胰岛素受体底物在宫内发育迟缓大鼠肝脏组织中的表达

目的 研究胰岛素受体底物1( IRS-1)和胰岛素受体底物2(IRS-2)在宫内发育迟缓(IUGR)大鼠出生0周、3周和8周时肝脏组织中的表达,探讨IUGR个体易患代谢综合征(MS)的分子机制.方法 采用母孕期低蛋白饮食法建立IUGR大鼠模型,应用反转录( RT)-PCR技术检测仔鼠在出生0周、3周、8周肝脏组织中IRS-1、IRS-2 mRNA水平,凝胶电泳条带用成像系统照相定量分析结果,分别计算PCR产物条带与β-actin条带吸光度值的比值,作为目的基因相对表达量.采用Western blot杂交检测仔鼠在出生0周、3周、8周肝脏组织IRS-1蛋白、IRS-2蛋白的水平表达.母孕期得到正常饮食的仔鼠作为对照组.结果 IUGR鼠出生时体质量显著低于对照组,出生后出现生长追赶,至8周时IUGR组体质量超过对照组;IUGR组0周、3周、8周时其肝脏组织IRS-2 mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组(Pa＜0.05,0.01),肝脏组织IRS-1 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(Pa＞0.05).结论 IUGR大鼠0周、3周和8周肝脏组织中IRS-2 mRNA和蛋白水平显著下降,可能是IUGR个体易患MS的分子机制之一.     

胰岛素受体底物在宫内发育迟缓大鼠胰腺组织中的表达

目的：研究胰岛素受体底物1（IRS-1）和胰岛素受体底物2(IRS-2)在宫内发育迟缓（IUGR）大鼠生后0周、3周和8周胰腺组织中的表达,探讨IUGR个体易患代谢综合征的分子机制。方法：采用母孕期低蛋白饮食法建立IUGR大鼠模型,应用RT-PCR技术检测子鼠在生后0周、3周、8周胰腺组织中IRS-1和IRS-2 mRNA水平。采用Western 杂交检测 IRS-1和IRS-2蛋白的表达。母孕期得到正常饮食的子鼠作为对照组。结果：IUGR 组0周、3周、8周胰腺组织IRS-2 mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.05）,IRS-1 mRNA 和蛋白表达水平与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：IUGR子鼠生后0周、3周和8周胰腺组织中IRS-2 mRNA和蛋白水平显著下降,可能是 IUGR 个体易患代谢综合征的分子机制之一。［中国当代儿科杂志,2010,12(12)：972-975］     

宫内生长受限大鼠肝脏糖异生酶的表达增加与胰岛素抵抗

目的：宫内生长受限（IUGR)和成年胰岛素抵抗密切相关,但其发生机制不清楚,该研究通过检测IUGR子鼠肝脏中糖异生关键酶及可促进糖异生的转录因子的表达,探讨IUGR个体发生胰岛素抵抗的分子机制。方法：通过孕期全程蛋白质营养不良方法建立大鼠IUGR模型,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测IUGR子鼠幼年和成年肝脏中PGC-1α mRNA和蛋白表达变化,同时检测磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖6-磷酸酶（G6-P酶）的mRNA表达变化。结果：①IUGR组子鼠平均出生体重4.97±0.83 g明显低于正常对照组6.54±0.52 g （P<0.01）,4周时IUGR组平均体重达到对照组平均水平,8周时IUGR组体重为152.03±13.57 g超过正常对照组的136.05±12.24 g （P<0.05）;②IUGR子鼠幼年（3周）空腹血糖和胰岛素水平与对照组没有差异,成年（8周）后IUGR子鼠出现高胰岛素血症(P<0.01),胰岛素抵抗指数（IRI）增高（P<0.05）;③与对照组相比,IUGR组3周和8周龄子鼠肝脏PGC-1α mRNA和蛋白表达明显增高（P<0.05）;同时肝脏PEPCK和G6 P酶的mRNA水平也明显高于对照组(P<0.01)。结论：IUGR鼠自幼年至成年肝脏中糖异生的关键调控因子PGC-1α的mRNA和蛋白表达增加,诱导糖异生关键酶的表达,可能增加肝脏糖异生,促进胰岛素抵抗发生。     

