汉坦病毒核蛋白及其单抗标记物在建立ELISA试剂中的应用

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂。[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记，在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺-过氧化氢（TMB／H2O2）酶底物系统，从血清中检测肾综合征出廊热早期特异性IgM抗体，并与免疫荧光抗体法（IFA）进行比较。[结论]检测42份可疑HFRS病人血清，ELISA法和IFA法均阳性的20份，均阴性的19份；ELISA法阴性、IFA法阳性的1份，ELISA法阳性、IFA法阴性的2份，2种方法的差异无统计学意义（配对x^2=0．08，P〉0．05）。[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂可用于HFRS的早期IgM抗体检测。     

HTNV重组核蛋白及其单抗建立HFRS-MacELISA试剂研究

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂.[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记,在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺一过氧化氢(TMB/H2O2)酶底物系统,从血清中检测肾综合征出血热早期特异性IgM抗体,并与免疫荧光抗体法(IFA)进行比较.[结果]检测用经典免疫荧光抗体法确认的42份阳性血清和42份阴性血清,结果2种试剂检测结果差异无统计学意义.[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgN捕获ELISA诊断试剂可用于肾综合征出血热的早期IgM抗体检测.     

IgM捕捉ELISA检测肾综合征出血热试剂盒研制

目的 开发可靠、稳定、方便的肾综合征出血热诊断试剂。方法羊抗人μ链抗体包被聚苯乙烯酶标板，纯化抗汉坦病毒核蛋白单克隆抗体，并用辣根过氧化物酶标记后与纯化的汉坦病毒汉滩型（HTNV）核蛋白抗原一起使用作示踪剂，结合四甲基联苯胺-过氧化氢（TMB／H2O2）酶底物系统，制成检测肾综合征出血热早期特异性IgM抗体捕捉ELISA试剂盒。结果与间接ELISA试剂同步检测46份出血热病人血清和46份正常人血清进行对比，2种试剂检测结果完全相符，特异性、稳定性和重现性好。结论重组抗原IgM捕捉ELISA检测试剂盒敏感、可靠，方便基层医院和门诊使用，可用于肾综合征出血热的早期诊断及监测。     

汉坦病毒核蛋白原核表达纯化及其单抗制备

目的制备稳定、特异的汉坦病毒核蛋白重组抗原和单克隆抗体.方法构建汉坦病毒（HTNV）-76118株核蛋白原核表达载体（pBV）220-S1.3和（pET）28a-S1.3,大肠埃希菌诱导表达.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western-blot分析显示,在48kD附近有目的蛋白表达,且有较好的抗原活性.用纯化的包涵体抗原免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经镍合氨基三乙酸（Ni-NAT）亲和纯化的核蛋白包被酶标板,进行ELISA筛选阳性克隆株,并建立细胞系,选2株高效分泌抗核蛋白单克隆抗体（McAb）的阳性杂交瘤细胞,常规制备腹水,进行单抗鉴定.结果成功构建了重组核蛋白原核表达载体pBV220-S1.3和pET28a-S1.3,获得了高纯度重组核蛋白（rNP）及其高效价单克隆抗体2E6和4D8.结论重组核蛋白抗原及其单克隆抗体在流行性出血热的监测、诊断和科研中有重要价值.     

汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用

目的从国内生产肾综合征出血热（HFRS）疫苗Z10株中克隆汉坦病毒核蛋白基因,应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达,制成抗原片,用于检测血清中汉坦病毒抗体.方法从汉坦病毒Z10株感染细胞上清液中提取病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增S基因,与穿梭质粒连接并转化大肠杆菌,得到重组穿梭质粒.将其转化含杆状病毒基因组的大肠杆菌,筛选出含S基因的重组杆状病毒DNA的大肠杆菌,提取重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞,应用ELISA法及间接免疫荧光法检测重组蛋白的抗原性.结果用RT-PCR方法扩增得到S基因,筛选出的重组杆状病毒感染细胞sf9,制成抗原片.此抗原片仅与HFRS阳性患者血清起反应,而与正常人及其它发热患者血清不起反应.检测浙江省各医院送检的97份疑似肾综合征出血热患者血清及36份正常人血清,与传统的抗原片比较,阳性符合率为100%.结论可以应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达汉坦病毒重组蛋白.以此制备的抗原片,可用于患者血清中汉坦病毒抗体检测,具有特异性强、敏感性高,试剂制备简单、安全,为诊断肾综合征出血热提供新的途径和手段.     

