基因治疗在整形外科中的应用

基因治疗是一种全新的技术，近年来发展非常迅速，随着基因工程基础研究的不断深入，基因操作及DNA重组技术的成熟，基因治疗已经大量应用于医学各领域的研究，部分已应用于临床治疗。1990年Blease等进行了首例临床基因治疗，他利用反转录病毒将腺苷脱氨酶基因(ADA)传染人自身T淋巴     

RASSF1A基因在肝癌中表达失活的研究

最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因片段的丢失，DNA序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与DNA序列中CpG岛（CpG island）中胞嘧啶（C）碱基环上发生的甲基化（^mCpG）有极其重要的相关性。RASSF1A基因（RAS association domain family 1 Agene）这一由Dammann等发现并命名的基因，在原发性肝癌中的表达情况则未有报道。     

腺病毒－BMP7载体的包装与纯化

腺病毒(Adeno)基因组为线状双链DNA,长度大约36kb,适合于容纳较大片段外源基因。与逆转录病毒载体相比,腺病毒载体能有效地将外源基因转染到各种靶细胞中。其宿主范围广,感染性强,尤其能感染分化后的非分裂期细胞。在Adeno生活周期中,其基因不整合到宿主细胞DNA中,故无插入突变激活癌基因的危险,外源基因能游离地表达。商品化的腺病毒载体一般剔除了其基因组的E1区,经体外重组后,产生可复制缺陷型腺病毒。再经过293细胞的包装过程,得到具有感染能力的腺病毒用以转染靶细胞。2002年,我室构建了腺病毒-BMP7(简称AV-BMP7)表达载体,用于组织工程化骨的修复实验,取得实效。现将该病毒包装、纯化技术分述如下。     

基因工程化小鼠模型在胃肠道肿瘤研究中的应用

基因敲除技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础．对特定基因位点进行修饰的实验方法,是揭示基因功能最直接的手段之一。小鼠和人的基因相似性达95％。小鼠培育简单、价格便宜、繁殖能力强、生命周期短,适用于疾病发生发展的全过程观察。利用基因操作技术改造小鼠基因便可产生模拟人类基因变异导致的表型效应．可为人类疾病模型的复制及疾病防治研究提供一种有效的实验手段。随着基因操作技术的不断开发与改进．基因工程化小鼠模型在胃癌研究中将扮演更加重要的角色。本文系统介绍了基因工程小鼠模型在胃肠道肿瘤研究中的应用。     

生物信息学(4):基因诊断与治疗

基因诊断 一、基因诊断的定义 基因诊断又称DNA诊断或分子诊断．被医学界称为第四代诊断技术，是生物学和医学研究中一个最前沿和最基本的问题之一．其利用重组DNA技术作为工具，直接从基因水平检测致病微生物的存在和种类、人类遗传病的基因缺陷等．并进一步从转录或翻译水平分析基因的功能。从而成为临床诊断领域中病原体检查、遗传病诊断、癌基因和抑癌基因检测的重要手段。1978年。美国科学家首次采用羊水细胞对胎儿进行血红蛋白病的产前基因诊断获得了成功．从此开创了疾病基因诊断的新纪元。     

癌胚抗原与B-7.1双表达基因疫苗的构建及表达

基因疫苗是把外源基因连接到真核表达质粒载体上，将重组的质粒DNA注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体免疫系统引发免疫反应。DNA疫苗制备简便、安全长效、可组建多价疫苗并兼有预防和治疗作用。癌胚抗原(CEA)有一定的抗原性，可作为诱导肿瘤免疫的有效靶抗原。B7．1分子可促进多种抗原诱导的免疫反应。我们选择编码人全长CEA和B7．1的cDNA构建共表达质粒载体，并检测其在体内、外的表达，为增强CEA基因疫苗的免疫效果进行研究。     

外源质粒DNA对小鼠肝脏基因表达谱的影响

研究了外源质粒DNA经胃肠道吸收可能对肝脏产生的作用机制。给Balb／c小鼠灌胃质粒pcDNA3 200μg，在灌胃后4h分离肝脏，提取肝脏的总RNA。利用寡核苷酸芯片对灌胃质粒pcDNA3后的Balb／c小鼠肝脏进行基因表达谱研究。结果发现17664个基因中，表达上调100条，表达下调41条。按基因功能分类，表达上调的基因可分为免疫应答基因、转录因子基因、信号转导基因、转运相关基因及代谢相关基因等；表达下调的基因主要为脂质代谢基因。灌胃外源质粒DNA后，肝脏组织主要表现为急性时相反应的加强、免疫反应的活化、细胞信号通路的活化以及脂质代谢途径的抑制。表明外源质粒DNA通过胃肠道途径可广泛调控肝脏的基因表达。     

基因敲除技术在睾丸功能研究中的应用

基因敲除(gene knock-out)是基因打靶的一种方法,是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术.通过DNA分子的同源重组,特异性地在基因组的某个位点引入预定的突变,进而获得基因型发生了改变的基因打靶小鼠,以研究目的基因的体内功能或相关疾病的致病机制.     

