重组腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染的Beagle犬牙周膜细胞成骨能力研究

目的    观察重组腺病毒载体 Ad5-hOPG-EGFP 转染 的Beagle 犬牙周膜细胞（ PDLCs）体内和体外的骨化能力。方法    将体外构建的携带人骨保护素（human osteoprotegerin,hOPG）基因的腺病毒载体Ad5-hOPG-EGFP转染Beagle犬PDLCs,通过体外Von Kossa染色实验、实时荧光定量PCR检测成骨指标的表达情况、酶联免疫检测RANKL/OPG的值及裸鼠体内胶原膜成骨实验比较转染组和对照组的成骨能力。结果    组织学和形态学结果显示,转染了重组腺病毒Ad5-hOPG-EGFP的Beagle犬PDLCs形成的矿化结节数目多且体积大、深染。转染组中犬碱性磷酸酶（alkaline phosphates,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨涎蛋白（bone sialoprotein,BSP）基因相对表达水平均高于空载体组和空白对照组（P＜0.05）。转染组中犬RANKL/OPG的值下降趋势最为明显。裸鼠体内实验中转染组胶原膜也体现出较好的成骨能力。结论    重组腺病毒介导的hOPG基因可以促进PDLCs成骨。     

腺病毒介导的TRAIL基因对舌鳞状细胞癌细胞株的影响

目的探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒（ Ad）为载体,巨细胞病毒启动子（ CMV）为启动子的重组基因治疗药物AdCMV- TRAIL诱导鳞状细胞癌细胞系TCa83凋亡的作用。方法用重组绿色荧光蛋白基因（ EGFP）的腺病毒AdCMV- EGFP为对照组,转染TCa83细胞确定重组腺病毒的转染率。在细胞转染1、3、5、7 d时,应用荧光倒置显微镜观察细胞形态,应用MTT检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。以AdCMV- TRAIL为实验组转染TCa83细胞,采用RT- PCR方法检测细胞TRAIL的表达。结果AdCMV- EGFP在1 000 particles/cell 时转染率为100%。细胞转染AdCMV- TRAIL和AdCMV- EGFP后,随时间延长细胞存活率逐渐下降,但AdCMV- TRAIL组较AdCMV- EGFP组下降更快（ P<0.001）。AdCMV- TRAIL和AdCMV- EGFP均能诱导TCa83细胞凋亡,而AdCMV- TRAIL组引起细胞凋亡的程度明显比AdCMV- EGFP组大（ P<0.000 1）。通过RT- PCR可检测到594 bp的TRAIL基因。结论AdCMV- TRAIL在体外能抑制TCa83细胞的活性,并能促进其凋亡。     

含tk和EGFP双顺反子重组腺病毒载体的构建及其在鼠内皮细胞中的表达

目的：构建含有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSV—tk）和增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组腺病毒载体,体外转染鼠内皮细胞,并检测其表达。方法：利用脑炎心肌炎病毒的内部核糖体进入位点（IRES）将HSV—tk与EGFP连接,构建携带HSV—tk和EGFP双顺反子的穿梭质粒,经细菌内同源重组获得复制缺陷腺病毒载体。转染鼠内皮细胞,并检测腺病毒表达情况。结果：成功构建了含有HSV—tk和EGFP双顺反子重组腺病毒载体,荧光显微镜下可观察到绿色荧光的转基因细胞;体外检测结果表明丙氧鸟苷（GCV）对转染有tk—EGFP的鼠内皮细胞有明显杀伤作用,而对未转染的鼠内皮细胞无明显的毒性。结论：含HSV—tk和EGFP基因双顺反子腺病毒载体的构建可以为肿瘤抗血管形成基因治疗提供了新的手段。     

hTERT启动TRAIL基因的腺病毒载体对人舌鳞癌细胞影响

目的：探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒（Ad）为载体,人端粒酶（TERT）启动子引导的重组基因治疗药物AdTERT-TRAIL诱导人鳞状细胞癌细胞（TCa8113）凋亡的作用。方法：含有绿色荧光蛋白基因（EGFP）的腺病毒载体（AdTERT-EGFP）转染TCa8113细胞,确定重组腺病毒载体转染效率;AdTERT-EGFP为对照组,AdTERT-TRAIL为实验组感染TCa8113细胞,采用RT-PCR方法检测TRAIL的表达。应用倒置显微镜观察细胞形态,应用MTT检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：AdTERT-EGFP在1000p/cell时转染效率为100%。RT-PCR可检测到594bp的TRAIL基因。细胞转染AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP后,随时间细胞存活率逐渐下降,但AdTERT-TRAIL组较AdTERT-EGFP组下降更快,统计学分析有显著意义（P〈0.001）。AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP均能诱导TCa8113细胞凋亡,而AdTERT-TRAIL组引起细胞凋亡的程度明显比AdTERT-EGFP组大,统计学有显著差异（P〈0.0001）。结论：AdTERT-TRAIL在体外能明显抑制TCa8113细胞的活性,并能促进其凋亡。     