Lipin基因表达与宫内发育迟缓大鼠肝脏脂肪含量的相关性研究

目的 探讨宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation,IUGR）大鼠肝脏Lipin2基因和内脏脂肪组织Lipin1基因的表达与肝脏脂肪含量的相关性。 方法 使用母孕期低蛋白（10%蛋白）饮食法喂养孕鼠制造IUGR仔鼠模型,对照组孕鼠在孕期使用正常蛋白饲料喂养（蛋白含量21%）。分别在两组仔鼠生后1 d、1周、3周、8周和12周时称体重并留取仔鼠的肝脏组织,在生后3周、8周和12周留取两组仔鼠的内脏脂肪组织。采用3.0T氢质子磁共振波谱法检测两组大鼠生后3周、8周、12周时肝脏脂肪含量;采用Real-time PCR法检测两组大鼠各时间点肝脏组织Lipin2、内脏脂肪组织Lipin1基因的mRNA表达水平;采用Western blot法检测两组大鼠肝脏组织Lipin2、内脏脂肪组织Lipin1蛋白表达水平。采用Pearson相关分析Lipin mRNA及其蛋白表达与肝脏脂肪含量的相关性。 结果 生后3周、8周、12周时,IUGR组仔鼠内脏脂肪组织Lipin1 mRNA及其蛋白表达水平均高于对照组（P<0.05）。生后1 d时IUGR组肝脏组织Lipin2 mRNA及其蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）,而生后1周、3周、8周、12周时Lipin2 mRNA及其蛋白表达水平均高于对照组（P<0.05）。生后3周时IUGR仔鼠和对照组肝脏脂肪含量比较差异无统计意义（P>0.05）,生后8周、12周时IUGR组仔鼠肝脏脂肪含量显著高于对照组（P<0.05）。Lipin1蛋白和mRNA表达与肝脏脂肪含量呈正相关（分别r=0.628、0.521,P<0.05）,Lipin2蛋白和mRNA表达与脂肪含量呈正相关（分别r=0.601、0.524,P<0.05）。 结论 IUGR大鼠内脏脂肪组织Lipin1和肝脏组织Lipin2 mRNA及其蛋白表达上调可引起肝脏脂肪含量增加,可能与导致IUGR大鼠成年期肥胖有关。     

胰岛素受体底物在宫内发育迟缓新生鼠肌肉组织中的表达

目的探讨胰岛素受体底物(IRS-1I、RS-2)基因在宫内发育迟缓(IUGR)新生鼠心肌、骨骼肌(股四头肌)中的表达及意义。方法采用母孕期饥饿法建立IUGR新生鼠模型,正常新生鼠作对照,应用RT-PCR技术检测心肌、股四头肌组织IRS-1I、RS-2mRNA水平,凝胶电泳条带用成像系统照相定量分析结果,分别计算PCR产物条带与-βactin条带光密度值的比值,作为目的基因相对表达量。结果IUGR鼠出生时体质量、身长显著小于对照组(P均<0.01)。IUGR新生鼠心肌IRS-1 mRNA相对表达水平显著高于对照组(t=2.568 P=0.022),股四头肌IRS-1 mRNA相对表达水平、心肌IRS-2 mRNA相对表达水平显著低于对照组(t=2.868 P=0.012;t=2.358 P=0.035),股四头肌IRS-2 mRNA相对表达水平与对照组相比无显著差异(t=1.426 P=0.177)。结论IUGR对心肌、骨骼肌IRS-1基因表达的影响具有组织选择性,心肌IRS-1基因表达上调是适应宫内营养不良环境的结果;骨骼肌IRS-1基因表达下降,并可能“程序化”,可能是IUGR易患代谢综合征的分子机制之一。     

细胞信号转导抑制因子在宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞中的表达及意义

目的 研究宫内发育迟缓(IUGR)大鼠骨骼肌细胞中细胞信号转导抑制因子(SOCS)及胰岛素信号通路重要分子胰岛素受体底物.1(IRS.1)的表达变化.探讨其在IUGR大鼠成年后胰岛素抵抗发生中的机制及意义.方法 用孕期限制饮食法建立大鼠IUGR模型,原代培养大鼠骨骼肌细胞,采用Real time PCR和Western blot检测0周和12周龄IUGR子鼠骨骼肌细胞中SOCS.1、SOCS.3及IRS.1的mRNA和蛋白表达.采用SPSS 17.0软件进行统计学分析.结果 与对照组相比,0周和12周龄IUGR组子鼠中骨骼肌细胞中SOCS.1、SOCS.3的mRNA和蛋白表达水平均增加(Pa＜0.05),而IRS.1的mRNA和蛋白表达水平均下降(Pa＜0.05).IRS.1 mRNA与SOCS.1 mRNA、SOCS.3 mRNA表达水平均呈负相关(r=-0.832、-0.789,Pa<0.01).结论 IUGR大鼠子代骨骼肌细胞SOCS.1、SOCS.3表达增加,通过负性调节使得IRS.1表达降低,可能是骨骼肌胰岛素抵抗和成年代谢综合征发生的机制之一,提示SOCS.1和SOCS.3可以作为2型糖尿病和其他胰岛素抵抗的治疗靶点.     

