肿瘤微环境中间充质干细胞的相关生物学特性分析

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在肿瘤微环境中是否获得肿瘤细胞的相关生物学特性而导致恶性转化。方法通过6孔板结合Transwell小室建立间充质干细胞和大鼠C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,另设单独培养的间充质干细胞作为对照组。于相差显微镜下观察培养后两组细胞的形态学改变;采用流式细胞术(FCM)分析细胞周期变化;采用荧光定量PCR和免疫荧光法检测间充质干细胞mdm2、p53mRNA水平及共培养后两组细胞中p53突变蛋白和mdm2癌蛋白的表达。结果共培养后实验组细胞表现为胶质瘤细胞样形态。细胞周期检测结果显示共培养7d后,对照组G1期细胞占90.48%±6.62%,实验组占82.22%±2.74%,两组间差异无统计学意义(P>0.05);对照组S期细胞占4.66%±4.16%,实验组占7.35%±1.93%,两组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。定量PCR及免疫荧光检测显示,实验组p53mRNA水平明显降低,为对照组的0.24倍(P<0.05);部分实验组细胞(24.8%)中表达突变型p53蛋白,而对照组无突变p53蛋白表达(P<0.05)。实验组mdm2mRNA及其蛋白的表达水平...     

微环境对骨髓间充质干细胞自噬水平的影响研究进展

应用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植治疗一些难治性疾病为当前研究的热点。基础研究发现BMSCs存在自噬,外界微环境如缺氧条件、药物干预、肿瘤环境等可影响BMSCs的自噬水平。BMSCs的自噬水平的高低对其生物学特性具有一定的影响。了解外界微环境对BMSCs自噬水平的影响及其自噬水平高低与其生物学特性的关系,有助于我们更好地应用BMSCs来服务临床。     

IL-6对M1型巨噬细胞向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化过程的诱导作用

目的 共培养小鼠M1型巨噬细胞RAW 264.7与乳腺癌细胞4T1,观察白介素6(IL-6)在 M1型巨噬细胞向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化过程中的作用.方法 实验共分为以下3组:A组(4T1细胞),B组(RAW 264.7细胞),C组(RAW264.7与4T1以1:4比例混合培养).流式细胞技术检测M2型巨噬细胞比例,随后加入IL-6特异性抑制剂激活素A(ACTA,25μg/ml)或重组IL-6(rIL-6,10μg/ml)后再行检测.RT-PCR检测M1、M2型巨噬细胞功能相关细胞因子及IL-6、IL-6Rα的mRNA表达量.ELISA法检测3组细胞上清中IL-6的含量,随后改变两种细胞的混合比例后再行检测.结果 RAW264.7和4T1细胞共培养后,M2型巨噬细胞比例显著增加,添加ACTA后该比例显著下降,而添加rIL-6后该比例增加.与B组比较,C组的M2型巨噬细胞相关细胞因子(CCL22、CCL2、YM1、PDGF-c、HIMP、MMP-9、IL-10)mRNA表达水平明显增高,M1型巨噬细胞相关因子(IL-12、IL-15、IL-18)mRNA表达水平明显降低.IL-6 mRNA在A组呈微量表达,在B组元表达,在C组表达明显增高,而IL-6Ra mRNA在3组中均呈高表达.与A、B组比较,C组细胞上清液中IL-6含量明显增加(P均<0.05);以不同比例将两种细胞混合后发现RAW264.7细胞数量的改变显著影响了共培养细胞上清中IL-6的水平.结论 将4T1和RAW264.7细胞共培养后,前者能促进后者分泌IL-6,并诱导其向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化.IL-6在转化过程中发挥重要作用,阻断其作用可以遏制转化.     

IL-6、IL-6R及PCNA的表达与胃癌的临床关系研究

目的 研究胃癌患者外周血中(IL-6)、胃癌组织中IL-6及其受体(IL-6R)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平及它们之间的相关性,探讨三者与胃癌临床生物学指征的关系.方法 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)技术半定量、平行地检测30例胃癌患者外周血、胃癌及其相应癌旁组织中IL-6及其受体的水平,同时运用免疫组织化学法(ABC法)检测胃癌组织中PCNA的表达情况,分析IL-6、IL-6R、PCNA与胃癌临床生物学指征的相关性.结果 胃癌患者血清中IL-6水平显著增高,手术后则明显下降;胃癌组织中IL-6、IL-6R水平较癌旁组织显著增高,且二者呈明显正相关;IL-6、IL-6R、PCNA在胃癌患者外周血和癌组织中的表达水平与患者肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移以及临床分期等临床生物学特征显著相关.结论 IL-6、IL-6R和PCNA是反映胃癌细胞恶性程度和浸润转移深度的重要指标,对它们的水平进行检测,特别是对血清IL-6水平的测定,有利于指导临床诊治,判断胃癌的发生、发展和预后情况.     

