胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。     

GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体的构建及Xba Ⅰ甲基化位点的应用

目的构建GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体并探讨XbaI甲基化位点在构建中的应用,为构建GM-CSF基因重组腺病毒及更方便地利用XbaⅠ多克隆位点打下基础。方法体外分离小鼠脾细胞,经ConA刺激,用含两种不同的XbaⅠ位点毗邻碱基的引物RT-PCR获取小鼠GM-CSF基因,经XbaⅠ及XbaⅠ双酶切后分别定向克隆入pAdTrack-CMV重组腺病毒穿梭载体中,比较两种重组载体酶切鉴定的效率并通过测序验证。结果成功逆转录得到小鼠GM-CSF基因并克隆入pAdTrack-CMV中,测序结果与预期一致。酶切鉴定显示由于XbaI位点毗邻碱基的不同导致甲基化的XbaⅠ位点在克隆菌株中不能被有效切开。结论成功构建GM-CSF基因重组腺病毒穿梭载体,XbaⅠ位点对甲基化敏感。     

弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达

目的：构建elafin基因高效表达重组腺病毒载体Ad-elafin。方法：抽提人肺总RNA进行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）扩增elafin基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上；在BJ5183细菌内与pAdEasy-1同源重组，筛选阳性克隆，酶切、PCR及测序鉴定；PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得腺病毒载体Ad-elafin；继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测elafin蛋白的表达，ELISA鉴定elafin蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用。结果：酶切、PCR、蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功。结论：成功构建了重组腺病毒载体Ad-elafin，为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。     

小鼠HAX-1基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的构建小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行系统性红斑狼疮模型BXSB小鼠的体内实验研究。方法用RT-PCR方法扩增小鼠全长Hax-1基因,经T／A克隆后,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasv-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度。RT-PCR鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后Hax-1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测。结果经酶切及测序证实Hax-1基因重组腺病毒载体构建成功。PCR检测转染后AD-293细胞内Hax-1基因水平的表达,且无野生型腺病毒的产生。结论成功构建了含小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体,为探讨Hax-1的生物学功能奠定了基础。     

人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 ,为进一步实现其在雪旺细胞中可调控的高效表达奠定了基础     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

成骨细胞特异性转录因子Cbfa1重组腺病毒的构建、纯化及表达

目的构建成骨细胞特异性转录因子Cbfa1重组腺病毒载体,以期用于骨缺损、脊柱融合的体内、外研究。方法以含有全长cDNA的pCMVβ/Cbfa1为模板,PCR扩增Cbfa1,T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293T细胞进行包装、扩增,利用报告基因GFP对病毒滴度和感染效率进行监测,CsCl梯度离心纯化病毒。AdEasy1／Cbfa1感染NIH3T3细胞后Western-blotting检测Chfa1蛋白的表达。结果测序、酶切及PCR证实Cbfa1基因重组腺病毒载体构建成功。AdEasy1／Cbfa1感染NIH3T3细胞后Western-blotting检测到Cbfa1蛋白的表达。结论成功构建了含有小鼠Cbfa1基因的重组腺病毒载体,为下一步研究基因治疗骨缺损、脊柱融合奠定基础。     

大鼠白细胞介素-6重组腺病毒构建及初步鉴定

目的构建携带大鼠白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)基因的重组腺病毒,为研究IL-6在神经损伤中的生物学作用提供技术手段。方法体外扩增大鼠IL-6基因,定向克隆到pAdTrace-TOX腺病毒穿梭质粒中,构建重组pAdTrace-IL-6过表达腺病毒质粒,并与骨架质粒pAd-Easy-1在BJ5183菌中发生同源重组,获得pAd-IL-6腺病毒载体,经PacⅠ酶切后转染HEK293细胞进行包装扩增。通过Ad-IL-6腺病毒感染PC12细胞,Real-time PCR和Western blot检测PC12细胞中IL-6及STAT3的表达。结果 PCR电泳及酶切、测序鉴定均证实目的基因IL-6正确克隆至腺病毒载体中,所构建的腺病毒Ad-IL-6可感染PC12细胞,有效增加IL-6的表达水平,促进IL-6信号通路中关键蛋白磷酸化STAT3的表达。结论成功构建携带IL-6的重组腺病毒载体,该载体可显著增高PC12细胞中IL-6基因和蛋白表达水平,并上调IL-6相关信号通路。     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.     

