人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

用点突变PCR方法去除人IL－2cDNA表达克隆终止密码及其鉴定

在重组人ＩＬ－２（ｈＩＬ－２）大肠杆菌高效表达的基础上，为了构建ｈＩＬ－２与别的目的蛋白的嵌合分子，我们利用点突变ＰＣＲ方法去除ＩＬ－２ｃＤＮＡ表达克隆的终止密码，并构建成ｈＩＬ－２嵌合重组蛋白表达克隆，在大肠杆菌中表达的ＩＬ－２嵌合重组蛋白具有天然ＩＬ－２分子的生物活性。本文结果表明点突变ＰＣＲ去除ｃＤＮＡ终止密码的方法效率高、快速、简便。     

白细胞介素－12 mRNA在移植物中的变化

应用反转多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）及萤光标记ＤＮＡ探针技术检测ＩＬ－１２ｍＲＮＡ在纯系小鼠心移植物及宿主脾脏中的变化。结果表明：①移植的心脏在移植后（７．０±０．７）ｄ被排斥。②ＩＬ－１２ｍＲＮＡ在正常Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ－２￣ｄ）小鼠心脏中为阴性，在正常Ｃ＿３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ－２￣ｋ）小鼠脾脏中为弱阳性。③移植后第５ｄ，移植于Ｃ＿３Ｈ／ＨｅＪ的Ｂａｌｂ／ｃ心脏中和宿主Ｃ＿３Ｈ／ＨｅＪ的脾脏中ＩＬ－１２ｍＲＮＡ呈强阳性。提示ＩＬ－１２在排斥反应中起重要作用。     

人白细胞介素－6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ＰＵＣ１８质粒中，经转化、筛选、酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体；经序列分析证实为编码人ＩＬ－６受体的ｃＤＮＡ片段。     

人IL—4重组逆转录病毒载体的构建及在人肿瘤细胞中的表达

利用多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法，从ＰＣＤ－ｈＩＬ－４质粒中扩增得到人白细胞介素４（ｈＩＬ－４）的ｃＤＮＡ－。ＤＮＡ序列测定证实此片段包含完整的ＩＬ－４开放阅读框架。应用ＤＮＡ重组技术，将此ｃＤＮＡ重组于逆转录病毒载休ＬＸＳＮ。用脂质体转染法将此重组质粒导入病毒包装细胞ＰＡ３１７。得到滴度为２．５ｘ１０ＣＦＵ／ｍｌ的感染性病毒。病毒感染人白血病细胞株ＨＬ－６０、Ｋ５６２及Ｂｕｒｋｉｔ淋巴瘤细胞株Ｒａｊｉ，使之表达并分泌ＩＬ－４。逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法证实ｈＩＬ－４ｃＵＮＡ可在上述肿瘤细胞中持续转录。ＥＬＩＳＡ怯证实病肿瘤细胞分辨ＩＬ一４水平可高达３００Ｐ／１０细胞．２４小时。本研究为进一步探讨转ＩＬ一４基因用于血液系统恶性肿瘤免疫治疗的价值提供了基础。     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

人白细胞介素－9cDNA的PCR扩增及其在大肠杆菌的表达

利用ＰＣＲ技术从人外周血Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出人ＩＬ－９的ｃＤＮＡ，将其连入大肠杆菌表达载体后，可在大肠杆菌高效表达出人重组ＩＬ－９融合蛋白，表达量占菌体蛋白的２５％左右，有明显的刺激正常人骨髓细胞集落形成的活性。     

用点突变PCR方法去除人IL—2 cDNA表达克隆终止密码及其鉴定

在重组人ＩＬ－２（ｈＩＬ－２）大肠杆菌高效表达的基础上，为了构建ｈＩＬ－２与别的目的蛋白的嵌合分子，我们利用点突变ＰＣＲ方法去除ＩＬ－２ ｃＤＮＡ表达克隆的终止密码，并构建成ｈＩＬ－２嵌合重组蛋白表达克隆，在大肠杆菌中表达的ＩＬ－２嵌合重组蛋白具有天然ＩＬ－２分子的生物活性，本文结果表明点突变ＰＣＲ去除ｃＤＮＡ终止密码的方法效率高，快速。简便。     

重组人单链白细胞介素12融合基因（rhscIL—12）的构建和真？…

目的 克隆人ＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）ｐ４０和ｐ３５亚单位ｃＤＮＡ，构建人单链ＩＬ－２（ｒｈｓｃＩＬ－２）融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经ＰＤＢｕ刺激的ＥＢＶ转化的人Ｂ淋巴细胞株ＮＣ３７中提取ｍＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ，运用重组ＰＣＲ技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列进行体外基因重组，构建ｒｈｓｃＩ     

用尿嘧啶－DNA－糖基化酶控制聚合酶链反应的产物污染

聚合酶链反应（ＰＣＲ）灵敏度极高，痕量的ＰＣＲ产物能污染新的ＰＣＲ体系（称为产物污染）导致假阳性结果，我们通过在所有的ＰＣＲ扩增中掺入ｄＵＴＰ使ＰＣＲ产物含“ｄＵ”，在以后的ＰＣＲ扩增前用尿嘧啶－ＤＮＡ糖基化酶（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ－Ｇｌｙｃｏｌａｓｅ，ＵＤＧ）处理，然后加热去除ＵＤＧ活性防止了产物污染。ＵＤＧ切割磷酸糖骨架上的尿嘧啶，可阴止ＤＮＡ聚合酶对它的复制，而对普通ＤＮＡ（即含”ｄＴ”）无影响。因为ＵＤＧ不与ｄＵＴＰ反应，而且在ＰＣＲ扩增前加热变性失活，使含尿嘧啶的污染物的污染得到很好控制。     

