基于生物信息学分析干性相关基因TCEAL7作为胃癌预后标志物的研究

目的：在胃癌（gastric cancer,GC）中寻找与基于 mRNA 表达水平的干性指数（mRNA expression-based stemness in- dex,mRNAsi）相关的基因,并探讨其功能。方法：通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库和GSE66229数据集进行生物信息学分析。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组织化学评估组织和细胞系中TCEAL7的表达。采用过表达TCEAL7的GC细胞研究TCEAL7对GC细胞增殖、迁移和侵袭能力以及干性特征的影响。结果：TCEAL7在GC中表达下调。 但TCEAL7的高表达与较差的预后相对应。过表达TCEAL7抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭能力,减弱成球能力并减少干细胞样CD44^high/CD24^high细胞的数量。包含临床特征和TCEAL7表达的列线图对于预测GC患者预后有很好的准确性和区分度。结论： TCEAL7被鉴定为在GC中与mRNAsi相关的预后因子,它降低了肿瘤细胞的恶性程度,并减弱了细胞的干性特征。     

细胞表面α2,6-唾液酸在肝癌细胞粘附中的作用及机制研究

【目的】 分析比较细胞表面不同连接方式的唾液酸在小鼠肝癌高淋巴道转移细胞株Hca-F和低淋巴道转移细胞株Hca-P中的表达,并研究差异性表达的α2,6-唾液酸在肝癌细胞淋巴结黏附行为中的作用及分子机制。 【方法】 利用免疫细胞化学、流式细胞技术,分析肝癌细胞表面不同连接方式的唾液酸在Hca-F和Hca-P中的表达差异;通过RNA干扰技术干预差异表达的唾液酸转移酶,并使用RT-PCR、蛋白质印迹及Lectin-blot方法检测其干扰效果;利用细胞黏附实验和凝集素阻断实验,检测干扰前后、阻断前后Hca-F细胞黏附能力的变化;利用FAK信号通路特异性抑制剂,探讨α2,6-唾液酸介导肝癌细胞黏附行为的分子机制。 【结果】 α2,6-唾液酸在小鼠肝癌高、低转移细胞株中表达具有显著差异,而α2,3-唾液酸的表达无显著差异;当通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中ST6Gal-I表达下调时,其细胞表面α2,6-唾液酸表达减少,削弱Hca-F细胞对淋巴结的黏附能力降低。此外,ST6Gal-I表达下调可抑制p-FAK及下游p-paxillin蛋白分子的表达。 【结论】 细胞表面α2,6-唾液酸可通过FAK信号转导通路正性介导肝癌细胞的黏附行为,为肝癌的治疗提供新的靶点。     

人过氧化物氧化还原酶-1在胃癌中的表达情况及其临床意义

目的 探讨人过氧化物氧化还原酶-1（PRDX1）在胃癌中的表达情况及其与胃癌临床病理特征和预后之间的关系。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测21例胃癌与相应癌旁组织中PRDX1 mRNA和蛋白的表达水平，并应用免疫组化法检测105例胃癌和癌旁组织中PRDX1蛋白的表达水平，以分析其表达情况与临床病理特征及预后的关系。结果 qRT-PCR和Western Blot检测发现，PRDX1在胃癌组织中的mRNA和蛋白的表达水平均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学检测结果表明，PRDX1蛋白水平在胃癌组织中高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。不同肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期间PRDX1蛋白表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，PRDX1蛋白的过表达与总生存时间及无病生存时间较短相关。COX多因素分析显示，PRDX1是胃癌独立的预后影响因子。结论 胃癌组织中PRDX1蛋白的表达明显升高，PRDX1蛋白高表达可能促进了胃癌的发生和发展，可能做为胃癌的早期诊断及预后评估的新型生物学指标。     

