简易法冻存脐血造血干细胞的研究

目的 :为脐血造血干细胞 (CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法。方法 :采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO)加6 %羟乙基淀粉 (HES)为冷冻保护剂 ,不用程控降温装置 ,直接置 CBHSC于 - 80℃冰箱中降温 ,后分 - 80℃冰箱组和液氮组保存 1周至 3个月。结果 :冻存 3个月后 ,单个核细胞 (MNC)和粒 -单系造血祖细胞 (CFU- GM)的回收率及台盼兰拒染率在 - 80℃冰箱保存组分别为 (92 .9± 0 .8) % ,(82 .2± 19.6 ) % ,(82 .1± 1.4) % ;在液氮保存组分别为 (93.0± 1.2 ) % ,(93.6± 2 2 .2 ) % ,(85 .6± 1.5 ) %。结论 :这两种简便、经济的方法能很好地保存 CBHSC的造血潜能 ,能为脐血移植冻存CBHSC。     

脐血造血干细胞的采集、分离、保存及输入

人类脐血富含造血干细胞,是造血干细胞移植的一种资源。如何采集、分离、保存、输入脐血造血干细胞是脐血移植的重要环节。近年来取得了可喜的进展,成为人们近期关注的热点。     

-80℃冻存外周血造血干细胞的应用研究

目的:探求一种操作简便实用、造血干细胞回收率和存活率高、成本低的外周血造血干细胞的冻存方法。方法:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存,并检测冻存前后外周血干细胞的活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率无明显差异(P>0.05),输注后造血均重建。结论:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,具有广泛的临床推广价值。     

脐血造血干细胞冻存和纯化的研究

为观察脐血造血干细胞—80℃保存以及脐血CD34~ 细胞的纯化效果,采用-80℃深低温冰箱冻存脐血干细胞,结果表明保存1个月脐血单个核细胞(MNC)数量、锥虫蓝拒染率、粒一单祖细胞集落(CFU—GM)数回收率分别为85.17％±5.38％、91.67％±3.22％、60.50％±4.42％。保存1、3、6个月动态观察3项指标除锥虫蓝拒染率1个月与6个月外均无显著性差异{均P>0.05)。用Isolex50免疫磁珠分离系统,可从脐血中获得高纯度CD34~ 细胞。上述研究为脐血造血干细胞移植的临床应用提供了实验依据。     

-80℃简易冻存外周造血干细胞临床应用观察

目的:探索一种简便易行、安全有效、成本低的干细胞的冻存方法。方法:6份外周造血干细胞以1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存,检测冻存前后外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性、MNC和CD34+细胞的数量及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论:1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法。     

外周血造血干细胞的检测及冻存技术

0　引言　化疗是治疗恶性肿瘤的有效方法 [1 ,2 ] ,自体外周血干细胞移植 (APBSCT)治疗实体瘤是技术 .利用流式细胞术(FACS)检测采集的自体外周血干细胞 (APBSC)中 CD34+ 细胞及其亚群 ,对准确及时判断干 /祖细胞数量有重要意义 [3] ,分离液的冻存更是 APBSCT中的关键技术 .我们通过对临床2 4例肿瘤患者 APBSCT中干细胞的检测及冻存技术的研究 ,制定标准技术方法 ,稳定临床治疗效果 .1　对象和方法1.1　对象　肿瘤患者 2 4例 ,男 13例 ,女 11例 ;年龄 2 9～ 73(中位 4 9)岁 .肿瘤类型 :乳腺癌 8例 ,肺癌 9例 ,精原细胞癌 2例 ,…     

兔外周血间充质干细胞的分离培养及冻存

目的建立兔外周血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养及冻存的方法。方法用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化兔外周血MSCs，MSCs经液氮冻存半年复苏，观察细胞冻存前后的生长状况，并用台盼蓝法测定其存活率。结果MSCs于体外培养2h开始贴壁生长，细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞，增殖活跃；MSCs经6mo冻存后复苏培养，台盼蓝法计数存活率达95％以上，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形，细胞生长增殖旺盛。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G-CSF动员后的外周血MSCs，且细胞纯度高，生长增殖活性好，采用液氮冻存MSCs的方法十分有效可行。     

人胚神经干细胞的冻存与复苏

目的：研究神经干细胞浆存复苏后的成活率及再培养生长情况。方法：利用无血清培养基短期体外培养胚胎来源的神经干细胞后，以冻存液（体积分数为70％DMEM／F12，体积分数为20％胎牛血清，10％DMSO）进行冻存，于1周，4周，8周，12周，16周，20周，24周分别复苏，计活细胞比例并进行再培养。结果：复苏后神经干细胞的成活比例分别为68％、65％、65％、62％、61％、60％、60％，再培养生长良好。结论：本实验对神经干细胞成功地进行了冻存，复苏和再培养，对临床择期进行神经干细胞移植手术和建立“神经干细胞库”具有重要的意义。     