腺瘤性息肉病基因DNA甲基化在食管癌患者肿瘤组织及血浆中的表达

目的 探讨食管鳞癌患者肿瘤组织及外周血游离DNA中腺瘤性息肉病（APC）基因甲基化状态与临床病理特征的关系．以及外周血APC甲基化围手术期的动态变化。方法应用实时定量MSP技术检测76例食管鳞癌患者肿瘤组织、配对的癌旁正常组织以及术前1d、术中及术后7d外周血游离DNA中APC基因的甲基化状态。选取60名年龄性别配对的健康志愿者外周血浆DNA作对照。结果食管鳞癌患者肿瘤组织及外周血游离DNA中APC基因甲基化率分别44．74％（34／76）和42．11％（32／76）,明显高于癌旁组织及健康对照组[（6．58％（5／76）和1．67％（1／60）,均P=0．000]。APC基因甲基化率在外周血与肿瘤组织中具有良好的一致性,其ROC曲线Youden指数为0．849（P=0．000）。APC基因甲基化分别与患者病理分期、淋巴结转移、浸润深度及神经脉管浸润有关（P〈0．05）：家族肿瘤史是与外周血游离DNA中APC甲基化有关的独立因素（P〈0．05）。术前、术中、术后血浆中DNA甲基化发生率呈现先升后降的变化趋势。结论食管鳞癌患者外周血游离DNA中APC甲基化率可反映肿瘤进展状态．并随肿瘤实体的摘除而下降。     

C-myc基因扩增、p16基因变异和乙型肝炎病毒DNA整合与肝细胞癌的相关性研究

目的 探讨C－myc基因扩增、p16基因变异和乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合与肝细胞癌（HCC）的相关性。方法 应用差异聚合酶链反应（d-PCR)分析C－myc基因扩增,用聚合酶链反应（PCR）和单链构象多态（SSCP）分析p16基因变异,用PCR法检测整合型HBV－DNA。结论 （1）HCC组外周血、癌和癌旁肝组织中C－myc基因扩增阳性率分别为48％（14／29）、45％（13／29）和52％（15／29）,3者间差异无显著意义（x^2＝0．0008,P＞0．05,自由度ν＝2）,但明显高于肝硬化（LC）组外周血和LC组织阳性率[0(0/12)和8％（1／12）,P均小于0．05]。（2）29例癌组织中有3例p16基因纯合性缺失,未发现点突变。（3）正常肝、肝硬化和肝癌组织中整合型HBV－DNA阳性率分别为14／5（2／14）、67％（8／12）和97％（28／29）,3者间差异有显著意义（x^2＝29．4345,P＜0．01）。结论（1）HCC的发生与C－myc基因扩增密切相关;（2）HCC中p16基因的纯合性缺失发生频率为10％;（3）HBV－DNA整合与HCC的发生密切相关;（4）对外周血的检测能反映肝细胞（C－myc基因扩增和HBV－DNA整合情况。     

DNA损伤修复基因多态性与食管癌的研究进展

DNA损伤修复基因在DNA损伤修复、防止细胞突变中起重要作用。DNA损伤修复基因多态性与肿瘤的关系是近来研究的热点。本文就DNA损伤修复基因多态性与食管癌的关系进行综述。     

精子发生的基因调控

在精子发生的整个过程中,基因的表达和调控都起着至关重要的作用。在有丝分裂阶段的精原细胞中有405个基因表达;精母细胞中无DNA复制,DNA修复至关重要,许多基因参与这个过程中的基因重组与DNA修复,有442个基因高表达于精母细胞;在减数分裂后的精子细胞中有175个基因表达[1]。本文对调控精子发生的常见基因作一综述。一、正常精子发生过程由精原干细胞经过一系列发育阶段发展成为精子的过程称为精子发生。哺乳动物的精子发生可分为3个阶段:①精原细胞经过数次有丝分裂,增殖分化为初级精母细胞;②初级精母细胞经过减数分裂(中间经过短暂的…     

生物信息学(4):基因诊断与治疗

1．病毒介导的基因转移系统：病毒型载体是利用病毒对组织细胞的天然亲和力将遗传物质引入宿主细胞。用于基因治疗的病毒载体应具备以下3个基本条件：携带外源基因并能包装成病毒颗粒；介导外源基因的转移和表达；对机体不致病。然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需对其进行改造后才能用于人体。病毒载体大体上可分为两种类型：①重组型病毒载体：是以完整的病毒基因组为改造对象．其原理是选择性删除病毒的某些必需基因尤其是早期基因，或控制表达，缺失的功能由互补细胞反式提供。利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入病毒基因组的非必需区．不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件。②无病毒基因的病毒载体：这类载体系统往往由载体质粒和辅助系统组成；重组载体质粒南外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成，辅助系统由病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件组成。在辅助系统的作用下，重组载体质粒以特定形式被包装到病毒壳粒中．其中不含有任何病毒基因。实际上，无病毒基因的病毒载体可以看作是重组病毒载体的一种极端减毒的形式。     

