA干扰对肺癌细胞内Skp2和p27水平及其生长的影响

探讨干扰肺腺癌SPC—A—1细胞中skp2（S-phase kinase associated protein，Skp2）基因的发夹结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）对肺癌细胞Skp2和p27基因表达的影响及对细胞生长的影响。方法：设计、合成特异性的shRNA序列并与pGenesil-1质粒载体连接转染SPC-A-1细胞，经过稳定筛选后的肺癌细胞，通过RT—PCR和Western印迹法分别检测细胞内Skp2、p27 mRNA和蛋白的表达情况，MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线。结果：在转染干扰RNA后SPC-A-1细胞内的Skp2 mRNA及蛋白表达下降明显，而p27蛋白水平却明显上升，这与抑制了Skp2表达导致p27降解减少有关。生长曲线表明细胞生长受到了抑制。结论：成功构建了针对脚2基因的shRNA真核表达载体，能有效抑制肺癌细胞生长，并使得Skp2基因表达下降，p27基因的表达增多，为肺癌细胞的基因治疗提供了实验依据。     

RNA干扰maspin基因对胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响

目的:探讨转染maspin特异性短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)重组质粒对胃癌细胞株MKN-28凋亡的影响.方法:设计并合成针对maspin基因的shRNA,并将其与真核表达载体pGenesil-1.1连接,构建重组质粒pGenesil-maspin.应用RT-PCR和Western 印迹法检测转染重组质粒后MKN-28细胞中maspin、bcl-2和bax mRNA及蛋白的表达变化,应用FCM法检测转染重组质粒对MKN-28细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响.结果:成功构建maspin特异性shRNA重组质粒pGenesil-maspin1、pGenesil-maspin2及pGenesil-HK(阴性对照); pGenesil-maspin成功转染后可明显下调胃癌细胞MKN-28中 maspin和bax mRNA及蛋白的表达水平(P<0.01),并上调bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.01);重组质粒转染后,MKN-28细胞的细胞周期呈现G0/G1期细胞减少(P<0.01),细胞凋亡率下降(P<0.01).结论:外源性maspin shRNA转染MKN-28细胞后能下调maspin的表达,抑制胃癌细胞的凋亡,且使细胞周期分布发生改变;其分子机制可能与上调bcl-2和下调bax的表达有关.