hOPG转染对大鼠BMSCs及种植体周围成骨的影响

目的：研究体内、体外人骨保护素（hOPG）基因对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨功能和种植体周围成骨的影响。方法：构建含hOPG的重组腺病毒,蛋白印迹杂交法Western Blot检测转染细胞OPG蛋白功能表达。倒置显微镜观察转染细胞形态差别,茜素红S染色鉴定转染细胞的体外成骨能力。建立大鼠股骨干骺端羟基磷灰石涂层种植体植入动物模型。植入种植体前,实验组于植入体窝注入10μL的病毒悬浮液;对照组注入10μL的PBS。4周后取材,HE染色,光镜下观察,定量分析。结果：Western blot结果显示OPG在蛋白水平高表达;茜素红S染色转染组和未转染组都出现了较多散在的致密圆形矿化结节,萃取染色后分光光度检测两者无明显差异;体内实验显示实验组种植体周围成骨明显高于对照组。结论：体外pDC316-hOPG-EGFP成功转染大鼠BMSCs,转染hOPG基因的BMSCs能持续稳定的高表达hOPG。转染不影响BMSCs的成骨活性。种植体周围注射hOPG具有促进种植体周围成骨的作用。     

重组人骨保护素抑制破骨细胞及促进羟磷灰石修复去势大鼠下颌骨缺损的研究

目的 探讨转染人骨保护素（hOPG）基因的大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）复合羟磷灰石（HA）支架对去势大鼠下颌骨缺损的修复作用。方法 将重组腺病毒pDC316-hOPG-EGFP转染rBMSCs,蛋白质印迹法和骨磨片试验分别检测hOPG的表达水平和抑制破骨细胞功能;构建骨质疏松大鼠模型,分别将HA支架、未转染rBMSCs复合HA支架、转染rBMSCs复合HA支架植入大鼠下颌骨骨缺损,6周后通过抗酒石酸酸性磷酸酶、苏木精-伊红染色检测骨缺损区破骨细胞及骨修复情况。结果 体外携载有hOPG基因的腺病毒成功转染rBMSCs,转染后的rBMSCs表达具有抑制破骨细胞活性功能的hOPG;表达hOPG的rBMSCs复合HA支架后骨缺损处破骨细胞明显减少,成骨增多。结论 转染hOPG基因的rBMSCs在体内外均具有抑制破骨细胞功能的作用,且转染rBMSCs复合HA支架可促进骨质疏松大鼠的下颌骨缺损修复。     

小鼠增强型绿色荧光蛋白-过氧化物酶体增长因子活化受体γ2融合表达重组腺病毒的构建及表达

目的构建小鼠增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-过氧化物酶体增长因子活化受体（PPAR）γ2基因的腺病毒重组体,并检测其在感染病毒的小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）中的表达。方法从pcDNA flag PPARγ质粒上切取目的片段PPARγ2,克隆入pEGFP-C1和pEGFP-N1,以pEGFP-C1-PPARγ2为模板通过PCR技术获得EGFP-PPARγ2基因,酶切DC315质粒,获得DC315-EGFP-PPARγ2质粒,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox△E1、3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒Ad-EGFP-PPARγ2,酶切鉴定证实构建成功。转染HEK293细胞并检测其体外表达情况,经HEK293细胞扩增后,测定病毒滴度,转染小鼠BMSC,72 h后鉴定其成脂分化情况。结果将pEGFP-C1-PPARγ2和pEGFP-N1-PPARγ2通过脂质体转染入HEK293细胞后,在倒置相差显微镜下观察,前者在细胞核内有较强的绿色荧光,后者的荧光强度则极低。对重组腺病毒进行酶切和PCR鉴定,证实含小鼠EGFP-PPARγ2的Ad5腺病毒载体构建成功。在倒置相差显微镜下观察到BMSC细胞核内有绿色荧光。结论成功构建含小鼠EGFP-PPARγ2的重组Ad5腺病毒载体,为基因辅助的脂肪组织工程技术、抗肿瘤研究等提供了安全有效的转基因载体。     

构建过表达hBMP-7基因重组腺病毒及体外转染犬骨髓基质细胞的研究

目的：构建携带人骨形态发生蛋白7（hBMP-7）基因的重组腺病毒载体,体外转染犬骨髓基质干细胞（dMSCs）,检测hBMP-7的表达。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统,体外构建高效表达hBMP-7重组腺病毒载体,酶切电泳鉴定后体外转染dMSCs,检测转染情况及目的基因的表达。结果：酶切鉴定表明pAd-hBMP-7已成功构建,体外可高效转染dMSCs,RT-PCR方法及免疫细胞化学检测表明hBMP-7可在dMSCs中表达。结论：成功克隆hBMP-7基因并构建重组腺病毒表达载体,证实了其在dMSCs中的表达,为火器伤致颌骨缺损的早期局部基因治疗打下基础。     

