基因释放剂在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板中的应用

目的：探讨基因释放剂的应用并为结核病DNA疫苗的研究提供靶基因。方法：分别用基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板，采用PCR法从模板中扩增早期分泌性抗原靶(ESAT-6)基因并测序证实所扩增的基因是否为目的基因。结果：从基因释放剂提取法与DNA提取试剂盒提取法制备的DNA模板中均成功地扩增出了目的基因ESAT-6。结论：基因释放剂提取法制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶DNA模板方便、快捷，提高了制备DNA模板效率。     

结核菌早期分泌性靶抗原免疫学研究进展

结核病仍是世界上最严重传染病之一。结核菌早期分泌性靶抗原（ESAT-6）是结核分枝杆菌的一种早期分泌蛋白,它的免疫原性是目前研究热点。本文就ESAT-6在结核菌的致病性,结核病诊断及保护性免疫等方面的研究进展作一综述。     

结核分枝杆菌分泌性抗原在结核诊断中的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌所引起的一种严重危害人民健康的慢性传染病,是目前所知传染病中最致命的传染病.结核病诊断主要依靠细菌学检测、分子生物学检测、免疫学检测和病理诊断,随着近年来全球结核病发病率的上升,目前已有的检测技术灵敏度和特异性较低,尚不能达到理想的诊断率,寻找高效、准确、简便的诊断方法是控制结核病疫情的关键.已经...     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达及纯化研究

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统，建立表达及纯化方法，为其应用打下基础。方法根据ESAT-6的基因序列设计引物，从结核菌基因组DNA中扩增基因，酶切后插入表达载体，测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株，经IPTG诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。结论构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功，纯化出目的蛋白。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达载体的构建及蛋白表达的鉴定

目的　克隆并表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6的编码基因 ,为研究其免疫功能奠定基础。方法　以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板 ,用PCR对ESAT 6基因进行扩增 ,扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3 1/Zeo( )中。对重组表达载体pcDNA ESAT 6进行酶切、PCR及测序鉴定。经鉴定无误的重组质粒用DEAE 葡聚糖法转染COS 7细胞 4 8h后 ,用Trizol法提取转染细胞总RNA进行RT PCR鉴定。结果　重组质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,并能在COS 7细胞中有效表达。结论　结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT 6真核重组表达质粒pcDNA ESAT 6构建成功 ,为进一步研究ESAT 6和CFP 10的免疫原性、免疫保护性及其二者之间的相互作用奠定了基础     

周围神经43kD蛋白单克隆抗体的制备

目的：制备周围神经43kD蛋白单克隆抗体。方法：通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶系统,从周围神经组织中分离回收43kD蛋白作为抗原,免疫BALB／C小鼠,通过杂交瘤技术,点膜印迹法检测,获得相应的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以Western blot方法检测抗体的特异性。结果：阳性克隆可持续稳定分泌抗43kD蛋白抗体,Western Blot显示在43kD处出现特异的阳性反应条带。结论：建立了分泌抗43kD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,获得了43kD蛋白单克隆抗体。     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。     

结核分枝杆菌抗原及其研究进展

结核病是危害人类健康的最大传染病之一。结核分枝杆菌抗原遗传背景较复杂,且个体差异较大,应用单一抗原和单一的诊断方法无法对结核病进行及时、准确的诊断。近年来国内外学者发现了一些新的结核分枝杆菌菌属抗原和特异性抗原,并逐渐完善了结核病的诊断方法,对结核病的诊断具有重大意义。现就这些抗原的生物学特性及其在结核病诊断中的研究进展进行综述。     

结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究现状及展望

结核病的实验室诊断技术主要包括细菌学、免疫学和分子生物学等三大领域的诊断方法。与细菌学和分子生物学技术相比，免疫学诊断技术同时兼具简便、快速、价廉、无需贵重仪器、容易在基层实验室推广等优势，因此，长期以来一直是结核病研究人员重点关注并且坚持不懈努力的研究方向。     

5种结核分枝杆菌分泌性蛋白的纯化及血清学特性

[目的]分离纯化结核分枝杆菌分泌性蛋白30-kDa,38-kDa,ESAT-6,Rv3872,HBHA,并比较此5种蛋白及其3种联合蛋白38-kDa-30-kDa Ag,38-kDa-ESAT-6Ag,38-kDa-HBHA Ag的免疫学特性,并评价在结核血清学诊断中的应用价值.[方法]利用间接酶联免疫吸附试验评价肺结核患者组和健康对照组血清中5种蛋白及3种联合蛋白的抗原性.[结果]成功分离纯化了5种分泌性蛋白;酶联免疫吸附试验结果表明,与其他4种结核分枝杆菌分泌性蛋白比较,38-kDa抗原具有较强的敏感性和特异性,尤其在抗IgM抗体的诱导免疫反应最强(P<0.000 1),敏感性和特异性分别为44.44%和95%,而38-kDa-30-kDa联合抗原的敏感性高达80.00%,并且也具有较高的特异性;ESAT-6抗原和HBHA抗原在与3种抗体的反应中具有相似的敏感性与特异性;Rv3872抗原的敏感性和特异性与其他4种抗原相比均较低.[结论]作为结核分枝杆菌分泌性蛋白单一抗原,38-kDa抗原的免疫原性优于30-kDa,ESAT-6,Rv3872,HBHA,而38-kDa-30-kDa联合抗原有望成为结核血清学新型诊断试剂有效的候选抗原.     

