PI3K/AKT/mTOR信号传导通路在姜黄素抑制人肝癌细胞Cox-2表达中的作用

目的探讨MAPK和PI3K信号传导通路在姜黄素调节的环氧合酶2(Cox-2)表达中的作用。方法分别加入25、50μmol/L LY294002,10、20μmol/L U0126,5、10ng/ml西罗莫司(雷帕霉素,rapamycin)处理人肝癌细胞BEL-7402,30min后加入10μmol/L姜黄素,对照组单独加入0、10μmol/L姜黄素,培养6h后,采用RT-PCR和Western blotting方法检测BEL-7402细胞中Cox-2 mRNA和蛋白的表达。以不同浓度(0、2.5、5、10、15、20μmol/L)姜黄素或25μmol/L LY294002处理BEL-7402细胞,培养6h后,采用Western blotting检测总AKT蛋白和磷酸化AKT蛋白的表达;以不同浓度(0、2.5、5、10、15、20μmol/L)姜黄素或10μmol/L U0126处理BEL-7402细胞,培养6h后,采用Western blotting检测总ERK蛋白和磷酸化ERK蛋白的表达。结果与仅加入10μmol/L姜黄素的BEL-7402细胞比较,分别加入25、50μmol/L LY294002,5、10ng/ml西罗莫司后,BEL-7402细胞中的Cox-2 mRNA和蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),而加入10、20μmol/L U0126后表达无明显变化(P>0.05)。采用不同浓度姜黄素或25μmol/L LY294002处理后,BEL-7402细胞磷酸化AKT蛋白表达逐渐降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),但总AKT蛋白表达与对照组相比无明显变化(P>0.05)。不同浓度姜黄素或10μmol/L U0126处理后,BEL-7402细胞磷酸化ERK蛋白和总ERK蛋白表达与对照组相比均无明显变化(P>0.05)。结论姜黄素可能通过PI3K/AKT/mTOR信号传导通路抑制人肝癌细胞BEL-7402中Cox-2的表达。     

Akt 在 Ang-1、Ang-2调节失血性休克大鼠血管反应性双相变化中的作用

目的观察蛋白激酶B(PKB/Akt)在血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)调节失血性休克大鼠血管反应性双相变化中的作用。方法观察失血性休克后,以及Ang-1、Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性过程中肠系膜上动脉(SMA)中Akt蛋白表达和磷酸化变化,并观察Akt抑制剂对Ang-1和Ang-2调节缺氧早期和晚期血管反应性作用的影响。结果 (1)失血性休克后SMA中Akt蛋白表达无明显改变,但磷酸化水平逐渐增高(P<0.01);(2)Akt抑制剂(1×10-5mol/L)可显著抑制缺氧10min的血管高反应性,也可显著抑制Ang-1对缺氧10min血管高反应性的维持作用(P<0.01);但对缺氧4h的血管低反应性和Ang-2降低缺氧4h血管反应性的作用无显著影响;(3)缺氧10min时,降低血管高反应性的Ang-2可降低Akt磷酸化;缺氧4h时,恢复血管低反应性的Ang-1和Tie-2抑制剂可抑制Akt磷酸化(P<0.01)。结论 Akt参与了休克早期Ang-1和Tie-2受体对血管高反应性的调节。     

舒洛地特对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的 研究舒洛地特(SDX)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用及其机制.方法 CCK-8法确定ox-LDL干预HUVEC剂量及SDX药物浓度,活性氧(ROS)检测试剂盒验证SDX对HUVEC的保护作用.实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、小凹蛋白(caveolin)-1 mRNA表达,免疫印迹试验检测eNOS、caveolin-1蛋白表达.Transwell试验检测HUVEC迁移能力,免疫印迹试验检测抗磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达.结果 100 μg/ml ox-LDL刺激下,HUVEC细胞活力显著下降(P＜0.01),加入0.125 LRU/ml SDX后细胞活力明显改善(P＜0.01),ROS产生降低(P＜0.01).SDX可下调ox-LDL损伤HUVEC后caveolin-1 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),上调eNOS mRNA和蛋白、p-eNOS蛋白表达(P＜0.05),明显改善受损HUVEC迁移能力(P＜0.01).结论 SDX通过调控caveolin-1/eNOS信号通路改善受损HUVEC细胞迁移能力,从而保护内皮细胞.     

