脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

非程控降温-80℃冷冻保存外周血干细胞的活性观察

目的 :观察非程控降温 - 80℃冷冻保存外周血造血干 /祖细胞的活性 ,为临床自体外周血造血干细胞移植提供方便、有效的冻存方法。方法 :常规方法动员外周血干细胞 ,CS - 30 0 0PLUS血细胞分离机采集干细胞 ,以 10 %二甲亚砜、10 %人AB型血清、RPM116 4 0培养基为冷冻保护剂 ,2ml/管冻存干细胞 ,按第 1、2、4周和第 2、3月顺序复苏细胞并测定GM -CFU集落数、台盼兰拒染率和CD34 细胞百分率。结果 :用该方法冷冻保存的外周血干细胞 ,在 4周内其细胞活性与采集时的细胞活性无明显差别 (P >0 .0 5 ) ,冻存至 2～ 3个月时细胞活性则明显降低 (P <0 .0 5 )。结论 :应用血清和DMSO等作为冷冻保护剂、- 80℃直接冻存的外周血干细胞 ,在 4周内复苏后其细胞活性无明显降低。     

-80℃冰箱降温-液氮冻存脐血造血干细胞

为脐血造血干细胞 (CBHSC)的冻存建立简便有效的方法 ,采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO)加 6 %羟乙基淀粉 (HES)为冷冻保护剂 ,不用程控降温装置 ,直接置CBHSC于 -80℃冰箱中降温 ,次日移至液氮液中保存 1周、1个月、3个月、6个月。结果冻存 6个月后 ,单个核细胞 (MNC)、粒 -单系造血祖细胞 (CFU -GM )和CD+34 细胞的回收率及MNC的台盼蓝拒染率分别为 90 .5± 1.7% ,87.6± 19.5 % ,91.9± 2 .9% ,75 .8± 1.8%。认为这一简便的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能 ,因此它能为脐血移植冻存CBHSC。     

不同冻存条件对造血干细胞保存效果的影响

目的:探讨不同冻存条件对造血干细胞(HSC)的保存效果. 方法: 在脐血HSC中加入冷冻保护液A[100 g/L二甲基亚砜( DMSO) 120 g/L HES 80 g/L人血清白蛋白]或B(50 g/L DMSO 120 g/L HES 80 g/L人血清白蛋白),分别做以下处理:-80℃直接冻存(Ⅰ组); 程控降温后-80℃冻存(Ⅱ组);程控降温后-196℃冻存(Ⅲ组),时间12 mo.比较在不同冷冻条件及不同DMSO浓度的条件下对HSC保存效果. 结果: 脐血HSC加冷冻保护液后在Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组冷冻条件下,在12 mo期限内保存效果相当. 采用含25 g/L DMSO组成的联合冷冻保护液可在冷冻时间不超过3 mo的条件下对HSC进行冷冻保存. 结论: 在冷冻时间不超过3 mo的条件下,采用含25 g/L DMSO组成的联合冷冻保护液对HSC进行冷冻保存,既可满足移植的需要,又可减少DMSO的输入量. 长期保存HSC,则需要用含50 g/L DMSO的冷冻保护液.     

人外周血造血干细胞低温保存方法的实验研究

目的：观察－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法中单用二甲基亚砜（DMSO）与DMSO加羟乙基淀粉（HES)两种浆存保护剂对人外周血造血干细胞体外冻存的效果。方法：对5例经Cs-3000Plus血细胞分离机分离所得的外周血单个核细胞分别加入10％DMSO和5％DMSO加6％HES冻存保护剂。并分别以－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法保存15d，以快速复温法复苏细胞，检测冻存前后细胞活率及有核细胞、CD34^ 细胞、粒单系集落形成单位（CFU－GM）、红系集落形成单位（CFU－E）回收率。结果：在－196℃程控降温冻存方法时，单用DMSO和DMSO加HES两组在细胞活率、有核细胞回收率、CD34^ 细胞回收率、CFU－E回收率方面差别无显著性意义；在－80℃直接冻存方法时，MDSO加HES组有核细胞回收率、CFU－E回收率高于单用DMSO组。结论：－196℃程控降温冻存时10％DMSO和5％DMSO加6％HES两种冻存保护剂均可有效应用于外周血造血干细胞保存；一80℃直接冻存方法适合5％DMSO加6％HES冻存保护剂，也可有效用于外周血造血干细胞保存。     