结核分枝杆菌特异性抗原重组蛋白研究进展

结核病是一种由结核分枝杆菌(mysobacterium tubercu-losis,MTB)引起的人畜共患慢性传染病.由于耐药株出现、人类免疫缺陷病毒(HIV)合并MTB感染以及大规模高危人群流动,因而造成全球流行,其发病率、病死率呈上升趋势,已形成全球范围的流行.疫情呈三高一低,即患病率高、病死率高、耐药率高、年递降率低.要控制结核病的发生与流行必须加强对结核病的诊断学研究,目前研究快速、准确、敏感、特异以及简便的诊断方法是有效地控制结核病蔓延的关键.     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的 构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretory antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌BL21菌体中哪诱导表达，并经镍柱纯化、Western—blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白分子量约25kDa，并能与特异性单抗结合，具有一定活性。     

结核分支杆菌ESAT-6基因蛋白的表达

目的构建致病性结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶（Early secretary antigenic target，ESAT-6）基因的pET原核表达载体，诱导表达并初步鉴定该蛋白。方法设计特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组中扩增ESAT-6基因，产物通过双酶切克隆入pET-32a（＋）质粒，经PCR、酶切、测序等方法鉴定后，转入大肠杆菌B121菌体中IPTG诱导表达，并经镍柱纯化、Western．blotting鉴定。结果所获得ESAT-6基因序列与GenBank公布的完全一致；表达融合蛋白相对分子质量约2．5Xlo＇，并能与特异性单抗结合，具有一定免疫学活性。结论成功表达纯化并鉴定构建了ESAT-6融合蛋白。     

单克隆抗体IA2结合胰岛细胞膜155kD和160kD抗原蛋白的纯化

免疫吸附实验表明87％1型糖尿病人血清自身抗体能替代单克隆抗体IA2与大鼠胰岛β-肿瘤细胞结合^[1]，并且单抗1A2能与人胰岛及大鼠胰腺提取物中的抗原结合。由于抗原含量很低，用亲和沉析、免疫沉淀、HPLC的方法均未得到可检测量的抗原蛋白。我们尝试用凝胶洗脱的办法得到了足够的大鼠胰腺提取物抗原蛋白。银染及Western Blot显示为155kD和160kD两条带。用胰蛋白酶部分消化后N末端氨基酸序列分析得到了12个氨基酸，初步认为该抗原不同于谷氨酸脱羧酶(GAD)、酪氨酸磷酸酶(IA2)等已发现的抗原。本实验为该抗原蛋白的分子克隆及1型糖尿病发病机制的研究打下了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白MPT64的免疫学特性. 方法:用原核表达的MPT64蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果. 分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激,MTT方法检测IFN-γ产生水平和MTT法检测淋巴细胞增殖,并对脾脏细菌负荷计数. 结果:MPT64免疫小鼠可引起体液免疫和保护性细胞免疫,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激,淋巴细胞的增殖较显着. MTT方法检测小鼠的IFN-γ量为1024 ng/L,而生理盐水对照组低于80 ng/L. 结论:MPT64蛋白有可能作为新型结核疫苗的组分.     

结核分枝杆菌胞浆蛋白质抗原的制备与检测

将结核分枝杆菌（M．tuberculosis）H37Ra株苏通培养基培养物化学灭活，低温高速离心，超声波裂解，SephadexG－200柱层析，获得3个峰，制备了3种胞浆蛋白质抗原。经与结核分枝杆菌阳性参比血清、阴性参比血清及各种分枝杆菌高免兔血清的ELISA检测，并与PPD、聚合OT及菌体PP等抗原比较，结果表明：第二峰的胞浆蛋白质抗原的特异性最好。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .     

结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因真核表达重组质粒的构建及鉴定

目的 :构建结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒。方法 :以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对ESAT - 6基因进行扩增 ,PCR反应产物经酶切后 ,克隆于真核表达载体pcDNA3.1( )上。结果 :构建了结核杆菌基因ESAT - 6真核表达重组质粒pcDNA3.1( ) -ESAT - 6 ,测序报告ESAT - 6基因已正向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( )上。结论 :结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

结核分枝杆菌特异性抗原ESXO的重组制备及其免疫原性评估

目的 评估结核分枝杆菌(MTB)重组特异性抗原ESXO在大肠埃希菌中的高效表达,并评价其免疫原性.方法 采用常规分子克隆方法获得MTB重组蛋白ESXO.酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测84份确诊结核病(TB)患者血清和48份健康人血清中相应的抗结核ESXO抗体水平,评价血清学抗原活性,并与结核早期分泌蛋白ESAT-6和CFP-10的检测结果进行比较.结果 重组特异性抗原ESXO在大肠杆菌中获得成功表达,其在E.coli BL 21 plysS (DE3)中以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量(27 300)与预期相符,血清学抗原活性评估结果显示其特异度和敏感度分别为94.0％ (45/48)和32.1％(27/84),特异度与ESAT-6和CFP-10相当,敏感度高于ESAT-6.结论 结核特异性抗原ESXO有望成为新的TB诊断与疫苗设计的候选抗原.     

应用3种抗原的芯片系统检测结核分枝杆菌

目的 探讨3种抗原的芯片系统检测结核分枝杆菌的敏感性及特异性。方法 以3种结核抗原的芯片检测系统，对临床确诊的100例肺结核标本及100例非结核标本进行检测。结果 芯片检测的敏感度为88％，两项或三项指标同时阳性时，特异度可达100％；芯片检测结核组与非结核组结果有高度显著性差异（P〈0．01）。结论 结核分枝杆菌3种抗原的芯片敏感性高、特异性强。