人pol-β高表达对细胞应对DNA损伤反应时的影响

目的探讨DNA聚合酶beta(pol-β)高表达对细胞应对遗传损伤反应的影响。方法转染筛选人pol-β稳定高表达的细胞株HLFβ,以甲基甲磺酸(MMS)染毒,从DNA损伤、细胞周期及诱发突变等方面,研究pol-β在细胞应对DNA损伤时的作用。结果经过筛选获得人pol-β稳定高表达的细胞HLFβ,在MMS中、高剂量组(0.5~0.8 mmol/L),MMS对HLFβ细胞的DNA损伤反应明显低于对照细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞周期分析显示,MMS染毒后2种细胞在G2期均有阻滞现象。而在HLFβ组,当MMS剂量增加到0.5 mmol/L时,除G2期阻滞外,49.0%的细胞被阻滞在G1期,而相同剂量下对照组只有20.1%阻滞于G1期。此外,在MMS 0.5 mmol/L组,HLFβ与HLFC相比,诱发突变率从4.5×10-6增加到8.2×10-6,差异有统计学意义(P<0.05)。结论pol-β的高表达对细胞应对MMS的细胞毒性和遗传毒性具有一定的保护作用,其效应与HLFβ细胞周期G1期的阻滞有一定关系。但由于pol-β合成DNA的保真度较低,高表达的pol-β也增加了细胞突变的概率,可能产生远期遗传毒性。     

叶黄素对食管癌EC9706细胞增殖与分化的影响

叶黄素(lutein)是一种具有抗氧化作用的类胡萝卜素[1]。流行病学、体外试验和动物试验研究表明,给予叶黄素可以预防动脉粥样硬化,其抗氧化性能可以抵御游离基在人体内造成的细胞与器官损伤,并可防止因机体衰老引发的心血管硬化、冠心病和肿瘤[2]。补充叶黄素或提高叶黄素血液浓     

DNA甲基转移酶1基因低表达的人支气管上皮细胞基因组甲基化水平的体外试验

目的 观察人支气管上皮细胞(16HBE)的DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因低表达细胞株细胞周期和基因组整体甲基化水平的改变.方法 用慢病毒介导的RNA干扰方法将4个不同的短发夹RNA片段转染16HBE细胞,并用免疫印迹法(Western blotting)检测该细胞DNMT1蛋白表达水平,用流式细胞仪和5-甲基胞嘧啶(5-mC)免疫荧光法检测该细胞的细胞周期和细胞基因组整体甲基化水平.结果 16HBE-shDNMT1-4细胞株的DNMT1蛋白表达与对照组相比平均降低约44%,差异有统计学意义(P＜0.05),但细胞周期和基因组整体甲基化水平无明显改变.结论 成功建立DNMT1基因低表达的16HB细胞株,其细胞周期和基因组整体甲基化水平无明显改变.

Abstract：

Objective To construct DNA methyltransferase 1 (DNMT1) low expression 16HBE cell line and observe the variation of cell cycle and global genomic DNA methylation. Methods The method of Lenti-virus induced RNA interference was applied to introduce four different shRNA fragment into 16HBE cells. Flow cytometry and 5-mC immunofluorescence methods were used to observe the cell cycle and global DNA methylation status of DNMT1 low expression 16HBE cells. Results The DNMT1 protein relative expression level of 16HBE-shDNMT1-4 cell line was down regulated about 44%(P＜0.05 ) compared with the control. No obvious differences of cell cycle and global genome DNA methylation status were observed between the 16HBE and 16HBE-shDNMT1. Conclusion The DNMT1 gene low expression cell is successfully constructed, and there are no obvious changes happened on the cell cycle and global genomic DNA methylation.     