自体造血干细胞冷冻保存方法的实验研究

目的 观察程序降温仪冷冻法和HES冷冻法在冷冻保护体系和技术实施上的差别，选择一种可以获得良好回收率，操作过程更为简便和安全的冷冻保存方法。方法 (1)通过血细胞分离机，获得去除了红细胞后的单个核白细胞。(2)使用程序降温仪冷冻法，将细胞冷冻后，放置液氮中保存。(3)使用HES冷冻法，直接置-80℃低温冰箱中保存。(4)采用常规计数法，台盼蓝拒染法，甲基纤维素法，流式细胞仪，检测两种方法冻存自体造血干细胞前后，单个核细胞的总数、细胞存活数，CFU—GM集落形成数、CD34阳性细胞的百分率。(5)在37℃恒温水浴槽中，快速解冻细胞。结果 用两种冻存方法保存的自体造血干细胞，解冻回输给患者后，均未出现过敏症状和特殊的不良反应。检测两种不同冻存方法，在冻存前后单个核细胞的总数、细胞存活率、以及CFU—GM集落形成数和CD34阳性细胞的百分率。经统计学处理，无显著性差异。在操作时间上，程序降温仪冷冻法为4h，HES冷冻法为1．5h。结果表明，采用HES冷冻体系，直接置-80℃低温冰箱短期冻存自体造血干细胞，回收率不受影响，方法简单，操作时间短，临床使用安全可靠。     

﹣80°C冰箱长期冻存外周血造血干细胞研究

目的对外周血造血干细胞活性在深低温（-80℃）下保存3年的效果进行评价。方法对30例经MCS＋血细胞分离机采集所得的外周血造血干细胞加入细胞冻存保护剂分别予以-196℃液氮冻存和-80℃冰箱深低温冻存,并检测和比较冻存前后单个核细胞（mononuclear cells,MNC）、CD34＋细胞的计数及细胞回收率,细胞活性。结果 -80℃冰箱冻存组MNC、CD34＋细胞冻存3年与冻存前比较差异均无统计学意义冻存3年后MNC回收率与冻存1年后比较差异无统计学意义。3年后-80℃冰箱冻存组干细胞与-196℃液氮冻存组比较,差异无统计学意义。结论 -80℃冰箱深低温保存法快速、简便、安全、费用低廉,可有效用于外周血造血干细胞长期保存。     

简易法冻存脐血造血干细胞的研究

目的 :为脐血造血干细胞 (CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法。方法 :采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO)加6 %羟乙基淀粉 (HES)为冷冻保护剂 ,不用程控降温装置 ,直接置 CBHSC于 - 80℃冰箱中降温 ,后分 - 80℃冰箱组和液氮组保存 1周至 3个月。结果 :冻存 3个月后 ,单个核细胞 (MNC)和粒 -单系造血祖细胞 (CFU- GM)的回收率及台盼兰拒染率在 - 80℃冰箱保存组分别为 (92 .9± 0 .8) % ,(82 .2± 19.6 ) % ,(82 .1± 1.4) % ;在液氮保存组分别为 (93.0± 1.2 ) % ,(93.6± 2 2 .2 ) % ,(85 .6± 1.5 ) %。结论 :这两种简便、经济的方法能很好地保存 CBHSC的造血潜能 ,能为脐血移植冻存CBHSC。     

脐带血造血干细胞的采集、浓缩与低温冷冻保存

目的 :探讨脐带血造血干细胞库建立中的脐带血采集、分离、低温冻存的方法。方法 :自 1997年 7月至2 0 0 0年 7月已冻存经过HLA配型的脐带血 (cordblood ,CB) 3 74 4份。CB采自经检查符合要求的足月顺产或剖宫产新生儿 ,经 (citratephosphateadeninedextnse ,CPD A)抗凝 ,用密闭式血袋采集法采集。采集后置于室温保存 ,18h内处理。用羟乙基淀粉 (hydroxythylstarch ,HES)沉降后一次分离方法去除绝大多数红细胞及大部分血浆。采用以二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)为主的冷冻保剂 ,冷冻保存CB。DMSO的终质量分数为 10 %。经序控降温后 ,置于 - 196℃液氮中保存。结果 :分析了 3 74 4份冻存CB ,平均采集量为 (93± 2 2 )ml(45～ 198ml)。浓缩后平均体积为 (3 8± 8)ml(3 0～ 60ml) ;浓缩前后有核细胞数 .浓缩前平均有核细胞数为 11.2× 10 8± 5 .3× 10 8(4.5× 10 8～ 4 5 .1× 10 8) ;采用HES沉降一次离心浓缩去除红细胞后的平均有核细胞数为 9.7× 10 8± 4 .6× 10 8(3 .1× 10 8～ 3 0 .5× 10 8) ;平均有核细胞回收率为 79%。质控检测 4 0份标本细胞活率为 88.2 % ,CFU GM回收率和CD3 4 +细胞计数分别为 97.6%和 86.4 %。结论 :本研究采用的CB采集、冻存及造血干细胞和病原生物检测的方法是安     