腺病毒介导EGFP共转染p16基因对腺样囊性癌细胞的影响

目的探讨以抑癌基因p16为靶基因,腺病毒（Ad）为载体的重组基因治疗药物AdSCMV-p16对人涎腺腺样囊性癌细胞系（SACC-83）的作用。方法含有增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的腺病毒载体（AdSCMV-EGFP）转染SACC-83细胞,确定重组腺病毒载体转染效率。AdSCMV-EGFP为对照组,AdSCMV-p16和AdSCMV-EGFP共转染为实验组分别感染SACC-83细胞,采用RT-PCR方法检测p16基因的表达。应用倒置显微镜观察细胞形态,MTT检测细胞的增殖率,软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果AdSCMV-EGFP在1000viral particles[vp]／cell时转染效率达95％以上。RT-PCR实验组可检测到p16基因表达,而对照组未见表达。细胞单纯转染AdSCMV-EGFP或共同转染AdSCMV-p16后,随时间增长细胞增殖率逐渐下降,共同转染组较单纯转染AdSCMV-EGFP组比变化更明显。软琼脂克隆形成实验显示,共转染组较对照组有更强的抑制细胞克隆形成能力。流式细胞仪检测细胞周期变化显示AdSCMV-EGFP和AdSCMV-p16共转染组G0-G1期细胞比例比单独转染AdSCMV-EGFP组大。结论AdSCMV-p16在体外能明显抑制SACC-83细胞增殖能力和活性,有望成为一种有效的基因治疗药物。     

重组腺病毒-骨形成蛋白7对骨髓间充质干细胞骨向分化影响的实验观察

目的观察骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7重组腺病毒对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）骨向分化的影响。方法构建重组腺病毒载体pAd-BMP-7，测定其滴度。应用pAd-BMP-7和空白载体pAdTrack—CMV分别转染MSC，检测外源基因转染效率，并应用RT-PCR、免疫细胞化学手段检测BMP-7的表达。将MSC分为3组，A组：转染pAd-BMP-7；B组：转染pAdTrack-CMV；C组：转染pAdTrack-CMV＋骨向分化液。观察其矿化结节形成，评价3组细胞骨向分化情况。结果重组腺病毒pad-BMP-7的滴度可达2．0×10^15 pfu／L；外源基因的转染效率为99％，表达时间持续5—7周，3周内表达水平较高。RT-PCR和免疫细胞化学检测证实了BMP-7在MSC中的有效表达。病毒转染后，A组和C组细胞均有矿化结节形成，其中A组矿化结节数目显著多于C组（P〈0．01）；B组无矿化结节形成。结论BMP-7重组腺病毒可有效转染大鼠骨髓MSC，并促进其骨向分化，转染的BMP-7得到了有效表达。     

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?? Objective    To observe the osteogenesis of periodontal ligament cells ??PDLCs?? with human osteoprotegerin??hOPG?? transfection in vivo and vitro. Methods    Ad5-hOPG-EGFP was constructed in vitro and transfected into canine PDLCs. Von Kossa staining?? Real-Time PCR?? ELISA and experiment in nude mice vivo were used to assess the osteogenic indices of hOPG-hPDLCs. Results    Morphologic and histological study demonstrated that hOPG-hPDLCs formed much more and larger mineralized nodules?? and expressed higher level of alkaline phosphates??ALP????osteocalcin??OC?? and bone sialoprotein??BSP?? ??P < 0.05??. RANKL/OPG ratio declined most in hOPG-PDLCs. Transfected collagen membrane group also reflected the better osteogenic ability in nude mice vivo experiment. Conclusion    OPG gene transfection can promote osteogenic ability of PDLCs.     

LIM矿化蛋白1对牙周膜细胞生物学特性的影响

目的以LIM矿化蛋白1（LIM mineralization protein 1,LMP-1）基因构建真核表达载体PET43.1a-LMP-1,转染人牙周膜细胞,观察对其生物学特性的影响。方法采用基因工程技术构建真核表达载体pET43.1a-LMP-1,脂质体法转染人牙周膜细胞,四唑盐比色法和酶联免疫吸附测定法测定真核表达载体pET43.1a-LMP-1转染对牙周膜细胞活性以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的影响。结果与空质粒转染组和空白对照组相比,pET43.1a-LMP-1真核表达载体转染后牙周膜细胞中LMP-1 mRNA和蛋白表达显著增强（P〈0.05）;细胞增殖明显增加;ALP表达明显增强,并随时间延长逐渐上升。结论外源性LMP-1转染进入牙周膜细胞能够促进细胞的增殖和矿化能力。     