丹酚酸B对骨髓间充质干细胞SCF表达的影响

目的研究中药单体丹酚酸B对骨髓间充质干细胞(MSCs)中干细胞因子(stemcell factor,SCF)的影响。方法用贴壁培养法分离、培养和纯化MSCs,取第三代MSCs进行实验。用含不同浓度丹酚酸B的低糖DMEM培养液培养MSCs,ELISA法检测培养24、48、72h的上清中SCF的含量;RT-PCR法检测培养24、48、72h的SCF mRNA的表达。结果膜型和可溶型SCF mRNA均有表达。随着培养时间的增加,0.3μg/ml、3μg/ml、30μg/ml丹酚酸B可明显促进SCF的分泌和SCF mRNA的表达(与空白对照组比较,P<0.05),而0.03μg/ml丹酚酸B组和空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论丹酚酸B可促进MSCs分泌SCF并促进SCF mRNA的表达,提示SCF可能在中药丹参治疗心肌梗死中发挥了重要作用。     

Toll样受体5对间充质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨Toll样受体5(TLR5)对间充质干细胞(MSC)生物学特性的影响,以期探究TLR5在MSC与肿瘤关系中的作用.方法 构建过表达TLR5的慢病毒载体并用相关病毒感染MSC,通过荧光表达量、RT-qPCR和Western印迹验证TLR5在MSC中的过表达情况,通过MSC-TLR5增殖、表面抗原和细胞分化来验证TLR5过表达对MSC生物学性状影响,通过检测CBLB502激活TLR5后白细胞介素6(IL-6)和IL-8的表达水平验证TLR5生物学功能.结果 TLR5慢病毒感染MSC后,mRNA水平和蛋白水平检测TLR5表达量均显著升高,MSC-TLR5增殖、免疫表型和分化能力未发生改变,同时,CBLB502激活TLR5后,IL-6和IL-8表达量显著升高(P<0.001).结论 携带TLR5的慢病毒感染MSC后不影响MSC生物学功能,TLR5具有功能活性且可激活下游信号通路发挥免疫调节作用.     

siRNA干扰SIRT1对辐射后IL-6表达的影响

目的 研究siRNA干扰沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）对间充质干细胞（MSCs）电离辐射后诱导的炎性因子白细胞介素6（IL-6）的影响,探究SIRT1的辐射防护作用。 方法 使用0、2、4、8 Gy照射MSCs,分别在照后3、6、12、24 h提取总RNA和总蛋白,检测IL-6表达水平;将MSCs分为空白对照组、单纯照射组和SIRT1干扰联合照射组,使用Western blot、RT-PCR检测SIRT1和IL-6胞内表达。 结果 MSCs在电离照射后,IL-6的表达水平先升高后降低;在照后12 h达到最高,24 h恢复基准水平;而联合SIRT1干扰会引起IL-6水平进一步升高,加重MSCs电离辐射后的炎症反应。 结论 SIRT1可能通过抑制电离辐射诱导的炎性因子IL-6的表达,发挥辐射防护作用。     

