基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值<15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值〈15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证

目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA,vanB）序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

基因芯片技术直接检测常见腹泻病致病菌的应用研究

目的 探讨基因芯片技术在腹泻病粪便标本常见致病菌检测中的应用.方法 筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的 基因,分别为志贺菌ipaH基因、沙门菌hilA基因、副溶血弧菌tdh基因、空肠弯曲菌FlaA基因、肠出血性大肠埃希菌stxA2基因、肠产毒性大肠埃希菌st基因、霍乱弧菌ctxA2基因.设计相应的引物及探针,制备寡核苷酸芯片.对多重PCR扩增条件进行优化,将PCR扩增产物与带有7种特异探针的基因芯片杂交.检测标准菌株25株,模拟粪标本及临床腹泻病粪便标本64份.结果 经优化多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,与基因芯片特异的探针杂交后.全部产生特异性杂交信号.标准菌株及模拟粪标本检测的阳性和阴性对照符合率均为100%.单一菌株最低检测量为10～100cfu/ml.64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌,其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌,检出率为70.3%(45/64).粪培养检出 16份志贺菌,6份副溶血弧菌.检出率为34.4%(22/64),基因芯片法明显优于粪培养方法(P<0.01).结论 该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,检出率高,达到了高效的检测目的 ,具有较好的实用性.     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139

目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性。方法:选择EHEC O157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(u idA);霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(glycosotransferaseLPSgt)基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰。在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果:PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。     

腹泻病毒化学发光基因芯片检测方法的建立和验证

目的 建立一种化学发光基因芯片检测方法,实现7种腹泻病毒,A组轮状病毒、B组轮状病毒、Ⅰ型诺如病毒、Ⅱ型诺如病毒、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的快速、准确检测.方法 选择7种病毒特异性基因的保守区,设计引物与探针,制备寡核苷酸基因芯片.将多重实时荧光PCR(RT-PCR)扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光检测后进行结果分析.在优化的RT-PCR体系、杂交条件和化学发光检测条件下,评价芯片的灵敏度、重复性和特异性.结果 研制的基因芯片具有良好的特异性和灵敏度,检测体外转录RNA参考品的最低检测限为3×103拷贝/反应,检测临床样本的灵敏度为95.2％、特异性为92.1％、符合率为95.1％.结论 建立了一种基于化学发光基因芯片的腹泻病毒检测方法,此法能快速、灵敏、特异地检测和鉴别7种腹泻病毒,具有较好的应用前景.     

可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

16S rDNA寡核苷酸芯片鉴定致病菌的初步研究

目的：建立一种基于16SrDNA寡核苷酸芯片的检测和鉴定常见致病茵的技术。方法：以16SrDNA为靶标，针对待检细菌设计合成一系列寡核苷酸探针，制备寡核苷酸芯片。细菌DNA经通用引物扩增标记后，与芯片杂交，对杂交图谱进行分析归纳，得到一套种和属特异的检测模式。结果：以本室保存的33株茵(包括7个属15个种)进行初步检验，结果表明，种水平上的鉴定准确率为78．79％，21．21％可鉴定到属的水平。结论：该研究建立的16SrDNA寡核苷酸芯片技术可以稳定、特异地实现细菌的高通量鉴定，为进一步检测研究奠定了基础。     

检测PKD2基因多态性生物芯片的建立

目的：PKD2基因在人群中以多种等住基因的形式存在和遗传，其中某些变异型等位基因所编码的多囊蛋白2功能发生改变或缺失，从而引起常染色体显性遗传多囊肾病（ADPKD）的发生。检测PKD2基因的变异情况具有重要的临床诊断意义。方法：针对文献报道的中国人群中检测发现的PKD2变异位点，设计检测探针度引物，并制备基因芯片，构建了基因片段的质粒作为标准模板。结果：通过实验优化，建立了样品荧光标记、基因芯片杂交与检测的条件度分型标准。通过对标准质粒模板和人外周血提取的基因组DNA模板的检测，验证了基因芯片检测结果的重复性和准确性。结论：本实验制备的基因芯片可以准确区分PKD2基因中的9个突变住点的变异情况。     