七氟醚上调PI3K/Akt/mTOR活性对小鼠心肌缺血再灌注损伤中自噬水平的影响

 目的 从PI3K/Akt/mTOR通路角度,探讨七氟醚对小鼠心肌缺血再灌注损伤中自噬水平的影响。方法 小鼠24只随机分4组(n=6):假手术组,只开胸不结扎;缺血再灌注组,戊巴比妥钠麻醉下结扎冠状动脉左前降支行缺血/再灌注手术;七氟醚组,七氟醚麻醉下手术;七氟醚+LY294002组,术前一周每日注射PI3K阻断剂LY294002,余同七氟醚组。收集血浆检测心肌损伤标志物肌酸激酶-MB(CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)水平。心肌组织用免疫印迹法检测自噬标志物 LC3、Beclin1,及信号通路磷脂酰肌醇3-磷酸激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素(mTOR) 总蛋白及磷酸化蛋白水平。结果 与假手术组相比,其余3组的血浆CK-MB、cTnI、心肌自噬标志蛋白LC3和Beclin1水平均增高(P<0.05),磷酸化PI3K、Akt、mTOR与总蛋白比值降低(P<0.05)。与假手术组相比,七氟醚组的PI3K、Akt、mTOR总蛋白水平差异无统计学意义;而缺血再灌注组PI3K、Akt水平增高(P<0.05),且mTOR蛋白水平降低(P<0.05);七氟醚+LY294002组PI3K水平增高(P<0.05),且Akt、mTOR蛋白水平降低(P<0.05)。与缺血再灌注组相比,七氟醚组和七氟醚+LY294002组血浆CK-MB和cTnI、LC3和Beclin1水平均降低(P<0.05)。与缺血再灌注组相比,七氟醚组的磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白与总蛋白比值升高(P<0.05)。与七氟醚组相比,七氟醚+LY294002组血浆CK-MB、cTnI降低,LC3和Beclin1水平均增高(P<0.05);七氟醚+LY294002组的磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白与总蛋白比值均降低(P<0.05)。结论 七氟醚抑制了缺血再灌注引发的过度自噬,可能的机制是上调了PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平。     

运动调节小凹蛋白-1表达改善2型糖尿病小鼠骨髓内皮祖细胞迁移能力

目的:探究不同运动方式是否调节小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)表达及其对2型糖尿病小鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)迁移能力的影响。方法:将40只8周龄雄性db/db小鼠按电脑产生的随机数字进行编号,随机分为有氧运动组、抗阻运动组、联合有氧+抗阻运动组(联合运动组)以及对照组,每组10只。经过8周的运动干预后分离小鼠骨髓细胞,运用密度梯度离心法分离骨髓EPCs,并以EGM-2MV培养基进行体外培养,采用双荧光染色阳性率和流式细胞仪检测表型CD133共鉴定EPCs。采用细胞划痕实验反映细胞迁移情况,Western blot检测各组Cav-1蛋白表达水平。结果:与对照组相比,有氧运动、抗阻运动及联合运动组迁移能力都明显增强(P<0.05),且联合运动组效果最佳(P<0.05)。联合运动组的Cav-1表达水平高于其它三组(P<0.05)。结论:联合运动较单纯有氧、抗阻运动及对照组更能上调Cav-1的表达,且明显改善2型糖尿病小鼠EPCs的迁移能力。     

转录因子KLF4在内皮祖细胞分化过程中的表达及意义

目的探讨转录因子KLF4在内皮祖细胞分化过程中的表达及意义。方法以Ficoll密度梯度离心法从SD大鼠骨髓分离单个核细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,以DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色和FITC标记的CD133、CD34进行鉴定。细胞免疫化学法检测原代培养7d内皮祖细胞KLF4的表达,RT-PCR法检测原代培养5、10、15d后细胞内KLF4及一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达。结果经DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色鉴定证实获得的细胞为内皮祖细胞。细胞免疫化学检测发现KLF4表达于细胞核内;RT-PCR检测结果显示,5、10、15d大鼠内皮祖细胞的KLF4mRNA表达(分别为0.830±0.017,0.980±0.014,1.090±0.014)逐渐增强(P<0.01),eNOSmRNA表达(分别为0.310±0.008,0.500±0.011,0.650±0.010)也逐渐增强(P<0.01)。结论在内皮祖细胞分化为内皮细胞的过程中,KLF4的表达逐渐增强,并与成熟内皮功能相关。     

