中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因，并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物．以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增，将预期片段克隆测序并进行分析；根据表达质粒pET32a( ）上的克隆位点及测序结果设计PCR引物．将截短的基因片段重组入质粒pET32a( )中进行表达．纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp．目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85％；截取其保守功能区域序列(162bp)．构建成功重组表达质粒pET32a( )-tDEF，含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后，于Mf26000处可见一预期的特异表达带，该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应；琼脂扩散法显示，纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论首次克隆了中华按蚊防御素基冈．其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达，但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

蓝氏贾第鞭毛虫甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因的克隆、表达与纯化

目的 蓝氏贾第鞭毛虫（简称为贾第虫）甲硫氨酸硫氧化物还原酶基因（GlMSR）,进行原核表达获得其重组蛋白。方法 依据GenBank中GlMSR序列设计引物,以贾第虫中国C2 克隆株基因组DNA 为模板,通过PCR扩增编码序列,将所得片段连接至质粒pET28a以构建原核表达载体pET28a-GlMSR,将pET28a-GlMSR导入大肠杆菌E.coli JM109并挑取阳性克隆进行基因测序和鉴定。用化学方法将经测序验证的重组质粒pET28a-GlMSR转化至E.coli BL21（DE3）。经异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达后,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组蛋白表达结果。收集沉淀中的重组表达产物,镍柱亲和层析纯化带组氨酸标签的重组蛋白,并通过免疫印迹鉴定纯化结果。结果 电泳结果显示在约624 bp处出现目的DNA条带,表明成功得到GlMSR编码序列;PCR 鉴定、酶切鉴定以及基因测序结果表明成功构建重组表达载体pET28a-GlMSR,经IPTG诱导后在沉淀中获得目的蛋白,目的蛋白分子量（Mr）约为25 000,与预期分子量（Mr）22 800基本相符。经Western blot分析显示该重组蛋白含有His6标签。结论 本研究克隆、表达了蓝氏贾第虫GlMSR基因,并纯化获得重组蛋白,为进一步探索该酶的功能奠定了基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶基因的发现与克隆

目的将用表达序列标签(expression sequence tag, EST)策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)cDNA克隆到表达质粒pET32a(+)上,为下一步研究该基因的功能做准备。方法将插入于pTriplEx2 质粒上的cDNA进行测序,用BLASTn程序搜索测序结果,根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后切下的SjAK基因导入原核可溶性表达质粒pET32a(+)中。结果本研究所发现的新基因与曼氏血吸虫AK基因的同一性达86%,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoR I及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论发现日本血吸虫的cDNA与曼氏血吸虫AK cDNA高度同源,并且成功地构建出重组表达质粒pET32a(+)-SjAK。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1)基因的扩增、克隆及蛋白表达。方法 以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序。进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件。结果 含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000bp。重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)plysS中有融合蛋白表达。结论 成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础。     

融合表达的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素包涵体复性的研究

目的 构建融合表达载体,获得具有生物活性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。方法 克隆tlh基因,构建表达载体pET32a+/tlh,融合表达副溶血弧菌不耐热性溶血毒素,用8 mol/L的尿素溶解包涵体,亲和层析纯化目的蛋白,采取逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂等复性方法。结果 复性蛋白具有溶血活性及免疫原性。结论 通过克隆tlh基因,构建融合表达载体pET32a+-tlh,采取纯化、复性方法,获得具有融血活性及免疫原性的副溶血弧菌不耐热性溶血毒素。     

丙型肝炎病毒F蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白.方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×His tag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IVTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Western blot检测具有6×His tag蛋白的免疫学活性.结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础.     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

一个蛇苔氧甲基转移酶基因的克隆与功能鉴定

目的 克隆蛇苔氧甲基转移酶(CcOMT1)基因并对其进行功能鉴定。 方法 通过RT-PCR技术获得CcOMT1基因的cDNA全长。构建原核表达质粒pET32a-CcOMT1,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达后,利用Ni-NTA吸附柱对表达的重组蛋白进行纯化,并通过体外酶活分析其活性。采用DNAMAN 7.0和MEGA 5.1软件分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。 结果 克隆得到的CcOMT1开放读码框为837 bp,编码278个氨基酸,预测分子量为30.95 kDa,等电点为5.59。与来自钝鳞紫背苔、紫花苜蓿和冰叶日中花的氧甲基转移酶的同源性分别为73.18%、53.60%和44.60%。对纯化的重组蛋白进行酶活检测,结果表明融合蛋白可以催化具有邻二酚羟基的黄酮和苯丙类化合物,产生相应的氧甲基化产物,其最适底物为槲皮素。 结论 克隆并鉴定了一个CcOMT1基因,为通过酶法实现化合物的氧甲基化修饰提供了一个候选基因。     