ISL-1表达水平对胃癌细胞化疗耐药性的影响及机制探究

【立论依据】 化疗是一种重要的胃癌辅助治疗方法,但由于不同患者对化疗药物的耐药性差异极大,而影响其治疗效果。哪些因素会导致胃癌细胞呈现不同的耐药性目前尚未阐明。最新的研究表明,自噬可以帮助细胞对抗微环境中的化疗药物,导致耐药。胰岛因子1(Islet-1,ISL1),在正常成体胃组织中不表达,但我们发现ISL1在人胃癌组织中呈中等丰度的表达,且不同胃癌细胞系表达量有明显差异,并对胃癌经典化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性亦不同。胃癌细胞中ISL1表达量的差异是否与化疗耐药性相关,目前国内外尚未见报道。我们还发现,5-FU处理下,ISL1表达丰度高的胃癌细胞,其自噬发生标志LC3的剪切也明显增加,那么ISL1是否通过增强肿瘤自噬能力来介导胃癌细胞的化疗耐药性?故本课题试图阐明胃癌细胞中ISL1表达量的差异可导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性,其分子机制与ISL1能够增强肿瘤自噬能力有关。 【设计思路】 (1)明确胃癌细胞中ISL1表达量的差异能否导致肿瘤细胞产生不同的化疗耐药性;(2)证实胃癌细胞中自噬与耐药性的关系;(3)探究ISL1与自噬之间的相关性,阐明ISL1促进肿瘤耐药性的机制是通过促进自噬来实现的。 【实验内容】 (1)CCK-8实验和蛋白质印迹实验分别检测ISL1表达量不同的两株胃癌细胞系对5-FU的耐药性差异和自噬强度;(2)过表达/敲低ISL1,检测两种细胞对5-FU的耐药性变化和自噬强度;(3)在过表达或敲低ISL1基础上抑制或增强自噬,检测两株胃癌细胞系在5-FU处理下的自噬强度和各自耐药性的改变。 【材料】 人胃癌细胞系MGC803、MKN28;5-FU;CCK-8试剂盒;过表达或抑制ISL1的质粒;雷帕霉素;3-甲基腺嘌呤;各蛋白抗体。 【可行性】 本实验所涉及的转录因子ISL1为本实验室主要研究对象,因此,本实验在理论指导、材料准备上都有很大的可行性。 【创新性】 自噬与肿瘤耐药之间的关系尚无定论;自噬在胃癌细胞耐药性中的作用也未见报道。因此,本实验属理论创新,且具有应用价值,对肿瘤治疗乃至药物靶点设计方面都有一定意义。     

siRNA靶向抑制ATDC蛋白对胃癌细胞生物学行为的影响

目的通过比较ataxia—telangiectasiagroupDcomplementinggene（ATDC）在永生化胃黏膜细胞GES与胃癌细胞系MNK45、AGS中的表达差异,探讨其对胃癌细胞生长、增殖及侵袭能力的影响。方法应用Westernblot实验检测ATDC在胃癌细胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜细胞系GES表达差异,利用慢病毒携带的siRNA下调ATDC在MKN45细胞表达水平,采用MTT实验检测细胞生长能力、流式细胞术检测细胞周期、平板克隆实验检测细胞克隆形成能力以及transwell实验检测细胞侵袭能力。结果ATDC在人胃癌细胞系MKN45与AGS细胞中的表达水平均明显高于永生化胃黏膜细胞GES（均P〈0．05）;转染siRNA慢病毒后,与Con—MKN45及MKN45比较,Si—MKN45细胞的表达水平明显下降（P〈0．05）：下调ATDC表达后MKN45细胞的生长能力明显受到抑制（P〈0．05）,S期细胞明显减少、增殖指数克隆形成率及侵袭能力均明显降低（均P〈005）。结论慢病毒携带的siRNA下调ATDC表达后能够抑制胃癌细胞MKN45的生长、增殖与侵袭能力,可为胃癌的基因治疗提供新的靶点。     

miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达及对胃癌生物学行为的影响

目的:探讨miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达情况及对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:应用实时荧光定量PCR法分析31例胃癌组织和癌旁组织样本以及人胃癌细胞系SGC-7901、MKN45、人正常胃黏膜上皮细胞系GES1中miRNA-101的表达水平;建立miRNA-101重组腺病毒载体感染胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,对照组为感染阴性对照病毒的胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,MTT法检测miRNA-101对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室法检测胃癌细胞的迁移和侵袭能力.结果:胃癌组织中miR-101表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01);miR-101在细胞系SGC-7901和MKN45中的表达量明显低于人正常胃黏膜上皮细胞系GES1(P<0.01).孵育48 h后MKN45细胞miRNA-101组的细胞增殖能力低于其对照组(P<0.05);而孵育72 h后SGC-7901细胞和MKN45细胞的miRNA-101组细胞增殖能力均亦低于相应对照组(P<0.05).迁移试验结果显示,miRNA-101组迁移的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数明显低于相应对照组(P<0.01);侵袭实验结果显示,miRNA-101组侵袭的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数亦明显低于其对照组(P<0.01).结论:miRNA-101在胃癌组织和胃癌细胞系中表达下调,转染miRNA-101可明显降低SGC-7901和MKN45细胞的增殖、迁移、侵袭能力,miRNA-101可能参与了胃癌疾病的发生及发展.     