脂多糖对受照小鼠血清IL-10、IL-6和TNF-α水平的影响

目的 探讨6 Gy137Csγ射线一次性全身照射后,小鼠血清中白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-o)水平的变化及对脂多糖刺激反应性的远期影响.方法 将实验小鼠分为假照射组和照射组,假照射组不接受照射,照射组给予6Gyγ射线照射.照射后10周,将假照射组和照射组小鼠按组别分别提前24 h和1h腹腔注射脂多糖(20 mg/kg),对照组注射生理盐水(100μl/只).取小鼠外周血,利用酶联免疫吸附技术检测小鼠血清中IL-10、IL-6和TNF-t的水平.结果 假照射组小鼠在给予脂多糖刺激1h后,血清中IL-10、IL-6和TNF-α水平与其对照组相比均显著升高(t=7.31、2.71和15.09,P分别为＜0.01、＜0.05和＜0.01).照射组小鼠在给予脂多糖刺激1h后,血清中IL-10、IL-6和TNF-α水平与其对照组相比均显著升高(t=4.14、7.18和5.14,P均＜0.01).与假照射组相比,照射组小鼠在给予脂多糖刺激24h后,TNF-α和IL-6水平无明显变化,IL-10水平升高了19.9％(t=2.84,P＜0.05).结论 经6Gyγ射线照射后10周,小鼠免疫调节功能尚未完全恢复;在接受脂多糖刺激后,假照射组和照射组小鼠的抗感染能力也有差异.脂多糖对辐射后小鼠血清中IL-10、IL-6和TNF-α水平的影响及其意义仍需进一步研究.     

原位肝移植围手术期血清TNF-α、IL-6、IL-10的变化

目的 探讨原位肝移植患者在非体外静脉-静脉转流下血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL6）、IL-10的变化规律。方法 16例终末期肝病患者,在静吸复合全麻下行肝移植手术,于麻醉后手术前、阻断前、开放前5min、开放后15min、开放后60min、术毕、术后4h、术后24h采集动脉血,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中TNF-α、IL-6、IL-10水平。结果 术前TNF-α、IL-6维持于较低水平,而IL-10未测得,在无肝期IL-6、IL-10明显上升（P〈0．05）,开放后3种细胞因子均显著增加（P〈0．05）,并于开放后60min达峰值,术后24h内TNF-α、IL-6迅速下降至略高于术前水平,IL-10在部分患者未测得。结论 肝移植术中由于缺血再灌注损伤及手术应激,机体产生明显的炎症及抗炎反应,以IL-6及IL-10的变化较为灵敏。     

烧伤大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞基因表达的影响

目的：观察烧伤大鼠血清对体外培养的大鼠骨髓问充质干细胞(MSCs)基因表达的影响。方法：分离Wistar大鼠骨髓,原代培养MSCs,传代后分别用含有体积分数为10％的正常大鼠血清(N组)和烧伤后3天大鼠血清(B组)的F-12培养基培养24h,然后以含有5705种基因的寡核苷酸微阵列检测两组细胞基因表达的差异。结果：两组MSCs对比,有4种基因表达存在明显差异。其中B组类固醇敏感基因-1(Ssg-1)表达减弱,而磷酸二羟基丙酮酰基转移酶(Gnpat)基因、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)基因和与骨形成蛋白-2可诱导激酶的序列有部分相同的一条EST表达增强。结论烧伤后大鼠血清刺激MSCs可使其基因表达发生改变,这种改变可能与MSCs受到刺激后参与创面修复有关。     

骨髓间充质干细胞对大鼠皮肤损伤促愈作用的研究

目的：研究骨髓间充质干细胞（MSCs)对大鼠皮肤损伤所发挥的促愈作用。从而为临床皮肤损伤修复提供新的种子细胞来源。方法：体外培养扩增雄性Wistar大鼠的骨髓MSCs，选择雌性Wistar大鼠30只制作皮肤损伤模型，并随机分为MSCs-胶原膜组（接种细胞胶原膜组，A组），单纯胶原膜组（B组）和自然愈合组（对照组，C组），每组10只。采用创面大体观察、组织学检查和透射电镜等方法观察创面愈合情况，并结合原位杂交方法判定创面愈合过程中是否存在植入细胞。结果：伤后7，14d,3组中任何两组之间创口收缩率比较，差异均有非常显著性意义（P＜0．01），其顺序为A组＞B组＞C组；组织学检查显示，A组肉芽组织含量明显多于B、C组；电镜检查显示，A组受损皮肤接近正常；原位杂交结果表明，移植后7，21，27d,A组均可检测到雌性Wistar大鼠受损皮肤真皮层有雄性大鼠sry基因的表达。结论：MSCs可对皮肤损伤发挥明显的促愈作用。     