人血管内皮生长因子165基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165)的真核表达载体，并在大鼠骨髓基质细胞中进行表达。方法：利用基因克隆技术，将原核克隆载体pSP73中的目的基因VEGF165用BamHI和XhoI双酶切后，再克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组质粒pcDNA3.1-VEGF165。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，用重组质粒转染SD大鼠骨髓基质细胞，然后以G418筛选阳性克隆。用免疫细胞化学鉴定。结果：经酶切鉴定及基因测序证实，重组体中已插入目的基因片段VEGF165，免疫细胞化学证实，重组质粒转染的骨髓基质细胞中有VEGF165基因的表达。结论：成功地构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165。并在骨髓基质细胞中得到表达，为将表达VEGF基因的骨髓基质细胞作为骨组织工程的种子细胞的可能性提供了实验依据。     

人微小RNA-133a(miR-133a)重组腺病毒的构建和鉴定

目的: 构建人miR-133a重组腺病毒,研究其在人骨髓间充质干细胞(hMSCs)中的表达。方法: 从人基因组DNA中扩增包含miR-133a的PCR产物，并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV。将经pmeⅠ线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183，通过同源重组获得重组腺病毒质粒rAd-mir-133a。将rAd-mir-133a在人胚肾293细胞（HEK293）中包装并扩增出miR-133a的重组腺病毒。将重组腺病毒感染hMSCs，利用RT-PCR和实时定量PCR分别检测初级miR-133a和成熟miR-133a的表达。结果: 限制性内切酶分析和DNA测序结果显示，重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-miR-133a构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd-miR-133a。rAd-miR-133a感染的hMSCs中初级miR-133a转录子和成熟miR-133a表达显著增强。结论: 成功构建了人miR-133a 重组腺病毒，并在hMSCs中高效表达出miR-133a，为进行miR-133a的功能研究创造条件。     

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。     

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人LIGHT基因，构建其重组腺病毒载体，以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法 用RT-PCR法从人外周血单个核细胞（PBMC）中克隆人的LIGHT全长基因。将LIGHT cDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1，以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达。结果 用RT－PCR法从人的PBMC中，扩增出723bp的cDNA，测序证实为人LIGHT基因。荧光显微镜、PCR及Western blot证实，LIGHT重组腺病毒可感染293细胞，并在293细胞内进行有效的复制。结论 成功地克隆了人LIGHT基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件。     

携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备

目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.     

人p27^kip1基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人p27^kip1基因并构建其真核表达载体，为进一步研究其功能奠定基础。方法根据p27^kip1已知序列设计引物，分别在上下游引入Mlu I和Spe I酶切位点，从人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR得到cDNA，亚克隆入携带GFP报告基因的pWPXL真核载体中，经筛选获得正确的克隆，并通过双酶切凝胶电泳及测序鉴定。将成功构建的质粒在脂质体介导下转染肾癌786．0细胞，并通过RT—PCR及Western-blot检测表达情况。结果克隆了人p27^kip1基因，与GenBank中序列比对无误；真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，成功构建了真核表达载体。转染肾癌786-0细胞48h后，p27^kip1蛋白出现高表达。结论成功克隆了p27即基因，构建了其真核表达载体并在肾癌细胞中成功表达，为p27^kip1在肾肿瘤中的进一步研究提供了工作基础。     

负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1的构建及鉴定

目的构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1,使外源性VEGF120基因可以在真核细胞中表达。方法利用缺氧后大鼠脑组织,提取总RNA,采用RT-PCR技术,利用已知引物合成cDNA,将VEGF120基因扩增后插入真核细胞表达载体pCDNA 3.1。重组质粒热转化至感受态E.ColiJM109细胞中,获得重组菌株。提取质粒,进行酶切鉴定及插入基因进行测序。结果限制性内切酶酶鉴定及测序证实已将VEGF120cDNA成功插入真核细胞表达载体。结论成功构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA3.1,本实验研究为外源性VEGF基因导入真核细胞提供一种途径。     

GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

应用基因重组技术将大鼠 GDNF c DNA克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中 ,用限制性内切酶酶切分析重组质粒p L XSN-GDNF中 GDNF基因的插入方向 ,用 PCR、斑点杂交和 Southern杂交对重组质粒作进一步鉴定。结果表明 :GDNF c D-NA已正确地克隆到逆转录病毒载体 p L XSN中而构建成重组逆转录病毒载体 ,成功构建的真核细胞表达载体可作为基因治疗的高效基因转移载体。本研究为进一步开展 GDNF基因治疗 Parkinson' s disease和 Alzheimer' s disease等中枢神经系统疾病提供了资料。     

小鼠端粒酶蛋白亚单位真核表达载体的构建和序列测定

目的： 克隆小鼠端粒酶蛋白亚单位(mTERT)的cDNA，构建真核表达载体并进行序列测定。 方法: 从肝癌细胞中提取总RNA，采用RT-PCR 技术扩增mTERT的基因编码区序列，将序列定向克隆至真核表达载体pAC，并进行序列测定。 结果： 获得mTERT编码区 3 369 bp的cDNA片段，用PCR和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pAC-mTERT。通过对mTERT编码区cDNA序列测序证实其与GenBank中的已知序列一致。 结论： 成功克隆了mTERT编码区序列，并构建了其真核表达载体，为以TERT为基础的肿瘤生物治疗奠定基础。     

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达

目的:研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichia pastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法:采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,0.5%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA法对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Western blot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12 800。结论:成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。