人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因RNA干扰后细胞生物学性状分析

目的 探讨人支气管上皮细胞(HBE)DNA聚合酶β(polβ)基因RNA干扰后的生物学性状变化.方法 实验设实验组、空载体组、正常对照组、阳性对照组;运用载体介导的RNA干扰技术抑制polβ基因在HBE中的表达,在光学显微镜下观察转染重组子的实验组细胞及正常对照组细胞的形态学特征;绘制细胞生长曲线;分析细胞倍增时间;运用流式细胞技术分析细胞周期;以Hella细胞作阳性对照,采用软琼脂糖恶性程度鉴定实验分析细胞的恶性程度.结果 光镜下可见实验组细胞内颗粒物明显增多,体积稍有增大;3组细胞的生长曲线均呈现相似的S型;实验组、空载体组及正常细胞组的倍增时间相近,分别为0.81、0.84和0.79 d;3组细胞的G1期(83.9%、81.0%、84.6%)、G2期(4.9%、5.5%、6.2%)和S期(11.2%、13.5%、9.2%)分布相近;实验组细胞未见在双层软琼脂糖中生长出细胞集落,而阳性对照Hella细胞集落明显.结论 polβ基因缺陷对HBE生物学性状的短期影响不明显.     

高氟茶浸泡液的细胞毒性及致突变性

[目的]研究含氟茶浸泡液的细胞毒性和致突变性,探讨高氟茶对中国仓鼠肺成纤维细胞（V79细胞）的遗传毒作用。[方法]选取绿茶A、绿茶B、对照茶为研究对象,分别制备其茶浸泡液。将上述3种茶浸泡液分别设立0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00g／L7个质量浓度组,对V79细胞分别进行2、4、8、12、24h染毒。采用甲基四唑蓝（MTT）法检测3种茶浸泡液对V79细胞的毒性;运用鼠伤寒沙门菌回复突变试验（Amestest）检测3种茶浸泡液的致突变性。[结果]绿茶A、绿茶B和对照茶浸泡液中氟化物的浓度分别为2330、1390、7.53mg／kg,绿茶A、绿茶B的氟含量均超过了中国农业行业标准（NY659-2003）规定茶叶中氟化物（以F-计）≤200mg／kg的标准。在MTT实验中,3种茶浸泡液对细胞活性的抑制作用具有明显的时间-效应（P〈0.05）和剂量-效应关系（P〈0.05）。绿茶A、绿茶B的细胞存活率明显低于对照茶（P〈0.05）。在作用4-24h时,绿茶A的细胞存活率低于绿茶B（P〈0.05）。分析3种茶不同培养时间的半数抑制浓度（IC50）发现,3种茶组间Ic50的差异均有统计学意义（P〈0.05）,绿茶A、绿茶B、对照茶不同培养时间平均Ic50分别为20.26、23.24、28.18g／L。在Ames试验中,3种茶浸泡液在8-5000μg/皿的浓度上,4菌株回变菌落数与相应的阴性对照组之间的差异均有统计学意义。[结论]绿茶A、B浸泡液对V79细胞活性均有抑制作用,其细胞毒性均明显高于对照茶。未见高氟茶浸泡液有致突变作用。绿茶A、B对V79细胞的毒性比对照组大可能与它含氟量高有关。     

人源性DNA聚合酶β原核蛋白的表达、蛋白纯化及其功能初探

[目的]利用人源性DNA聚合酶β原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化DNA聚合酶β蛋白,并检测蛋白活性。[方法]将重组质粒pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ转化入大肠杆菌E.coli中,IPTG诱导其表达并鉴定。利用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到人源性DNApolβ融合蛋白,纯化的融合蛋白用EK酶酶切后,通过Ni2+柱纯化获得高纯度的人源性DNApolβ蛋白,电泳迁移率变动分析实验检测DNApolβ融合蛋白的AP修复活性。[结果]转化入大肠杆菌E.coliRosetta2的DNApolβ诱导表达最好,蛋白表达量高。金属螯合层析纯化后得到融合蛋白经EK酶切后得到高纯度的人源性DNApolβ蛋白,EMSA实验证明所纯化的DNApolβ融合蛋白不具有AP修复活性。[结论]利用原核表达载体pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ在E.coliRosetta2中表达和纯化获得高纯度的DNApolβ融合蛋白,为下一步开展DNApolβ蛋白的生物学功能研究打下基础。     