双抗原夹心法ELISA在肾综合征出血热诊断中的应用

目的建立一种敏感、特异的检测肾综合征出血热(HFRS)血清总抗体的双抗原夹心法ELISA。方法应用重组汉坦病毒(HV)NP抗原e1.3S作为包被抗原和e6-119-HRP作为酶标抗原建立双抗原夹心法ELISA,检测血清总抗体,并与间接免疫荧光法(IFA)相比较。结果共检测188份人血清和378份鼠血清标本,2种方法的总符合率为97.70%。以IFA为参照标准,双抗原夹心法ELISA的敏感性为97.54%,特异性为97.87%。结论双抗原夹心法ELISA检测HFRS血清总抗体具有很高的敏感性和特异性,适用于大规模的流行病学调查。     

肾综合征出血热抗体快速诊断试剂盒的应用研究

[目的]评估所研制的肾综合征出血热(HFRS)抗体快速诊断试剂盒在临床诊断和血清流行病学调查中应用的可行性.[方法]在6个不同疫区省份应用HFRS快速诊断试剂盒(胶体金法)检测患者血清中IgM和IgG抗体.在福建省抽选有代表性的18个县市作为调查地区,用双抗原夹心ELISA法检测鼠血清中抗汉坦病毒(HV)抗体,分析鼠间HFRS流行情况.[结果]此试剂盒可同时检测HFRS患者血清中IgM和IgG抗体,已通过国内6省的临床应用评价.以间接免疫荧光试验(IFA)及ELISA为参照标准,其敏感性为98.1%,特异性为97.9%,总符合率为98.0%;福建省HFRS疫区主要以家鼠型为主,主要分布在闽北及东南沿海地区.[结论]HFRS抗体快速诊断试剂盒提供了早期快速检测的新方法,已成为商品化并向全国推广.双抗原夹心法ELISA可用于监测鼠间带病毒状况和人间疫情动态,为控制HFRS的流行提供依据.     

汉坦病毒重组蛋白检测血清中特异性IgA抗体动态变化的研究

目的探讨重组蛋白检测血清中特异性IgA抗体的动态变化及其诊断价值。方法用杆状病毒表达的汉坦病毒重组核蛋白(rNP)和糖蛋白(rGP)为抗原,检测14例61份急性期SEO型病人系列血清中的特异性IgA抗体,寻找肾综合征出血热(HFRS)病人IgA抗体的动态变化规律。结果几乎所有HFRS病人早期即有强烈的IgA应答,尤其是针对rNP的抗体出现早且滴度高,抗rGP出现亦早,但滴度偏低。结论应用rNP和rGP为抗原,在发病早期检测IgA抗体,具有较好的特异性诊断价值,特别是对HFRS早期临床表现不典型的病例。     

湖北地区HFRS患者血清与欧洲汉坦病毒重组核抗原的反应性研究

目的 用欧洲汉坦病毒流行株制备重组核抗原,检测湖北地区HFRS患者血清中汉坦病毒特异性抗体,观察流行于不同地区汉坦病毒的相关性.方法 收集湖北地区34例HFRS患者急性/恢复期血清,以ELISA法检测血清标本对欧洲汉坦病毒重组核抗原(rNP)的反应性.结果 多不拉伐病毒(DOBV)-rNP对IgA抗体检出率最高,汉滩病毒(HTNV)-rNP对IgG抗体检出率最高,两者对IgM抗体检出率的差异无统计学意义;普马拉病毒(PUUV)-rNP对各种抗体检出率均低,但有3例患者急性期和恢复期标本对3种PUUV-rNP均有很强反应性.定量分析结果发现,IgM抗体水平急性期较高,IgA抗体水平急性期、恢复期均较高;IgA、IgG抗体水平恢复期均显著升高.结论 DOBV-rNP对湖北地区HFRS患者血清检出率高,IgA抗体水平在急性期和恢复期均较高,对疾病的监测具有重要意义;湖北地区可能存在PUU型和DOB型汉坦病毒流行.     