基于23S rDNA基因的病原细菌通用检测寡核苷酸芯片

目的 :利用新兴的生物芯片技术 ,以细菌 2 3SrDNA基因为靶序列 ,实现常见病原细菌的通用检测。方法 :从核酸数据库中调用一些病原细菌的 2 3SrDNA基因序列 ,在指定的片段内设计目的细菌的种特异性寡核苷酸探针 ,用适当的方法固定在玻片上 ,制备寡核苷酸芯片 ;扩增实验细菌 2 3SrDNA基因片段 ,并同时完成荧光素的掺入标记 ,标记扩增产物纯化后 ,与芯片进行杂交 ,根据杂交结果进行条件优化及芯片评价。结果 :通过对探针、固定化、标记、杂交等条件进行优化 ,本实验中所使用的多种实验细菌可以在 4h左右通过杂交得到准确鉴定 ;以奇异变形杆菌为对象 ,本系统最低检出菌液浓度为 10 0个 ml,即反应体系中含 10个菌体即可检出。结论 :本研究建立的寡核苷酸芯片系统可以稳定而特异地实现多种细菌的通用检测 ,具有良好的应用前景。     

HIV检测长寡核苷酸芯片的研制和临床初步应用

目的 研制人类免疫缺陷病毒(HIV)快速筛查的寡核苷酸芯片并初步应用于临床。方法 以HIV2个基因型(包括9个亚型)的32株典型性代表株和HIV-2特有的vpx序列的保守序列为靶序列,设计长寡核苷酸探针,并制备成Oligo芯片。样品经随机特异性引物PCR标记后与芯片杂交,PCR产物同时进行测序分析。结果 1例HIV患者芯片杂交结果阳性,20名健康对照血清均为阴性。阳性标本的序列分析表明,芯片杂交结果符合测序的分型结果。结论 此芯片可初步用于检测血清HIV RNA,并对HIV基因(亚)型进行分析。     

13种虫媒病毒基因芯片检测方法的建立

目的 建立能对虫媒病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术,为虫媒病毒提供一种高通量的检测与鉴定技术.方法 从GenBank获得13种虫媒病毒的全部基因组序列,利用Clustal X和BLAST等比对软件,设计针对这些虫媒病毒所在的3个属的通用寡核苷酸探针,用于病毒的属水平筛查.然后设计针对每种病毒的特异性寡核苷酸探针,用于每种病毒的检测鉴定.寡核苷酸探针长度均为70mer,将设计好的探针与GenBank上所有病毒基因组序列进行比对,验证其种属特异性,然后进行探针合成和基因芯片制备.所有病毒在BSL-3和BSL-2实验室进行培养,待检病毒核酸通过锚定随机PCR进行扩增,经荧光染料标记后与基因芯片杂交,利用激光共聚焦扫描仪扫描后进行结果分析.结果 所检测的13种虫媒病毒均可获得种特异性及所在属的属特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显.分别用两种不同的病毒混合后,进行模拟混合病毒感染,也得到了相应的特异杂交信号.结论 初步建立了13种虫媒病毒的基因芯片检测技术,可用于这些病毒的属水平筛查及种水平鉴定,并且可以进行混合感染标本的检测,为虫媒病毒的检测与鉴定提供了一种新的手段.     

多重PCR同时检测粪便中的志贺菌、侵袭性大肠埃希菌和O－1群霍乱弧菌的致病基因

本研究建立一种快速标本处理和多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，在一次ＰＣＲ反应中同时扩增志贺菌、侵袭性大肠埃希菌的侵袭性质粒（ｉａｌ）基因和Ｏ－１群霍乱弧菌的霍乱毒素Ａ亚单位（ｃｔｘＡ）基因。扩增产物经电泳，出现与已知阳性对照细菌条带大小一致的条带即判断为该标本阳性。对一组经常规培养生化鉴定法诊断为霍乱的２６份腹泻病人粪便标本检测后，ＰＣＲ法有２４例检测到ｃｔｘＡ基因，ＰＣＲ阴性的２例为非Ｏ－１群；对另一组５６例粪标本亦进行了检测。本方法具有简便、快速、特异、经济和不须培养等特点，宜于临床应用。