-80℃条件下不同细胞浓度外周血干细胞冻存效果的实验观察

目的　观察不同细胞浓度外周血干细胞在 - 80℃条件下的冻存效果。方法　采用一种简便的 - 80℃干细胞冻存方法 ,其干细胞保护剂终浓度为 5 %二甲基亚砜 (DMSO) ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HSA) ,不经程序降温 ,直接 -80℃冰箱冻存外周血干细胞 ,并在不同时相点 (冻存后 1、3、6、9、1 2个月 )对推荐细胞浓度组 (1 .3～ 3.9)× 1 0 7/ml、调整细胞浓度组 (8.0～ 2 9.9)× 1 0 7/ml和高细胞浓度组 (30 .1～ 70 .1 )× 1 0 7/ml的外周血干细胞的细胞活性进行检测 ,观察台盼蓝拒染率和MNC、CFU GM、CD34+ 细胞的回收率。结果　 3组干细胞活性在 1 2个月内无明显下降 ;干细胞冻存后 9个月期间 ,3组冻存细胞的台盼蓝拒染率 ,MNC回收率、CFU GM回收率、CD34+ 细胞回收率都在 80 %以上。冻存 1 2个月中 ,3组在冻存后同一时间相互比较无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,说明该 - 80℃干细胞冻存方法适用于不同浓度的细胞液 ,短期内具有良好的冻存效果。结论　5 %DMSO、3%HES和 4 %HAS作为干细胞冷冻保护剂直接 - 80℃冰箱冻存外周血干细胞的方法能有效地保护不同浓度细胞液的外周血干细胞活性 ,适当地提高细胞保存时的浓度 ,减少回输量 ,可避免因干细胞冻存而引起的副作用     

-80℃简易冻存外周造血干细胞临床应用观察

目的:探索一种简便易行、安全有效、成本低的干细胞的冻存方法。方法:6份外周造血干细胞以1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存,检测冻存前后外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性、MNC和CD34+细胞的数量及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论:1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法。     

-80℃冰箱非程控降温冻存脐血造血干细胞

目的:为脐血造血干细胞(CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法。方法:采用5％二甲基亚砜(DMSO)加6％羟乙基淀粉(HES)为冷冻保护剂,不用程控降温装置,直接置CBHSC于-80℃冰箱中冻存1～6个月。结果:冻存6个月后,单个核细胞(MNC)、粒-单系造血祖细胞(CFU-GM)和CD_(34)~+细胞的回收率及台盼兰拒染率分别为(91.6±1.8)％,(83.1±15.6)％,(88.2±1.8)％,(77.7±2.0)％。结论:这种简便、经济的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能,因此,能为脐血移植冻存CBHSC。     

F68及其联合DMSO对脐血造血细胞的低温保护作用

目的研究普鲁兰尼克(F68)及其联合DMSO在-80℃条件下对脐血造血干细胞的低温保护作用,为临床应用提供依据.方法脐血造血细胞冻存30、60、90 d后复苏,应用台盼蓝拒染率、集落形成试验、3H-TdR掺入率等,测定经F68保护体系冻存的脐血活力,并与目前通用的冷冻保护剂二甲亚砜及CP-1进行了对比研究.结果在-80℃条件下,F68对脐血造血细胞具有明显的冷冻保护作用,并与DMSO具有协同保护效果,联合F68及DMSO的保护体系可使MNC、CFU-GM的平均回收率及台盼蓝拒染率在第90天时分别达到(83.4±6.3)%,(68.8±7.9)%, (92.5±5.1)%,优于目前通用的细胞冻害保护液CP-1及DMSO.90 d的冻存期内,脐血细胞活力无明显下降.结论 F68及其与DMSO组成的冻存方案对脐血造血干细胞具有良好的冻存保护效果.     

乳猪肝细胞-196 ℃保存的初步研究

目的探索适合于乳猪肝细胞-196 ℃冷冻保存的条件和方法.方法体外分离新生乳猪肝细胞,以含不同浓度二甲亚砜(DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存.2个月后复苏接种培养,对其存活率、贴壁率、尿素合成能力、猪白蛋白mRNA的表达等进行检测,并观察其形态结构变化.结果不同DMSO浓度保存猪肝细胞复苏后的活力及形态均有所不同, 其中含5% DMSO冻存液组保存效果最差;10%组次之;15%组最佳.15% DMSO冻存液组复苏后肝细胞的存活率为(83±4)%,贴壁率是(81±5)%,细胞形态与未冻存组相似,均保持较强的尿素合成能力及猪白蛋白mRNA的表达,较5%与10% DMSO冻存液组有显著性差别(P<0.05).冻存时肝细胞浓度为(5～10)×106个/ml组复苏后细胞存活率明显优于(1～2.5)×106个/ml组.结论 15% DMSO浓度适合于乳猪肝细胞的长期保存.高浓度组猪肝细胞的冻存效果优于低浓度组.     