PTEN基因在宫内发育迟缓大鼠肝脏胰岛素敏感性变化中的作用

目的 通过检测PTEN基因在宫内发育迟缓(IUGR)大鼠肝脏中的表达,探讨PTEN基因在IUGR致胰岛素抵抗(IR)中的意义.方法 通过孕期低蛋白饮食法建立大鼠IUGR模型,检测90d雄性IUGR大鼠胰岛素敏感性,采用反转录(RT)-PCR技术检测90 d IUGR组及对照组仔鼠肝脏PTEN基因mRNA表达水平,Western blot检测肝脏组织中丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)蛋白及磷酸化AKT蛋白表达水平.采用SPSS 13.0软件进行统计学处理.结果 与对照组比较,IUGR雄性仔鼠平均出生体质量显著降低(t=14.73,P＜0.05),空腹血糖显著升高(t=-3.11,P=0.011),空腹胰岛素显著升高(t=-5.01,P=0.001),胰岛素抵抗指数显著升高(t=-3.06,P=0.013),胰岛素敏感指数显著降低(t=2.80,P=0.019),PTEN基因mRNA表达显著升高(t=-2.40,P =0.04),AKT蛋白表达虽然无统计学差异,但磷酸化AKT蛋白表达显著下降(t=3.02,P=0.01),PTEN与胰岛素抵抗指数呈正相关(r=0.928,P ＜0.05),与磷酸化AKT的表达呈负相关(r=-0.411,P＜0.05).结论 PTEN可能是IUGR致IR的重要调节分子之一.     

左旋精氨酸对低出生体重仔鼠PI3K和PKB的影响

目的：生命早期应用左旋精氨酸（L-Arg）干预低出生体重仔鼠,检测其肝脏磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B(PKB)的表达,探讨L-Arg对改善胰岛素抵抗的影响。方法：以孕期低蛋白饮食法建立低出生体重仔鼠模型,18只孕鼠随机分为对照组、模型组和干预组,每组6只。对照组孕期给予21%正常蛋白饲料建立正常出生体重仔鼠模型,模型组及干预组孕期给予10%低蛋白饲料建立低出生体重仔鼠模型,3组孕鼠所生仔鼠分别纳入仔鼠对照组、模型组、干预组。生后21 d 仔鼠的哺乳期内,3组孕鼠均给予21%正常蛋白饲料喂养,对照组及模型组给予正常饮用水喂养,干预组给予富含L-Arg（200 mg/kg.d）的饮用水喂养。断乳后,3组仔鼠均给予21%正常蛋白饲料及正常饮用水喂养。于仔鼠生后1 周、3 周、8 周时,分别留取3组仔鼠的肝脏标本,用Western blot法检测肝脏PI3K和PKB的蛋白表达。结果：1 周时干预组仔鼠肝脏PI3K的蛋白表达高于模型组（P=0.045）,且与正常组相比差异无统计学意义（P=0.503）。8 周时干预组仔鼠肝脏PKB蛋白表达明显高于模型组（P=0.039）,且与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：生命早期补充L-Arg可促进蛋白质的合成,增加肝脏PI3K及PKB的蛋白表达,促进胰岛素信号传导,改善胰岛素抵抗。     

宫内生长受限大鼠肝脏磷酸肌醇-3-激酶信号通路分子的变化

目的：研究宫内生长受限(IUGR) 成年子鼠肝脏中受体后胰岛素信号传导通路分子的表达变化,探讨IUGR个体发生2型糖尿病的分子机制。方法：通过低蛋白饮食法建立大鼠IUGR模型,采用Western blot检测雄性子鼠（8周）基础状态下肝脏中胰岛素受体底物（IRS）2、磷酸肌醇-3-激酶（PI-3K）、糖原合成酶激酶（GSK）3β的蛋白表达水平,以及胰岛素刺激后蛋白激酶B（PKB）的磷酸化水平变化。结果：基础状态下,IUGR成年子鼠肝脏IRS-2的蛋白表达与正常对照差异无显著性,PI-3K的催化亚单位p110的蛋白表达比对照组明显降低;而GSK-3β蛋白含量比对照组明显增加,差异均有显著性（P<0.01）。基础状态和胰岛素刺激状态下,IUGR组肝脏PKB和磷酸化的PKB-Ser473表达水平都明显低于对照组（P<0.01）,胰岛素刺激后,对照组肝脏磷酸化的PKB-Ser473表达明显增加,是基础状态的182%（P<0.01）,而IUGR组肝脏磷酸化的PKB-Ser473的增加幅度较小,仅是基础状态的123%（P<0.05）。结论：宫内蛋白营养不良造成的IUGR鼠机体胰岛素抵抗的发生可能与肝脏中PI-3K和其下游靶蛋白PKB的表达和活性降低,以及GSK-3β的表达增高有关。［中国当代儿科杂志,2009,11（3）：221-224］     