人IL—3cDNA探针制备及应用

采用多聚酶连反应（ＰＣＲ）扩增人ＩＬ—３ｃＤＮＡ片段,以地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ—１１—ｄＵＴＰ）为标记物,随机引物法标记ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针。探针经斑点杂交和核酸原位杂交证明：用制备ＩＬ—３ｃＤＮＡ探针检测细胞ＩＬ－－３ｍＲＮＡ表达具有特异性强,灵敏度高,使用简便,杂交结果直观,探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。     

逆转录病毒介导癌基因疗法体外安全实验

从逆转录病毒ｐＬＸＳＮ与人ＩＬ－２ｃＤＮＡ基因进行重组，包括ＰＡ３１７细胞，建立逆转录病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ－２ＳＮ。用病毒上清液转导人淋巴细胞（ＴＩＬ，ＰＢＬ）和３株人腺癌细胞株（ＳＰＣ－Ａ１，ＭＫＮ－ＨｅｐＧ２）对转ＩＬ－２基因的淋巴细胞（ＴＩＬ／ＩＬ－２，ＰＢＬ／ＩＬ－２）和转ＩＬ－２基因的人癌细胞（ＳＰＣ－Ａ２／ＩＬ－２，ＭＫＮ－４５／ＩＬ－２，ＨｅｐＧ２／ＩＬ２）进行体外安     

幽门螺杆菌感染者胃粘膜中白介素—8mRNA的竞争RT—PCR检测

目的：从分子水平探讨幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｒｏｌｉ，ＨＰ）感染对细胞因子ＩＬ－８ｍＲＮＡ表达的影响，说明竞争ＲＴ－ＰＣＲ法是定量细胞因子的精确方法。方法：３５例幽门螺杆菌感染患者，抗菌治疗前后分别取胃窦部活检粘膜２块，经逆转录反应合成ｃＤＮＡ，经竞争ＲＴ－ＰＣＲ法测定ＩＬ－８ｍＲＮＡ表达量，按配对ｔ检验处理数据。结果：根除成功者２８例，粘膜中ＩＬ－８ｍＲＮＡ的表达量显著下降（Ｐ＜０．０１），而根除失败者７例，粘膜中ＩＬ－８ｍＲＮＡ表达量无明显变化（Ｐ＞０．０５）。结论：ＨＰ感染可诱导粘膜中产生过量的细胞因子ＩＬ－８，竞争ＲＴ－ＰＣＲ法是定量细胞因子的精确方法。     

白细胞介素－2的基因克隆及其在啤酒酵母细胞中的表达

用ＰＣＲ方法从白细胞介素素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ全序列中扩增成熟肽基因片段，与酵母中间载体ｐＳＫ４３ＳＢ融合后，重组于酵母游离型表达载体ＹＥｐＨｃ８，获得了高效表达，并对其糖基化进行了研究。     

检测人IL—15基因表达的RT—PCR方法的建立

本文依据ＣｅｎＢａｎｋ人ＩＬ－５的ｃＤＮＡ序列，设计３个特民性引物，建立了检测ＩＬ－１５基因表达的逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法。用二次扩增和模板倍比稀释法，证明本方法特异，敏感，简单，初步检测了部分已报道的组织细胞，结果和文献报道的Ｎｏｒｔｈｅｍ印迹杂交的结果一致，说明用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＩＬ－１５ｍＲＮＡ表达是可行的，这为进一步研究ＩＬ－１５在人体不同组织中的表达及评价其意义奠定了基础。     

人白细胞介素—2cDNA导入对卵巢癌耐药细胞株耐药性的逆转

为了构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并探讨白细胞介素－２（ＩＬ＿２）ｃＤＮＡ导入对顺铂诱民的卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响。我们采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段，构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒。导入顺铂诱导的人卵巢癌耐药细胞株，观察其耐药性的改变。结果成功构建了ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并在Ｃｏｓ－７细胞高效表达，导入卵巢癌耐药细胞后其对顺铂的敏感性显著升高。说明转导ｐｃ     

应用PCR技术检测淋巴结病理切片中的IgCDR－Ⅲ基因重排

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术检测Ｂ细胞－非何杰金淋马巴瘤（Ｂ－ＮＨＬ）的单克隆性ＩｇＣＤＲ－Ⅲ基因重排，ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后为１００～１２０ｂｐ的特异性ＤＮＡ区带。检测石蜡病理切片标本中非何杰金淋巴瘤（ＮＨＬ）１７／２３例、反应性增生２／５例发现单克隆性ＩｇＣＤＲ－Ⅲ基因重排；反应性增生３／５例及淋巴结转移癌４例未见单克隆性ＩｇＤＲ－Ⅲ基因重排。     

人白细胞介素—6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术座人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ｐＵＣ１８质粒中，经转化，筛选，酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体。     

pBV—IL—6重组质粒构建及其在E.coli中的高效表达

目的 构建人ＩＬ－６重组质粒（ｒｈＩＬ－６），并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。方法 经计算机分析设计，人工合成３条寡核苷酸引物，通过定点诱变并优化起始区，应用ＰＣＲ扩增及重组ＤＮＡ技术，构建重组质粒ｐＢＶ－ＩＬ－６，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌ＤＨ５α中诱导表达，对产物进行纯化和复性，ＭＴＴ法检测生物活性。结果 获得２种ｒｈＩＬ－６高效表达的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＢＶ－ＩＬ－６工程菌，一种表达２０     

人白细胞介素18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

获得ＩＬ－１８全长ｃＤＮＡ序列，研究ＩＬ－１８在大直菌中的表达。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ方法人人外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素的ｃＤＮＡ，以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测序。