JAM-A表达与肺腺癌侵袭转移的关系及机制

【立论依据】 JAM-A是上皮细胞紧密连接结构的重要成分,在紧密连接装配、白细胞迁移、血小板活化和血管生成等细胞过程中发挥重要作用,参与调节炎症反应,并与细胞极性和渗透性的调节有关。目前发现JAM-A参与肿瘤的进展过程,其过量表达可能与患者的不良预后有关。但JAM-A在肿瘤进展中的功能尚存争议,JAM-A在肺腺癌中侵袭和转移中作用及机制尚未阐明。 【设计思路】 本实验在组织、细胞和动物三个层面探究肺癌中JAM-A蛋白在肺腺癌侵袭、转移和预后中的作用,证实JAM-A过表达促进肺腺癌进展。 【实验内容】 (1)组织实验:量子点免疫荧光检测200例肺腺癌组织JAM-A表达,观察JAM-A表达情况与临床病理因素及预后的关系。(2)细胞实验:培养人肺腺癌细胞A549和人正常肺上皮细胞BEAS-2B,①用siRNA分别转染细胞系使JAM-A基因沉默;②质粒转染细胞系建立JAM-A基因高表达的模型;③对两个系列的肺腺癌细胞和正常肺上皮细胞均用共聚焦显微镜、蛋白质印迹法和直接测定TER观察细胞紧密连接结构变化,Transwell小室方法检测细胞侵袭和迁移能力,MTT法检测细胞增殖能力。(3)动物实验:建立JAM-A(-)裸鼠和正常同种裸鼠构建肺腺癌荷瘤模型,检测肿瘤细胞JAM-A的表达情况并比较两组肿瘤的生物学特征。 【材料】 肺腺癌组织,肺腺癌细胞系,JAM-A(-)裸鼠,JAM-A抗体,质粒转染试剂盒,量子点试剂盒等。 【可行性】 前期工作已明确JAM-A在肺腺癌中表达与一些临床病理参数相关。指导教师课题组一直从事肿瘤侵袭转移机制研究并取得一定成绩,本组成员有较扎实的基础理论知识以及较熟练的实验操作技能。 【创新性】 (1)探讨肺腺癌组织中JAM-A表达与临床病理参数及预后的关系。(2)证实JAM-A过表达与肺腺癌的侵袭转移有关,并探究其机制。     

胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类分子表达降低的机制研究

目的：探讨胃癌细胞系MKN中HLA—Ⅰ类抗原表达水平异常的分子机制。方法：以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照，利用流式细胞仪检测细胞表面HLA—Ⅰ类复合物的表达情况，Western blot检测HLA—Ⅰ类分子重链及轻链表达情况，半定量RT—PCR检测HLA—Ⅰ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况，并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性。结果：胃癌细胞系MKN表面HLA—Ⅰ类复合物表达降低，重链A及B／C位点蛋白无表达而轻链表达无异常。在mRNA水平，胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。微卫星DNA扩增结果初步显示，MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失。结论：胃癌细胞系MKN HLA—Ⅰ类分子复合物表达降低可能是由HLA-Ⅰ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的。     

救心胶囊对损伤内皮细胞黏附因子表达的影响

[目的]观察救心胶囊通过抑制损伤内皮细胞黏附因子的表达,保护内皮细胞功能。[方法]通过建立缺氧及低密度脂蛋白(LDL)损伤内皮细胞模型,并以两种不同的给药方式:无菌中药提取液和载药血清,运用免疫细胞化学的方法检测黏附分子的表达。[结果]内皮细胞损伤后黏附分子表达明显增加,救心胶囊显著降低其表达。[结论]救心胶囊保护内皮细胞,使其免受炎症介质损伤,从而延缓冠心病(CHD)的发生发展。     

荧光素酶基因标记乳腺癌细胞系鉴定

目的 利用三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞,对稳定表达荧光素酶的细胞系MDA-MB-231-Luc进行功能评价及鉴定.方法 构建荧光素酶的HIV慢病毒载体,体外感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达的细胞系,采用MTT法,利用Transwell侵袭模型,应用伤口愈合细胞划痕实验评价细胞增殖、侵袭和转移能力.结果 利用慢病毒转染的MDA-MB-231细胞能稳定表达荧光素酶,与亲本细胞相比,细胞的增殖、侵袭、迁移能力无显著影响(P>0.05).结论 慢病毒感染乳腺癌细胞能稳定表达荧光素酶,对MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭、转移能力无明显影响,为后续的小动物活体成像实验提供细胞模型.