宫内蛋白营养不良对成年仔鼠肝脏糖皮质激素受体基因启动子甲基化的影响

目的 研究妊娠期蛋白营养不良对宫内生长受限(IUGR)仔鼠肝脏中DNA甲基转移酶1(DNMT1)的水平及糖皮质激素受体(GR)基因启动子甲基化水平和表达的影响.方法 采用妊娠期限制蛋白饮食法建立IUGR模型,IUGR组和正常对照组各取8只成年雄性仔鼠(8周)分离肝脏,采用甲基化敏感限制性内切酶结合荧光定量反转录PCR法检测其肝组织GR基因的启动子甲基化水平,实时荧光定量PCR法检测其肝脏中GR 和DNMT1的mRNA表达,蛋白印迹实验进一步测定其肝脏DNMT1的蛋白水平变化.结果 8周龄IUGR组仔鼠肝脏中GR基因启动子的甲基化水平较同龄正常对照组低28.4%(P＜0.01),定量PCR结果显示IUGR组肝脏中GR mRNA水平较正常对照组高83.0%(P＜0.05).同时,IUGR组仔鼠肝脏中DNMT1 mRNA水平较正常对照组低32.8%(P＜0.05),相关分析证实DNMT1的mRNA水平与GR启动子的甲基化水平呈正相关(P＜0.05).Western blot结果进一步证实IUGR组肝脏中DNMT1蛋白表达水平较正常对照组减低(P＜0.05).结论 宫内营养不良的仔鼠肝脏中DNMT1表达降低,可能引起GR基因启动子的甲基化水平降低,诱导GR蛋白表达.这种持续存在的表观遗传学改变可能与其成年2型糖尿病的发生密切相关.     

宫内生长迟缓大鼠脂肪组织肿瘤坏死因子αmRNA表达与胰岛素抵抗关系的研究

目的探讨内脏脂肪组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达与宫内生长迟缓(IUGR)大鼠成年后胰岛素抵抗(IR)发生的关系,以及生后早期不同的营养模式的远期影响.方法用母鼠全程饥饿法建立IUGR动物模型.32只IUGR新生雌鼠随机分为4组IUGR模型组(S/N组)给予常规饮食,IUGR高热能饮食组(A组),IUGR高蛋白高热能饮食组(B组),IUGR高蛋白质等热能饮食组(C组).各组幼鼠在3周哺乳期间母鼠分别摄取上述饲料.第4周起各组幼鼠断乳后全部改为自由进食常规饮食至实验结束.另以正常母鼠所生正常新生雌鼠8只为正常对照组(C/N组)生后给予常规饮食喂养至实验结束.各组大鼠在48周(中老年期)时分别测定体重、肾周脂肪重量、脂肪组织TNF-αmRNA表达,计算ISI(胰岛素敏感指数)并分析其与TNF-αmRNA表达量及肾周脂重、脂重/体重的相关性.结果IUGR模型组及IUGRA、B组胰岛素敏感性下降,并且脂肪组织TNF-αmRNA表达及肾周脂重、脂重/体重显著高于正常对照组(P<0.05或0.01);IUGR的C组胰岛素敏感性及TNF-αmRNA表达量、脂重/体重与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05).脂肪组织TNF-αmRNA水平与肾周脂肪重量、脂重/体重量呈正相关,与ISI呈负相关.脂重/体重与ISI呈负相关.结论IUGR大鼠成年后发生胰岛素抵抗可能经由中心性肥胖的途径,与腹脂增多、脂肪细胞过度表达TNF-α有关,脂源性TNF-α可能是IUGR胰岛素抵抗的重要协病因素.高蛋白的早期营养模式可能通过实现IUGR个体的骨骼肌的生长追赶而非脂肪追赶避免了中心性肥胖和胰岛素抵抗的发生,是较合理的早期营养饮食模式.     