鸢尾素对兔骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

 目的 探讨鸢尾素对兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化的影响及其信号机制。方法 分离、培养兔BMSCs,检测鸢尾素对BMSCs增殖的影响。BMSCs成脂诱导后,实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction,PCR)检测成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的转录表达,油红O染色检测细胞内脂质形成情况,Western blot检测Wnt10a信号蛋白的表达。结果 鸢尾素不影响BMSCs的增殖活性;显著下调PPARγ[成脂诱导第7天,(0.20±0.06)vs(1.00±0.10);成脂诱导第14天,(0.61±0.06)vs(1.00±0.15)]和C/EBPα[成脂诱导第7天,(0.40±0.06)vs(1.00±0.12);成脂诱导第14天,(0.70±0.09)vs(1.00±0.18)]的表达,明显抑制BMSCs成脂分化[(0.45±0.05)vs(0.95±0.10);P<0.05];同时,鸢尾素明显促进Wnt10a表达[(5.01±0.78)vs(1.00±0.25);P<0.05]。结论 鸢尾素可抑制BMSCs脂向分化,其作用与激活Wnt信号通路有关。     

间充质干细胞移植治疗小儿脑瘫疗效分析

目的观察及对比分析自体骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）和脐血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCBMSCs）移植治疗小儿脑瘫（cerebral palsy,CP）的临床疗效。方法 CP患儿60例,随机分入BMSCs移植组和UCBMSCs移植组,并接受术后6个月的随访,观察对比两组患儿术前与术后高级智能和肢体运动功能的变化。结果两组高级智能均有改善（包括：智力、语言、性情）,高级智能功能改善率差异无统计学意义（7.5%vs 6.7%,P〉0.05）。术后6个月运动功能两组较术前均有改善,BMSCs移植组在竖头（14.3%vs 2.7%）、身体居中性（7.7%vs 2.7%）、翻身（6.7%vs 0）、双上肢抓握等改善率均显著高于UCBMSCs移植组（P〈0.01）。结论 UCBMSCs和BM-SCs移植对高级智能功能均有改善;而BMSCs移植对CP患者活动功能改善显著优于UCBMSCs移植。     

骨髓间充质干细胞在肺损伤大鼠肺组织的分化

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞的可能性.方法 将SD大鼠MSCs用DAPI标记后注入受体大鼠体内.75只受体大鼠随机分为5组(n＝15):肺损伤组、MSCs治疗组、MSCs对照组、单个核细胞对照组和正常对照组.分别于MSCs、单个核细胞注入受体大鼠体内1、2、4周后观察肺组织结构变化,检测肺组织中植入细胞情况及广谱细胞角蛋白的表达水平.结果 MSCs治疗组大鼠肺组织在各时间点均有少量植入的细胞,并且部分植入的细胞表达广谱细胞角蛋白.MSCs植入后2周大鼠细支气管壁有少量植入的细胞同时表达广谱细胞角蛋白.其余各组未发现植入细胞的标记.结论 MSCs可在损伤的大鼠肺组织中分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞.     

骨髓间充质干细胞的免疫逃逸机制

间充质干细胞的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识。近来的研究表明间充质干细胞避免了在人和动物体内的异体移植排斥反应的发生,这一点在体外研究的共培养中也得到证实。其作用机制有：（1）间充质干细胞的低免疫原性;（2）这些干细胞通过间接调节树突细胞和直接破坏NK细胞阻止T细胞的反应;（3）减低了局部微环境中的免疫性。笔者现对间充质干细胞的免疫调节机制予以综述如下。     

BMP12转染骨髓间充质干细胞的瞬时表达

目的 以骨形态发生蛋白12(BMP12)基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化为肌腱细胞的可行性。方法 将携带有BMP12基因的质粒pEGFP-C1,采用电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果 转染后6h可见细胞内有GFP表达,12h后达高峰,持续约3天,其后有些细胞荧光开始减退。结论 BMP12基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓向间充质干细胞定向分化为肌腱细胞具有可行性。     

肿瘤干细胞及肿瘤发生与转移新进展

肿瘤干细胞（tumor stem cells,TSC）是肿瘤组织中具有自我更新、分化潜能的一组细胞。 TSC不仅在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用,而且与肿瘤的侵袭、转移、异质性以及化学治疗的耐药性密切相关,TSC的深入研究已经成为当前研究的热点。该文从TSC的形成、TSC与微环境的关系、TSC的微环境模型以及TSC的信号通路及调节因子等方面进行了综述。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。