曲霉抗原双抗体夹心ELISA法特异性检测

目的 用2组曲霉单克隆抗体(mAbs)建立特异性识别不同种类曲霉抗原的检测方法.方法 采用天然烟曲霉抗原免疫,获得广谱针对曲霉抗原的单克隆抗体;采用重组烟曲霉抗原获得特异性针对烟曲霉抗原的单克隆抗体,用间接免疫荧光鉴定,并分别建立2种双抗体夹心ELISA法,对19种常见的环境和临床分离曲霉株、马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液进行检测.结果 间接免疫荧光显示,用天然烟曲霉抗原免疫获得的单克隆抗体(mAbs-1)可广谱识别多种曲霉分离株,而重组烟曲霉抗原获得的单克降抗体(mAbS-2)仅能特异性结合临床和环境分离的烟曲霉抗原.用mAbs-1建立的双抗体夹心ELISA法可检测19种常见曲霉株培养液;用特异性针对烟曲霉抗原单克降抗体(mAbs-2)建立的双抗体夹心ELISA法可特异性检测临床和环境分离株烟曲霉培养液;与其他曲霉株无交叉反应;2种双抗体夹心ELISA法与马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液均无交叉反应.结论 2种曲霉单克降抗体双抗体夹心ELISA法,除可广谱检测环境和临床分离曲霉株,还可以区分烟曲霉与其他曲霉,可作为监测环境、农产品、食品中的曲霉污染和早期诊断曲霉病的新技术手段.     

汉坦病毒N蛋白的重组表达及其用于IgM直接捕捉ELISA的建立和应用

目的克隆并表达汉坦病毒（HV）Z10株（HV—Z10）N蛋白（NP）编码基因，建立基于辣根过氧化酶（HRP）标记重组NP（rNP）的rNP—IgM直接捕捉ELISA，检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清并评价其检测效果。方法PCR扩增HV—Z10株NP编码基因，基因工程方法构建NP编码基因原核表达系统pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3。SDS-PAGE了解rNP表达情况，离子交换法和Ni—NTA亲和层析法提纯rNP。Western blot检测rNP的特异性免疫反应性。建立HRP标记rNP—IgM直接捕捉ELISA检测HFRS患者血清样品，并与常规HV—IgM间接捕捉ELISA进行比较。结果pET28a—Z10N—E．coli BL21DE3高效表达rNP。提纯rNPSDS-PAGE显示单一蛋白条带，HV-IgG能有效识别rNP并与之结合。94．73％（90／95）HFRS患者血清样品rNP—IgM直接捕捉ELISA检测结果阳性，HV—IgM间接捕捉ELISA阳性率为92．63％（88／95）。两种IgM捕捉ELISAs检测的HFRS患者血清样品A450值分布及对多份不同稀释度血清检测的A450，均值变化均相似。结论成功构建了HV—Z10株NP编码基因高效原核表达系统。所建立的rNP—IgM直接捕捉ELISA可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

肾综合征出血热IMMS-ELISA检测方法建立

目的建立一种用于检测肾综合征出血热(HFRS)特异性抗体IgG的ELISA方法—免疫磁性微球(IMMS)ELISA。方法利用重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a-L99S诱导表达SEO型汉坦病毒(HV)重组核蛋白(rNP),并进行镍亲和层析纯化,以纯化rNP为抗原,分别建立检测HFRS特异性抗体IgG的3种ELISA法:间接ELISA、捕获ELISA和IMMS-ELISA,并进行方法学比较。结果新建立的3种ELISA的检测灵敏度和特异度为≥90%,总符合率≥95%。其中间接ELISA的灵敏度达100%,而假阳性率为10%;捕获ELISA特异度达100%,灵敏度较低(92.5%),且假阴性率为7.5%;IMMS-ELISA的灵敏度和特异度均达到100%。结论 IMMS-ELISA较其他2种ELISA检测方法更为简单、安全和准确,易于在基层公共卫生和临床医疗机构推广使用。     