肺炎链球菌小片段自溶素蛋白LytA′的体外抗菌活性探讨

目的 构建肺炎链球菌（ATCC49619）小片段自溶素基因lytA′的原核表达载体,通过大肠埃希菌表达系统进行原核表达获得一种新型肺炎链球菌小片段自溶素重组蛋白LytA′,初步探讨该蛋白的体外抗菌活性,并与青霉素G同时进行比较。方法 设计lytA基因的特异性引物,并通过PCR方法从肺炎链球菌（ATCC49619）中扩增lytA基因,并将其插入原核表达载体PGM-T中,构建PGM-T/lytA重组质粒,使用限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ消化PGM-T / lytA获得小片段自溶素基因lytA′。再构建表达质粒pET-32a（+）/lytA′ 并转化到感受态细胞大肠埃希菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达目的 蛋白,使用透析袋等电点洗脱技术纯化回收目的 蛋白LytA′;采用微量肉汤稀释法分别测定LytA′和青霉素G对肺炎链球菌（ATCC49619）的最小抑菌浓度（MIC）,并将其作用于青霉素G敏感菌株肺炎链球菌（ATCC49619）,初步探讨小片段自溶素蛋白LytA′的体外抗菌活性。结果 成功构建重组质粒PGM-T / lytA和pET-32a（+）/lytA′。小片段自溶素重组蛋白表达良好,并显示出预期的抗菌活性。与生长对照组相比,LytA′和青霉素G在3 h时显示出明显的抗菌活性（t=14.243 0,P<0.011 0;t=7.400 0,P<0.022 0）,抑菌效应持续至7 h （t=20.838 0,P<0.008 0;t=17.889 0,P<0.017 0）,抑菌效应逐渐增强。此外,在7 h时,LytA′ 的抑菌活性明显强于青霉素G（t=6.764 0,P<0.027 0）。结论 小片段自溶素重组蛋白LytA′对青霉素G敏感肺炎链球菌显示出一定的体外抑菌活性,且持续时间久,有成为抗肺炎链球菌感染治疗药物的可能性。     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

Bcr-Abl酪氨酸蛋白激酶域及其突变体的构建和表达

目的:制备Bcr-Abl激酶域及其突变体-His的重组蛋白. 方法:用PCR方法从含有Bcr-Abl全长的质粒pGD210中扩增出Bcr-Abl激酶域片段,再通过重组PCR技术获得激酶域的几个主要突变体(T315I,Y253F,E255K,E255V),测序正确后将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建表达激酶域片段和His标签融合表达的载体,IPTG诱导表达,得到的融合蛋白用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化. 结果:成功得到了Bcr-Abl激酶域及其突变体序列,经序列分析证实后将重组质粒转入BL-21进行表达. 结论: 通过重组PCR技术获得了野生型激酶域及其突变体蛋白. 融合蛋白表达在包涵体,占菌体总蛋白的70%以上. 经Ni-NTA镍珠纯化后,纯度在95%以上.     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白的融合表达及其体内靶向性研究

目的:探讨人源抗肝癌单链抗体SA3与增强型绿色荧光蛋白(EGFP-SA3)的融合表达、纯化、复性及其体内靶向性.方法:将SA3,EGFP基因,插入pET-25b(+),构建EGFP-SA3/pET-25b(+)原核表达载体,测序鉴定后转化大肠杆菌BL21 (DF3);IPTG诱导融合蛋白EGFP-SA3的表达,复性、纯...     

hPSF蛋白的原核表达质粒的构建及分析鉴定

目的:构建hPSF蛋白原核表达质粒,在体外观察其与GAGE6调控区结合现象。方法:从人成纤维细胞中提取总RNA,利用hPSF特异性引物通过RT-PCR方法扩增hPSF cDNA编码序列,克隆入pET-28a载体中,构建重组载体pET-28-hPSF。将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE分析在相对分子质量约100kD处出现了1条蛋白条带,免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达hPSF蛋白。结论:成功构建了hPSF原核表达载体,并能够在大肠埃希菌中有效表达hPSF,为进一步研究hPSF的生物学作用奠定了基础。     

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测...     

多拷贝人C肽基因的构建及其原核表达研究

目的构建多拷贝的人C肽基因,选用合适的表达载体,以多拷贝基因的形式在大肠杆菌中高效表达人C肽。方法采用PCR、克隆、DNA序列分析、IPTG诱导表达和亲和层析等方法构建多拷贝的人C肽基因。结果构建成含5拷贝C肽基因的重组pET-30 a表达载体,经转化及诱导,可在大肠杆菌中高效稳定表达可溶性的带6个组氨酸标签的C肽融合蛋白。结论在大肠杆菌中获得了人C肽的高表达,为下一步C肽的功能研究创造了重要条件。