LPS对人牙周膜细胞Toll样受体4及下游炎症因子表达的影响

目的：观察革兰氏阴性菌外膜成分脂多糖（LPS）对牙周膜细胞（PDLCs）Toll样受体4（TLR4）及下游炎症因子表达的影响。方法：用浓度为10μg／mL的LPS对牙周膜细胞进行刺激,Western Blot检测牙周膜细胞上TLR4受体表达,同时ELISA检测培养基上清中炎症因子TNF－α、IL－1β的含量。结果：加入LPS后,牙周膜细胞上TLR4蛋白表达增强,炎症因子TNF－α、IL－1β含量增多,且随LPS的刺激时间增加而呈上升趋势。结论：LPS促进PDLCs的TLR4表达,并导致炎症因子分泌增加,TLR4信号通路在牙周炎发病过程中具有重要作用。     

人血小板源性生长因子-B基因转染犬牙龈成纤维细胞的瞬时表达检测

目的 检测携带人血小板源性生长因子-B(hPDGF-B)基因的真核表达质粒在Beagle犬牙龈成纤维细胞内的表达.方法 扩增和鉴定携带hPDGF-B基因的质粒EX-A0380-M03,脂质体介导的方法转染Bealge犬牙龈成纤维细胞,RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA以及Western blot检测hPDGF-BB...     

BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬牙牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的:观察骨形成蛋白(BMP-2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松(Dex)联合应用对犬牙周膜细胞(PDLCs)成骨分化能力的影响。方法:将第4代犬PDLCs分为5组:bFGF+Dex、BMP-2+bFGF、BMP-2+Dex、BMP-2+bFGF+Dex、对照组。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,并应用RT-PCR检测各组PDLCs成骨关键基因OPN、COL-1的表达。结果:第7、14 d,各组ALP表达均较空白组显著增强(P<0.05),其中200μg/L BMP-2+10μg/LbFGF+10-8mol/L Dex诱导组犬PDLCs的ALP活性显著高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR显示,200μg/L BMP-2+10μg/L bFGF+10-8mol/L Dex诱导组OPN、COL-1基因表达最为显著。结论:3种诱导因子两两结合均能增强犬PDLCs成骨能力,但在最佳浓度下3种因子联合应用诱导能力最强(P<0.05)。     

HDAC8过表达慢病毒载体构建、转染及表达的研究

目的:构建大鼠组蛋白去乙酰基转移酶(histone deacetylase 8,HDAC8)基因过表达的慢病毒载体,转染大鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察HDAC8的表达。方法:采用DNA重组技术将HDAC8基因插入到慢病毒表达载体质粒pGC-FU中,重组获得慢病毒载体pGC-FU-HDAC8。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞生产病毒液,用得到的病毒液转染大鼠BMSCs,实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法分析转染前后HDAC8表达情况。结果:测序结果证实HDAC8基因正确插入载体中,成功构建大鼠HDAC8基因过表达载体。大鼠BMSCs转染后HDAC8 mRNA及蛋白表达显著上调。结论:针对大鼠HDAC8基因过表达慢病毒载体构建成功,并能有效增强BMSCs中HDAC8基因的表达。     

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目的探讨以犬牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)为种子细胞,壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙复合物作为支架材料,应用于牙周组织工程的优越性。方法本研究于2010年5月至2011年3月在山西医科大学进行。选择1~2岁的健康雄性杂种犬6只,以每只犬下颌双侧第2、3、4前磨牙为实验牙,建立雄性杂种犬的牙周缺损模型;模型建立后,应用随机化法将其分为空白对照组、壳聚糖组、壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙复合物组,每组2只犬。体外培养犬PDLCs,取第4代细胞接种到支架材料上,并于2h内分别植入犬下颌双侧第2、3、4前磨牙的牙周缺损处;术后8周处死动物,取实验处牙槽骨;经常规固定、脱钙、包埋后,HE染色,光镜下观察牙周组织再生情况。噻唑蓝(MTT)法检测支架材料对犬PDLCs增殖的影响。结果 HE染色结果显示,壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙复合物支架材料用于牙周组织工程,其牙周间隙减小、成骨细胞数量增多较壳聚糖组和空白对照组更为明显。MTT法显示,壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙复合物支架对犬PDLCs的生长、增殖影响与单纯壳聚糖作为支架材料相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论以犬PDLCs为种子细胞,壳聚糖-丝素蛋白-磷酸三钙复合物支架材料较单纯壳聚糖支架材料具有更强的组织相容性和再生能力,更适合应用于牙周组织工程。