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯对宫内生长受限大鼠肝脏脂代谢的影响和机制

目的 探讨表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）对宫内生长受限（IUGR）大鼠肝脏脂代谢的影响和机制。方法 采用母鼠孕期全程限食法建立IUGR大鼠模型,随机分为IUGR组和EGCG组,EGCG组大鼠在离乳后用含EGCG的饮用水喂养至10周,同时设立正常对照组,每组8只。13周龄时,测量各组大鼠体重后,采集大鼠血液及肝脏组织标本,检测各组大鼠血清空腹总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）、血糖（FPG）、胰岛素（FINS）和肝脏脂质水平,计算稳态模型评估胰岛素抵抗（HOMA-IR）和脂肪组织胰岛素抵抗（adipo-IR）,观察肝脏组织病理切片,并采用实时荧光定量PCR法检测肝脏相关基因的相对表达水平。结果 13周龄时,各组大鼠体重比较差异无统计学意义（P=0.067）。各组间的FPG、FFA、FINS、HOMA-IR和adipo-IR水平比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。各组间的血清TC和TG水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）,但在肝脏中IUGR组TC和TG水平均明显高于EGCG组（P < 0.05）。油红染色结果提示,IUGR大鼠的肝脏脂肪储积明显增加,而EGCG能够改善该现象。PCR结果显示,与对照组相比,IUGR组的Ampk mRNA及Adipor1 mRNA表达水平降低,Srebf1 mRNA表达水平增加（P < 0.05）,EGCG能逆转IUGR大鼠Ampk mRNA及Srebf1 mRNA的表达水平,且与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 早期EGCG干预可能通过Ampk/Srebf1通路下调脂肪酸的从头合成,并通过改善肝细胞的胰岛素抵抗,从而降低IUGR大鼠的肝脏脂肪积累。     

幼年大鼠溺水应激后胰岛素信号传导变化及外源胰岛素治疗反应

目的 探讨溺水应激大鼠的胰岛素信号转导变化及外源胰岛素治疗反应.方法 采用溺水的方法建立应激性高血糖动物模型,32只幼年大鼠随机分为对照组、溺水窒息组、空气复苏组、空气复苏联合胰岛素治疗组.空气复苏联合胰岛素治疗组在复苏时注射胰岛素.在溺水并复苏过程中测定大鼠血糖、胰岛素、骨骼肌胰岛素受体底物1(IRS-1)及其丝氨酸磷酸化水平,检测骨骼肌内外膜的葡萄糖转运体4(GLUT4)蛋白含量.结果 溺水组胰岛素抵抗指数升高,产生严重的胰岛素抵抗,IRS-1含量无显著改变;空气复苏组与空气复苏联合胰岛素治疗组的IRS-1丝氨酸磷酸化水平(分别为0.56±0.13、0.46±0.08)均低于溺水窒息组(0.71±0.12),差异有显著性(P＜0.05);外膜的GLUT4蛋白含量(分别为1.82±0.11、1.96±0.28)显著高于溺水窒息组(1.45±0.15),尤以空气复苏联合胰岛素治疗组的变化更为显著.结论 在溺水窒息导致的应激性高血糖过程中,IRS-1丝氨酸磷酸化、GLUT4表达异常是胰岛素抵抗的重要调控点之一.胰岛素能改善IRS-1丝氨酸磷酸化及GLUT4内外膜分布,达到降低血糖的作用.     

生长追赶宫内发育迟缓大鼠肝细胞细胞因子信号转导抑制因子3表达与胰岛素抵抗的发生机制

目的研究生长追赶宫内发育迟缓(CG-IUGR)大鼠肝细胞中细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)以及胰岛素信号转导途径中关键分子胰岛素受体底物1(IRS1)和胰岛素受体底物2(IRS2)的表达变化,探讨CG-IUGR大鼠发生胰岛素抵抗的机制。方法采用孕期全程限食及缩减每产子鼠数量的方法建立CG-IUGR大鼠模型。正常摄食孕鼠所产子鼠设为正常对照组(AGA组)。运用改良原位两步非循环灌流法分离并培养原代大鼠肝细胞;用实时定量PCR和Western blot法检测胰岛素抵抗CG-IUGR大鼠肝细胞于基础状态和胰岛素刺激状态下SOCS3、IRS1和IRS2分子mRNA和蛋白水平表达变化。结果 CG-IUGR大鼠肝细胞在基础状态和胰岛素刺激状态下,SOCS3 mRNA和蛋白水平表达量均较AGA组高(Pa<0.05),IRS1 mRNA和蛋白水平表达量均较AGA组低(Pa<0.05),而IRS2 mRNA和蛋白水平表达量与AGA组比较均无统计学差异(Pa>0.05)。结论 CG-IUGR大鼠肝细胞中SOCS3表达量增加,并通过负性调节下调IRS1表达,这可能是CG-IUGR大鼠发生以胰岛素抵抗为核心的疾病分子机制之一。