DNA损伤修复基因多态性与食管癌的研究进展

DNA损伤修复基因在DNA损伤修复、防止细胞突变中起重要作用。DNA损伤修复基因多态性与肿瘤的关系是近来研究的热点。本文就DNA损伤修复基因多态性与食管癌的关系进行综述。     

白细胞介素2基因工程人大肠癌细胞瘤苗的建立及鉴定

目的 建立高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗，并完成相关的实验室鉴定。方法 采用重组逆转录病毒将人白细胞介素2基因转导至三株人大肠癌细胞，G418筛选并挑选单克隆，ELISA检测各单克隆24h白细胞介素2表达量，用Student Newman Keuls检验三株细胞白细胞介素2的表达差异，PCR、Southern blot检测白细胞介素2基因整合，RT-PCR、Northern blot检测白细胞介素2基因转录水平。结果 获得72株G418抗性单克隆，其中表达量最高者为COL0205达138.01ng/L×10^7/24h，统计显示COLO205与SW1116、HT-29组间相比差异有统计学意义（P〈0.05），白细胞介素2基因整合至细胞基因组中，未发生重组或部分缺失，且获得成功表达。结论 本研究成功建立了高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗。     

人瘦素蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的构建人瘦素因子（Leptin）的原核表达质粒pGEX-4T-3-LEP，并诱导该基因在原核细胞中大量表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和DNA重组技术，从人皮肤成纤维细胞内将编码人Leptin的cDNA序列克隆至原核表达载体pGEX-4T-3上，选取阳性克隆扩增后，提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用SDS-PAGE和蛋白质印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。结果克隆出的Leptin基因的cDNA由469bp组成，包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分，含有Letinp基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3在DH5a细菌体内能够表达，并且随着诱导时间的延长，Leptin基因的表达量增加，重组Leptin蛋白主要存在于包涵体中。结论Leptin基因可以在原核细胞中获得表达，为深入研究该蛋白在创伤愈合中的具体作用奠定了基础。     

DNA错配修复基因与膀胱肿瘤

DNA错配修复(MMR)通过纠正复制或重组过程中出现的错配碱基、诱导DNA严重受损的细胞发生凋亡,使细胞基因组的稳定性提高近1000倍。人类MMR蛋白在进化过程中是高度保守的,在链特异性错配修复和错配修复依赖性凋亡信号传导起始过程中发挥重要作用;MMR编码基因的失活可导致基因组的不稳定,特别是在一些简单的核甘酸重复序列,并导致一些肿瘤的发生。本文综述近年MMR系统在基因及分子生物方面以及在膀胱肿瘤中的研究进展。     

转基因技术综述

近年来,对于细胞内基因组成的认识已经有了很大的进步,这主要归功于基因实验技术的改进。此技术有两个重要特征:(1)确定相对小的DNA片段在宿主细胞的复制;(2)超越自然种系障碍,将基因从一个生物体转移到另一个非相关宿主细胞的能力。外源性DNA成功地插入媒介体即为DNA嵌合体,此结构是重组体DNA研究的基础,被命名为“分子克隆”。克隆一段外源性DNA要求:(1)必须分离、纯化和切取媒介体DNA;(2)外源性DNA插入开放的媒介体DNA以产生人工重组体;(3)DNA被连接和闭合;(4)能有效检测基因连接的方法;(5)此人工重组体能导入宿主细胞。将外源DNA导入哺乳动物细胞已有较好的方法,如通过化学和物理方法,后病毒媒介体研究有了较大发展,使得基因转移和表达率较高。这些方法包括:(1)磷酸钙转移法,是最常用的一种方法,尤其在确定细胞癌基因和细胞基因的数量上,不足之处是常常     

生物信息学(5):药物设计与生物信息学

生物信息学、基因组学、蛋白质组学与药物设计 基因药物是直接以DNA或RNA为靶标的药物或以DNA或RNA自身作为药物。1993年美国政府以立法的形式准许开展基因治疗．基因药物的研究将是未来新药研究的热点。目前已有3类基因药物用于临床试验：①“反义”寡核苷酸：可抑制基因的转录或阻止mRNA翻译产生蛋白质；②肽核酸：可与基因的启动因子结合从而调节基因转录；③多氨基化合物：可阻断基因产物的生成。DNA疫苗是以DNA或RNA自身作为药物的基因药物。近年来已成为基因药物研究的热点。如对导致腺鼠疫的耶森菌400多万个碱基对的测序后，通过生物信息学分辨各个基因的作用，在此基础上。计划研制新型腺鼠疫DNA疫苗。随着人类基因组计划和生物信息学的发展，将会涌现更多的基因药物。