人骨髓基质细胞冻存技术的初步研究

目的　探索适合于人骨髓基质细胞 - 196℃冷冻保存条件和方法。方法　以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养 ,传代后以不同浓度二甲亚砜 (DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存 ,2个月后复苏接种培养 ,对其存活率、贴壁率和体外成骨能力进行检测。结果　不同DMSO浓度保存细胞复苏后细胞的存活率从高到低依次为 10 %DMSO组、5 %DMSO组、15 %DMSO组、2 0 %DMSO组 ;在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现细胞结节 ,碱性磷酸酶染色阳性 ;冻存时细胞浓度为每毫升 (5 .0～ 8.0 )× 10 6个细胞组复苏后细胞存活率高于每毫升 (1.0～2 .5 )× 10 6个细胞组。结论　 5 % - 10 %DMSO浓度适合于骨髓基质细胞的长期保存 ,高浓度组骨髓基质细胞的冻存效果优于低浓度组。     

外周血干细胞（PBSC）的低温保存技术及其临床应用的进展

外周血造血于／祖细胞移植作为治疗造血系统恶性肿瘤及某些实体瘤的有效方法，近年来已得到广泛应用。外周血干细胞（PBSC）的保存是该项技术中的重要步骤，许多学者对其做了大量研究。此文将对几种常用的PllSC保存方法及其效果做一综述。1程控降温、液氮中保存这是较经典的造血．干细胞保存方法，采用10％的二甲基亚现（DMSO）作为冷冻防护剂，在电脑程序控制下以1—3℃／min的速度降温，待温度降到-80℃后将细胞置于液氮中（－196℃）[1]。此方法的优点是：1．冻存过程中细胞由液态转为固态的相变期时间最短，细胞所受损伤最小。2．…     

新改良外周血造血干细胞冷冻技术的临床应用观察

目的为临床自体造血干细胞移植提供一种简单易行、安全有效、成本低廉的干细胞冻存方法。方法 10份外周造血干细胞以二甲基亚砜、自体血浆作保护剂在-80℃条件下直接冻存,冻存前后检测外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果冻存前后外周血干细胞活性单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论二甲基亚砜、自体血浆作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周造血干细胞冻存方法。     

-80℃冻存外周血干细胞21例分析

目的：探索一种操作简单、干细胞回收率和存活率高、成本低廉的外周血浆存方法。方法：采用终浓度为5％二甲基亚砜（DMSO），3％羟乙基淀粉（HES）和4％人血白蛋白（HSA）的干细胞保护剂直接－80℃冰箱冰存外周血干细胞，并检测不同时相点（1、3、6、9、12个月）外周血干细胞的细胞活性，单个核细胞（MNC）和CFU－GM、CD34^ 细胞的回收率。结果：随着保存时间的延长，观察到12个月时，冻存干细胞的细胞活性、MNC回收率和CD34^ 细胞回收率分别为86．46％、88．58％、87．65％，与冻存1个月相比无统计学差异（P＞0．05），足以保障干细胞移植后造血重建的成功。结论：5％DMSO，3％HES和4％HAS作为干细胞冷冻保护剂直接－80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、实用、安全、可靠、成本低的外周血干细胞冻存方法，具有广泛的临床推广价值。     

不同冻存时间对兔角膜内皮细胞活性的影响

目的 探讨适合角膜内皮细胞(corneal endothelial cell,CEC)超低温冷藏保存的最佳期限.方法 将CEC经-196 ℃液氮冷冻保存.在冷冻后1、6、12、24个月分别复苏,培养.观察CEC的生长情况和细胞存活率及24 h贴壁率.结果 冻存1、6、12个月复苏的CEC细胞存活率均≥80.0%,冻存24个月的CEC细胞存活率(72.0%)较前三个时间段稍有下降但没有差异;冻存1、6、12个月CEC 24 h贴壁率均≥72.5%,此三个时间段比较没有明显差异,冻存24个月CEC 24 h贴壁率(59.2%)与前三个时间段比较有统计学差异(P＜0.05).结论 在供体来源短缺,细胞需要长期保存的情况下,深度冷藏是保存CEC的一种较好的方法.     

贴壁培养细胞直接用培养瓶置-80℃冻存

目的：探讨贴壁培养细胞直接用培养瓶置4℃、-20℃,最后置-80℃低温冰箱冻存的可行性.方法：采用培养瓶常规培养贴壁细胞L929,去上清后,加冻存液覆盖细胞.-80℃低温冰箱冻存,然后,每2个月复苏1次,计数活细胞,观察细胞传代效果.结果：L929细胞置-80℃低温冰箱冻存1年,复苏良好,随着冻存时间延长,存活细胞逐渐减少,复苏耗时延长.结论：贴壁培养细胞直接用培养瓶置-80℃低温冰箱冻存1年,复苏良好.