PI3K/Akt信号通路在磷酸三钙磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解中的作用

目的:研究PI3K/Akt信号通路在磷酸三钙(tricalcium phosphate,TCP)磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解中的作用。方法:36只雄性ICR小鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(TCP)和LY294002处理组,每组12只。取TCP磨损颗粒30 mg置于颅顶后缝合皮肤构建小鼠颅骨溶解模型。LY294002处理组小鼠于术后第2天颅顶局部注射PI3K抑制剂LY294002(5 mg·kg~(-1)),每周3次;假手术组小鼠颅骨顶仅注射生理盐水,注射时间与LY294002一致。2周后处死动物取骨膜和颅骨。通过Micro-CT分析小鼠颅骨溶解情况、骨密度(bone mineral density,BMD)和骨矿含量(bone mineral content,BMC);HE染色观察颅骨表面炎症反应及破骨细胞(osteoclasts)形成;Real-time PCR检测骨组织中破骨细胞生成标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、组织蛋白酶K(cathepsin K,Cst K)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB kigand,RANKL)和c-Fos的m RNA水平;ELISA检测骨膜中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6等水平;Western Blotting检测颅骨组织Akt、p-Akt Ser473和p-AktThr308等蛋白表达变化。结果:Micro-CT和组织形态学分析结果显示,PI3K抑制剂LY294002能明显抑制TCP磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解和破骨细胞形成(P<0.05),增加BMD和BMC含量(P<0.05);下调破骨细胞生成标志物TRAP、Cst K、RANKL和c-Fos等m RNA水平(P<0.05),并抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放(P<0.05);而且LY294002显著减弱TCP磨损颗粒诱导的Akt信号蛋白活化,导致p-Akt S-er473和p-AktThr308等蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路参与调控TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解,可作为假体周围骨溶解和关节松动的治疗靶标。     

重组ACE2基因对人血管内皮细胞中eNOS磷酸化水平的影响

目的 探讨重组血管紧张素转换酶2(ACE2)基因转染对内皮源性一氧化氮(NO)合酶(eNOS)磷酸化水平的影响.方法 克隆和构建含人ACE2基因全长的重组质粒(pACE2),并将之转染入人血管内皮细胞中;采用实时定量PCR和Western印迹技术检测转染细胞中的ACE2、eNOS的表达情况,同时使用硝酸还原酶比色法测定细胞中NO含量.结果 血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ,100 nmol/L)加入细胞后可抑制由胰岛素刺激的Ser1177-eNOS磷酸化与NO生成(n=5～6,P＜0.01).pACE2基因转染可逆转细胞中由Ang Ⅱ对胰岛素诱导eNOS磷酸化的抑制效应,同时伴NO水平上升(N=5～6,P＜0.01).结论 ACE2过表达可明显改善人血管内皮细胞中eNOS磷酸化的表达,伴有NO生成增加,提示ACE2可能通过调节血管Ang Ⅱ/NO的平衡,在改善血管内皮功能和胰岛素抵抗中起重要功效.     

GDF11对糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞细胞凋亡的影响及其信号机制

 目的 探讨生长分化因子11(GDF11)对糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞凋亡的影响及其信号机制。方法 复苏BMSCs并将其分为4组:正常小鼠BMSCs组(Nor),糖尿病小鼠BMSCs组(DB),GDF11干预组(DB+GDF11;GDF11),抑制剂组(DB+GDF11+ LY294002;LY)。各组细胞培养3 d后,台盼蓝染色观察细胞凋亡率。Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和磷酸化(p)-PI3K、p-Akt的表达水平。结果 与正常小鼠BMSCs相比,糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡率显著升高[(36.2±3.3)% vs. (3.1±1.1)%,P＜0.05];GDF11可降低糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡率[(18.9±1.9)% vs. (36.2±3.3)%,P＜0.05],提高Bcl-2/Bax的蛋白表达比[(1.63±0.10) vs. (0.26±0.09);P＜0.05],同时激活PI3K[p-PI3K/PI3K:(0.98±0.08) vs. (0.42±0.11);P＜0.05]/Akt[p-Akt/Akt:(0.94±0.10) vs. (0.32±0.15);P＜0.05]信号通路。而且,当抑制PI3K/Akt信号通路后,GDF11抑制糖尿病小鼠BMSCs凋亡的作用明显减弱[细胞凋亡率:(41.1±3.9)% vs. (18.9±1.9)%,P＜0.05]。结论 GDF11可通过激活PI3K/Ak信号通路抑制糖尿病小鼠BMSCs细胞凋亡。     