三种不同原理的间接酶联免疫吸附试验方法在严重急性呼吸道综合征诊断中的比较研究

目的比较不同原理的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法在严重急性呼吸道综合征(Severeacuterespirato-rysyndrome,SARS)诊断中的应用,以便研制开发更先进的诊断试剂,应对可能发生的SARS再次流行。方法对山西省疾病预防控制中心(CDC)送检的正常成年人血清标本44份,首都医科大学附属宣武医院住院SARS患者血清标本62份,宁夏回族自治区CDC送检SARS患者及疑似患者血清28份,分别采用三种不同原理的间接ELISA试剂进行抗体检测:①美国CDC采用全病毒灭活抗原包被,检测血清IgA、IgM、IgG抗体的试剂;②国内某公司采用全病毒灭活抗原包被,检测血清IgG及IgM抗体试剂;③基因工程表达并纯化刺突蛋白(spikeprotein,S蛋白)和核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein,N蛋白)抗原包被,检测血清中IgM及IgG抗体的试剂。结果通过比较研究显示:试剂①与试剂③的特异性较高,3种试剂的敏感性有较高的一致性。结论由于全病毒裂解抽提液作包被抗原其生产过程存在生物安全隐患,要求条件高,所以基因工程表达并纯化的蛋白来制备SARS冠状病毒抗体检测试剂有自身的优越性。由于N蛋白具有较强的免疫原性,在各毒株之间的变异又很小,因此以体外基因重组N蛋白代替全病毒裂解液蛋白,是SARS抗体检测试剂的发展方向。     

Hantavirus-like particles generated in CHO cells induce specific immune responses in C57BL/6 mice

A safe and effective hantavirus vaccine is highly desirable since hantaviruses are distributed worldwide and cause an acute and often fatal disease (hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS). Virus-like particles (VLPs) displaying functional viral proteins could provide effective vaccines against a few viruses, but their ability to induce hantavirus-specific immune response has not been adequately investigated. To measure the immunogenicity of Hantaan virus-like particles (HTN-VLPs) vaccine, we generated recombinant HTN-VLPs by co-expressing Hantaan virus nucleocapsid (N) protein and glycoproteins (Gn and Gc) in Chinese hamster ovary (CHO) cells. We compared intramuscular versus subcutaneous administration of HTN-VLPs for the ability to induce specific immune response against Hantaan virus infection. Mice that received both intramuscular and subcutaneous immunizations of HTN-VLPs were sufficiently stimulated specific antibody response against Hantaan virus N protein and glycoproteins, which was comparable to Chinese commercial inactivated bivalent hantaviruses vaccine. Moreover, vaccination with HTN-VLPs also resulted in the induction of higher levels of specific cellular response to N protein than that of inactivated vaccine. Our results provide an important insight towards the development of hantaviruses-like particles as a potential candidate vaccine for the control and prevention of hantaviruses infection.     

用麻疹活疫苗制备抗麻疹病毒单克隆抗体及其应用

[目的]制备抗麻疹病毒(MV)的单克隆抗体(单抗,McAb),并用该单抗研制捕获法ELISA检测MV-IgM的诊断试剂盒。[方法]以MV减毒活疫苗免疫Balb/c小鼠,其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗MV的杂交瘤细胞株,以获得该单抗,并对用其研制的检测抗MV-IgM试剂盒进行考核。[结果]获得的杂交瘤细胞株中,B2能稳定分泌高滴度抗MV单抗。经考核,用该单抗酶结合物研制的检测抗麻疹-IgM试剂盒特异性和稳定性良好,与同类商品试剂盒比较,其检出麻疹病例血清抗MV-IgM的时间较早。[结论]应用麻疹减毒活疫苗成功地制备了小鼠杂交瘤细胞,其中B2株能稳定分泌高效的抗MV单抗,用于研制检测抗MV-IgM捕获法ELISA试剂盒,其敏感性、特异性和稳定性令人满意。     

汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒（HV）S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG。方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白（NP）编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统 rBAC-Z10S-TN。间接荧光法了解重组NP（rNP）表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况。建立免疫印迹法检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较。结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应。经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67%。结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统。所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

A major outbreak of hantavirus infection in Belgium in 1995 and 1996.

Haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) is a human disease characterized by flu-like symptoms, renal dysfunction, and in severe cases, haemorrhagic manifestations. The causative agents of HFRS are Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU) and Dobrava (DOB) hantaviruses. Hantavirus infections are of increasing importance in Europe. Outbreaks occur in Belgium with a 3- to 4-year interval with an increasing number of cases. We describe the largest outbreak so far in Belgium with 217 serologically and clinically confirmed cases in the period between October 1995 and December 1996. We demonstrated that the use of viral antigen derived from a local PUU-strain was able to detect significantly more sera positive for IgM in an immunofluorescence assay. Furthermore, although in some cases SEO, HTN and DOB antibody-reactivities were detected by ELISA, only PUU infections could be confirmed by neutralization test. The presence of an unknown hantavirus serotype circulating in Belgium should be considered.