-80℃冰箱非程控降温冻存脐血造血干细胞

目的:为脐血造血干细胞(CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法。方法:采用5％二甲基亚砜(DMSO)加6％羟乙基淀粉(HES)为冷冻保护剂,不用程控降温装置,直接置CBHSC于-80℃冰箱中冻存1～6个月。结果:冻存6个月后,单个核细胞(MNC)、粒-单系造血祖细胞(CFU-GM)和CD_(34)~+细胞的回收率及台盼兰拒染率分别为(91.6±1.8)％,(83.1±15.6)％,(88.2±1.8)％,(77.7±2.0)％。结论:这种简便、经济的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能,因此,能为脐血移植冻存CBHSC。     

人胚神经干细胞的体外分离培养和长期冻存

目的建立从脑组织中分离人胚神经干细胞的方法和体外长期培养的稳定体系，为细胞治疗提供基础。方法采用机械酶学法从胎脑中获得神经干细胞，这些细胞在合成纤维细胞生长因子和上皮细胞生长因子的无血清培养基中生长，血清刺激诱导分化，程序冷冻法保存细胞。结果这些细胞可在体外持续增殖，并被诱导分化成神经元和神经胶质细胞，可以长期冷冻保存。结论人胚神经干细胞分离培养体系和冻存方法的成功建立为神经损伤、退行性疾病以及其他疾病的细胞治疗提供了潜在的细胞资源。     

人脐血粒-单系造血祖细胞冻存研究

目的:观察人脐血在不同温区保存时粒-单系造血祖细胞(CFU-GM)的损伤情况及有效地长期深低温保存的可行性。方法:采用传统的室温制备—程序降温—液氮保存方法,观察脐血造血细胞活力及 CFU-GM 产率。结果:在室温存放12 h 不受影响,而-8℃、-20℃温区存放12 h 其活力及产率下降,产率分别比冻存前减少了15.5%和38.1%,-30℃温区继续下降,而-80%温区未再进一步降低。液氮中不同时间-80℃保存不会进一步降低 CFU-GM 产率。结论:-8℃～-30℃之间是冻存损伤造血祖细胞主要的危险区,而液氮中长期深低温保存不会进一步损伤脐血造血祖细胞。故-80℃冻存脐血比较合适。     

儿童外周血造血干细胞采集方法与效果评价

目的:探讨儿童外周血造血干细胞(PBSC)的采集方法,并对采集效果进行评价。方法:患者采用化疗和G-CSF或GM-CSF动员,异体供者用G-CSF动员,待WBC数回升至>5.0×109/L,应用CS-3000 Plus、COM TEC和COBE Spectra 3种血细胞分离机进行PBSC采集,设定循环血量为总血容量(TBV)的2～3倍,对于体重<20 kg,红细胞压积(HCT)<24%或者TBV≤1 100～1 650 ml的小儿,须采用经25 Gyγ射线照射的同型少白细胞红细胞预注管路和低流速分离(全血流速一般为10～30 ml/min)。用流式细胞仪检测所采集干细胞的CD34+细胞数,并计数单个核细胞(MNC)数。分析采集细胞中CD34+细胞数与采前MNC数量及采集循环血量的关系。结果:使用CS-3000 Plus血细胞分离机成功采集10例,COBE Spectra血细胞分离机成功采集18例,COMTEC血细胞分离机成功采集3例。采集次数为1～5次,平均1.5次,获得CD34+细胞数(7.9±2.9)×106/kg,MNC数(7.4±3.1)×108/kg。相关性分析显示,所采集到的CD34+数量和采集前MNC数、采集的循环血量呈正相关(r2=0.6229,P<0.0001;r2=0.1905,P=0.0141)。结论:根据儿童患者/供者的体重、TBV、动员情况和循环血量等因素选择合适采集方法,经过1～2次单采都可以安全地采集到高浓度的、能满足临床需要的PBSC。     

不同人羊膜间充质干细胞冻存液冻存细胞效果比较

目的:筛选冻存人羊膜间充质干细胞效果较好的冻存液.方法:①不同配方的细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.人羊膜问充质干细胞培养至第三代后分为10组,分别加入以下10种不同组成的冻存液.A组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%DMSO;B组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%DMSO;C组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;D组:90%胎牛血清+10%DMSO;E组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%甘油;F组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%甘油;G组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%甘油;H:90%胎牛血清+10%甘油;I组:90%DMEM/F12+10%DMSO;J组:90%DMEM/F12+10%甘油.调整细胞密度为5×106mL-1,放入程序降温盒中,入-80℃低温冰箱保存.1个月后复苏,MTT法筛选出吸光光度值较高的一种冻存液.②相同血清含量细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.含体积分数为50%胎牛血清的细胞冻存液分3组保存细胞.K组:45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO;L组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;M组:35%DMEM/F12+50%胎牛血清+15%DMSO;复苏冻存的细胞后.将细胞按冻存前的数量调整至5×1O5mL-1,台盼蓝染色后,计算细胞的成活率.在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况.结果及结论:配方为45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO的冻存液冻存复苏人羊膜间充质干细胞后细胞的成活率最高(P<0.05);冻存复苏后细胞的生长状况较好.     