纳米磁粒子复合物标记对内皮祖细胞生物学特性影响的实验研究

目的 探讨超顺磁性纳米磁粒子复合物Fe2O3-多聚赖氨酸(PLL)标记外周血内皮祖细胞(EPCs)后对细胞生物学特性的影响,为标记细胞的体内外MRI提供实验基础.方法 合成Fe2O3-PLL复合物.分离兔外周血单个核细胞,贴壁法筛选出EPCs,25 mg/L的Fe2O3-PLL标记EPCs,普鲁士蓝染色、电子显微镜观察细胞内铁,四氮噻唑蓝(MTT)比色试验比较未标记、标记细胞间生长曲线的差异,流式细胞分析检测标记、未标记细胞的细胞周期变化、细胞凋亡、表面标记物表达情况,实时定量聚合酶链反应(PCR)检测标记、未标记细胞的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、KDR、血管性假血友病因子(vWF)基因在mRNA水平上的差异,激光共聚焦显微镜下观察并分析标记、未标记细胞的Ca2+浓度、膜流动性变化.实验所得数据,计量资料多组比较采用方差分析,两组间比较采用两样本t检验.结果 Fe2O3-PLL对细胞的标记率接近100%,铁颗粒位于细胞质内.25 mg/LFe2O3-PLL标记细胞,其生长曲线、细胞周期[G0-G1期为(93.74±3.52)%]、细胞凋亡[早期凋亡率为(12.89±1.81)%]与未标记细胞[细胞周期为(94.57±3.66)%,细胞凋亡率(11.67±1.18)%]相比,差异无统计学意义(t值分别为0.283、0.977、P值均>0.05);eNOS、KDR、vWF基因的相对表达量及CD34、CD106、CD146、KDR等细胞表面标记物的表达水平相比差异也无统计学意义(P值均>0.05);对Ca2+通道影响小,细胞膜流动性无明显变化.结论 25 mg/L的Fe2O3-PLL对兔外周血EPCs的标记率接近100%,并且对细胞的生物学特性无明显影响,可用于进一步MRl的研究.     

京尼平苷调节胰腺β细胞增殖的细胞信号机制研究

目的考察京尼平苷（Gen）对胰腺β细胞增殖的影响及其细胞信号转导机制。方法将INS-1细胞（一种胰腺β细胞）用Gen处理一定时间之后,用MTT方法测定活细胞的数量,用BrdU标记的方法分析细胞增殖的情况,Western印迹分析Gen对于细胞增殖相关的Akt和FoxO1磷酸化的影响。结果Gen处理INS-1细胞可将活细胞数量提高45%（P〈0.01）,并且BrdU标记的阳性细胞数量明显增加（P〈0.01）。另外,Gen还能显著上调INS-1细胞中Akt308丝氨酸位点和叉头转录因子FoxO1的磷酸化（P〈0.01）,而且这种作用可被PI3K的抑制剂LY294002阻断。结论Gen能够促进胰腺β细胞增殖,而且这种作用可能与其激活PI3K激酶途径、增强FoxO1的磷酸化有关。     

PI3KAktCOX-2途径在人宫颈癌HeLa细胞放射抗拒中的作用

目的 探讨PI3K/Akt/COX-2途径在人宫颈癌HeLa细胞放射抗拒中作用的分子机制。 方法 COX-2抑制剂塞来昔布单独及联合PI3K抑制剂LY294002作用HeLa细胞24 h,X射线不同剂量照射,利用克隆形成法计算细胞存活率,单击多靶模型拟合细胞存活曲线,计算D_q、D₀、SF₂值和放射增敏比(SER);应用Western blot方法检测Akt、磷酸化Akt、COX-2、Bad和磷酸化Bad蛋白的表达;应用RT-PCR检测COX-2和Bad mRNA的表达。结果 塞来昔布单独及联合LY294002作用HeLa细胞组D_q、D₀、SF₂明显低于单纯照射组;X射线照射后,能够活化HeLa细胞PI3K/Akt/COX-2途径,塞来昔布能够多靶点抑制PI3K/Akt/COX-2途径的活化。结论 PI3K/Akt/COX-2途径的活化是HeLa细胞放射抗拒的重要原因,PI3K/Akt与COX-2之间存在正反馈的调节,抑制PI3K/Akt/COX-2途径的活化能够提高HeLa细胞放射敏感性。     