DNA聚合酶β表达水平对苯代谢物氢醌致细胞凋亡及线粒体膜电位的影响

目的 探讨DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)对氢醌(HQ)所致细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 以polβ野生型(polβ+/+)、polβ缺陷型(polβ-/-)及polβ高表达型(polβoe)小鼠胚胎成纤维细胞为研究对象,以不同浓度的HQ溶液染毒后,采用流式细胞术分别检测HQ对细胞凋亡和线粒体膜电位( △Ψm)的影响,试剂盒法测定细胞内活性氧(ROS)和羟自由基(·OH)含量;化学发光法分析细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力.结果 与对照组相比,各染毒组凋亡细胞率和△Ψm降低的细胞比例明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞比较,20.00、40.00、80.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞凋亡率明显增高,10.00、20.00、40.00、80.00μmol/L染毒组polβ oe细胞凋亡率明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞(20.60％±0.57％、37.95％+0.64％、44.50％±1.27％、57.55％+1.06％)比较,10.00、20.00、40.00、80.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞△Ψm降低的细胞比例(33.60％±1.55％ 、46.05％±1.77％、52.75％±2.05％、75.20％±0.56％)明显增高,polβ oe细胞△Ψm降低的细胞比例(16.05％±1.20％、29.80％±1.21％、35.15％±1.06％、53.80％±0.85％)明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞比较,各染毒组polβ-/-细胞产生的荧光强度明显增高,polβ oe细胞的荧光强度明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与polβ+/+细胞相比,20.00、40.00 μmol/L染毒组polβ-/-细胞内·OH含量明显增高,polβ oe细胞内·OH含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).在相同浓度HQ染毒剂量下,polβ-/-细胞内SOD和GSH-Px消耗最快,polβ oe细胞内的SOD和GSH-Px消耗速度缓慢.结论 HQ可诱导细胞产生ROS,降低△Ψm,从而介导凋亡的发生;polβ可以帮助细胞对抗ROS的产生,降低线粒体发生去极化的几率,从而对HQ介导的凋亡起到一定的保护作用.     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子甲基化修饰及mRNA表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对人血管平滑肌细胞(HVSMCs)5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因启动子甲基化修饰及其mRNA表达的影响。方法正常人脐动脉血管平滑肌细胞体外培养,在培养基中加入临床高Hcy血症相关浓度及极高浓度的Hcy(0、30、100、200、500和1000μmol/L),并孵育72h,以MS-PCR分析MTHFR启动子区域甲基化状态,采用RT-PCR测定MTHFR mRNA的表达水平。结果不同浓度Hcy处理人血管平滑肌细胞后,其MTHFR基因启动子区域出现去甲基化,甲基化水平明显降低。RT-PCR结果显示MTHFR mRNA表达增加。结论Hcy可促进人血管平滑肌细胞MTHFR启动子区域去甲基化,并使MTHFR mRNA表达增加。     

香加皮水提取物诱导人食管癌细胞TE-13凋亡的实验研究

[目的]运用多种技术手段研究香加皮水提取物诱导人食管癌细胞TE-13凋亡.[方法]利用MTT染色在普通光镜下观察细胞凋亡形态学变化并观测药物对肿瘤细胞的抑制率;通过流式细胞仪分析人食管癌TE-13细胞凋亡率、细胞周期变化;DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测肿瘤细胞凋亡的DNA水平变化;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测细胞内钙离子浓度变化.[结果]经香加皮水提取物处理的人食管癌细胞TE-13出现核固缩、凋亡小体、新月状浓染区等细胞凋亡形态学改变,各剂量药物处理组的肿瘤细胞均表现生长抑制,且具有剂量依赖性,250μg/ml香加皮水提取物处理组的抑制率达91.02%.DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯形电泳条带.药物处理组的肿瘤细胞更多地被阻止于G2/M期,各剂量组均出现明显的凋亡变化,最大凋亡率可达20.3%.各剂量药物处理组的肿瘤细胞内的Ca2 浓度明显高于对照组(P<0.01).[结论]香加皮水提取物可明显抑制人食管癌细胞TE-13的生长增殖,诱导细胞凋亡,并能改变该肿瘤细胞周期分布,阻止细胞周期于G2/M期.