造血干细胞冻存时间与细胞活性关系的初步探讨

目的 探讨造血干细胞冷冻保存时间与细胞活性之间的关系。方法 造血干细胞中加入细胞冷冻保护剂,通过程控冷冻,放入液氮保存。根据保存的时间不同,复苏后测定细胞活力的变化。结果 细胞液氮保存复苏后,绝大部分的细胞活力得以保存。结论 造血干细胞贮存在液氮中,深低温阻断了酶的活性和细胞代谢,贮存时间长短与细胞活性无关。     

不同冻存液对人羊膜间充质干细胞-80 ℃冻存与复苏效果的影响

目的:观察不同冻存液对人羊膜间充质干细胞冻存复苏后的存活率及再培养情况的影响,并探索简单有效的冻存与复苏方法.方法:将含有血清培养基短期体外培养的人羊膜间充质干细胞分为4组,分别加入不同冻存液(体积分数):A组10%二甲基亚砜 40%胎牛血清 50%DMEM/F12,B组10%二甲基亚砜 90%胎牛血清,C组5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12,D组10%胎牛血清 90%DMEM/F12.以相同方法冻存并复苏细胞,比较4组细胞回收率及再培养情况.结果:A、C 2组细胞复苏后回收率高于另外2组(P均<0.05),且于复苏后再培养24 h内出现较多贴壁细胞.结论:以5%二甲基亚砜 4.5%羟乙基淀粉 20%胎牛血清 70.5%DMEM/F12作冻存液冻存羊膜间充质干细胞效果好.     

短期冻存对大鼠骨髓基质干细胞的影响

目的 探讨不同冻存条件对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）复苏后存活、增殖及向肝细胞分化能力的影响。方法比较用含不同浓度血清的冻存液冻存不同时间的BMSC8复苏后的存活率与贴壁率、增殖、向肝细胞分化能力。结果用血清浓度为90％的冻存液经不同时间冻存后的BMSCs复苏后的存活率、贴壁率最高，且其增殖及向肝细胞分化能力与正常对照组相比差异无统计学意义；而血清浓度为50％及20％时BMSCS复苏后的存活率、贴壁率较低，增殖及向肝细胞分化能力下降，与正常对照组相比差异有统计学意义。结论高浓度血清冻存液短期冻存对BMSCs的存活、增殖、分化能力影响较小，细胞复苏后可用于进一步研究。     

造血干细胞冻存时间与细胞活性关系的初步探讨

目的　探讨造血干细胞冷冻保存时间与细胞活性之间的关系。方法　造血干细胞中加入细胞冷冻保护剂 ,通过程控冷冻 ,放入液氮保存。根据保存的时间不同 ,复苏后测定细胞活力的变化。结果　细胞液氮保存复苏后 ,绝大部分的细胞活力得以保存。结论　造血干细胞贮存在液氮中 ,深低温阻断了酶的活性和细胞代谢 ,贮存时间长短与细胞活性无关。     

原代大鼠肝细胞分离方法与冻存条件的优化

目的 :优化原代大鼠肝细胞 (PRH)分离方法与冻存条件。方法 :建立低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞 ;分别采用含 2 %与l0 %DMSO的冻存液于 - 70℃或液氮中冻存PRH ,并比较各组冻存后PRH活力。结果 :1.该分离方法肝细胞产量为 1.5 84± 0 .5 2 5× 10 8/10 0g大鼠体重 ,存活率达 95 .2± 2 .9% ,肝细胞纯度 >95 % ,胶原酶用量减少为 4 .5mg/10 0 g大鼠体重。 2 .含 2 %DMSO冻存液于 - 70℃组与液氮组PRH存活率均可达 90 %～ 95 % ;ALB冻存 14d - 70℃组PRH明显高于液氮组与新鲜分离组 ,LDH值于冻存 7d的 - 70℃组与液氮组明显低于新鲜分离组 ,其它各组间均无显著差异。结论 :低浓度胶原酶原位循环灌流法为高效的PRH分离技术 ;含 2 %DMSO冻存液于 - 70℃可作为原代肝细胞冻存的理想条件。     

成人脂肪间充质干细胞冻存的实验研究

目的 探寻成人脂肪间充质干细胞冻存和复苏的条件,观察冻存前后脂肪间充质干细胞的形态学特征以及向心肌细胞诱导分化的潜能.方法 自成人脂肪组织分离培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子.将脂肪间充质干细胞于液氮中低温冻存,经3个月后复苏,倒置相差显微镜及透射电子显微镜下观察细胞形态.5-氮杂胞苷进行诱导,免疫荧光技术检测心肌特异性肌钙蛋白-Ⅰ.比较冻存前后脂肪间充质干细胞的形态学特征及诱导转化率.结果 脂肪间充质干细胞较幼稚,冻存前后光镜下的形态及电镜下的超微结构无明显差别,脂肪间充质干细胞呈CD29阳性表达,HLA-DR阴性表达.冻存前后脂肪间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导后第28天均可表达心肌特异性肌钙蛋白-Ⅰ,诱导转化率无差异.结论 脂肪间充质干细胞可耐受低温冻存,复苏后细胞的形态学特征以及诱导分化潜能无明显变化.