血管内皮生长因子基因转染自体骨髓血管内皮祖细胞治疗下肢缺血的实验研究

目的:利用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),并移植到下肢缺血的高脂血日本大耳兔体内,观测其促进血管新生、改善肢体缺血的效果。方法:①制作高脂血兔,梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞(MNCs),用内皮细胞专业培养基(EGM-2)诱导培养EPCs,并用双荧光染色法及免疫组化等方法进行鉴定。②脂质体介导携带EGFP标记的VEGF165质粒转染EPCs,用激光共聚焦显微镜检测VEGF蛋白的表达,用流式细胞仪检测转染率。③制作兔单侧下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs及EGM-2培养基,多种方法检测移植效果。结果:①诱导出的梭形细胞,经FITC-UEA-I和DiI-acLDL荧光双染证实为正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实其Flk-1和Ⅷ因子的表达。②激光共聚焦显微镜下见绿色荧光蛋白表达,证实VEGF165转染成功,经流式细胞仪检测得到转染率约22.5%。③DSA及免疫组化检查显示VEGF165基因转染后的EPCs移植后改善肢体缺血的效果优于其他2组。结论:VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

高糖对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的　观察高糖对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的影响。方法　密度梯度离心法获取外周血单个核细胞 ,培养 7天后 ,收集贴壁细胞并加入不同浓度葡萄糖使培养液终浓度分别为 1 5、2 5、35和 4 5mmol/L ,并干预一定时间 (6、1 2、2 4和 4 8h)。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC UEA Ⅰ和DiI acLDL双染色细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs,倒置荧光显微镜下计数。然后 ,分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒分别观察EPCs的增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力。结果　高糖呈量效和时效地减少外周血EPCs数量 ,4 5mmol/L浓度高糖作用 2 4h对EPCs数量的影响最为显著 (较对照组减少了近 1 / 2 ,P <0 0 1 )。高糖也显著抑制外周血EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论　高糖可减少EPCs数量、抑制其功能 ,并呈浓度和时间依赖性     

Paraquat increases superoxide dismutase activity and radiation resistance in two mouse lymphoma L5178Y cell strains of different radiosensitivities.

It is shown that paraquat treatment (1 h, 1 x 10(-5) mol/l) increases the activity of superoxide dismutase (SOD) in L5178Y (LY) R and S cells by about three times. When combined with X-irradiation, 0.5 h of treatment preceding irradiation increased the SOD activity two-fold and the alpha/beta ratio three-fold, as estimated from the X-ray survival curves. LY-S cells were more sensitive than LY-R cells to treatment with paraquat alone. These results indicate that SOD may be a radioprotective enzyme in LY strains and that LY-S cells are particularly sensitive to superoxide radicals as a result of a relatively low SOD activity. This explains their sensitivity to paraquat, which generates O2-, and to X-rays. The low SOD level may also explain the higher initial DNA damage in X-irradiated LY-S than LY-R cells.     

雌激素对软骨细胞蛋白多糖表型表达的影响

目的 :观察雌激素对体外培养兔关节软骨细胞蛋白多糖表型表达的影响。方法 :体外培养雌兔关节软骨细胞 ,随机分为A、B两组 ,A组中加入 1 7β-雌二醇 0mol/L、1 0 -6mol/L、1 0 -7mol/L、1 0 -8mol/L、1 0 -9mol/L、1 0 -10 mol/L、1 0 -11mol/L、1 0 -12 mol/L干预 72小时 ;B组先用 1 0ng/mlIL-1 β干预 2 4小时 ,随后分别加入 0mol/L、1 0 -6mol/L～ 1 0 -12 mol/L 1 7β-雌二醇作用 72小时。采用RT-PCR方法观察软骨细胞核心蛋白、Decorin、BiglycanmRNA的表达。结果 :A组中 ,1 0 -6mol/L雌二醇组不表达Decorin,1 0 -9～1 0 -11mol/L雌二醇组Decorin表达量较正常对照减少 ;BiglycanmRNA表达量与空白对照无明显差异。B组中 ,IL -1 β +1 0 -7、1 0 -8mol/L雌二醇组核心蛋白mRNA表达量较空白对照明显减少 ;IL -1 β +1 0 -7～ -11mol/L雌二醇组DecorinmRNA表达量较单用IL -1 β组有所增加 ;除IL -1 β +1 0 -12 mol/L组外 ,其余各组表达BiglycanmRNA明显减少。结论 :雌激素对关节软骨细胞蛋白多糖表型表达的调控作用随其浓度变化而不同。高浓度雌激素 (1 0 -6mol/L)抑制正常软骨细胞蛋白多糖合成。对变性软骨细胞而言 ,低于生理浓度的雌激素对维持其蛋白多糖表型较适宜。