中药复方更年春含药血清及其主要单体对β淀粉样蛋白所致细胞损伤的保护作用

目的：观察中药复方更年春含药血清及其主要单体成分对β淀粉样蛋白（amyloid β—protein,Aβ）所致肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞损伤的保护作用。方法：采用Aβ25-35作用PC12细胞构建阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）细胞模型,相差显微镜观察细胞形态改变。运用中药血清药理学方法制备大鼠更年春含药血清,以四甲基偶氮唑盐法观察更年春含药血清及其主要单体芍药苷、黄连素、知母皂苷AⅢ、淫羊藿苷对体外培养的PC12细胞活力的影响及其拮抗Aβ损伤的作用,采用流式细胞仪观察更年春复方含药血清及复方主要单体对Aβ诱导的PC12细胞凋亡的影响。结果：PC12细胞在Aβ25-35作用后,有活力细胞数目减少,细胞间连接较松,胞浆较暗淡,细胞碎片较多,贴壁细胞欠透明,部分发生皱缩,胞浆中有较多颗粒。Aβ25-35剂量、时间依赖性地抑制PC12细胞的活力。更年春含药血清可以增强PC12细胞活力,不同浓度更年春含药血清培养细胞24、48、72h后,其增强PC12细胞活力均在20％浓度作用最强。更年春复方含药血清及复方主要单体之一的黄连素及主要单体混合液（包括芍药苷、黄连素、知母皂苷A-Ⅲ、淫羊藿苷）均有拮抗Aβ对PC12细胞损伤的作用,且均能抑制Aβ诱导的PC12细胞早期凋亡,其中更年春含药血清作用最强,中药单体混合液作用其次,而单体黄连素作用最弱。结论：更年春对AD细胞模型有保护作用,其含药血清作用强于主要中药单体及主要单体的混合液。     

β-淀粉样肽（25-35）对PC12细胞bax和bcl-2基因表达的影响

目的：观察β-淀粉样肽25-35（β-amyloid peptide 25-35,Aβ25-35）诱导PC12细胞凋亡和对bax及bcl-2基因表达的影响。方法：采用MTT法检测PC12细胞的存活率;DNA电泳法观察细胞凋亡时特异性梯状条带;Hochest33258-PI荧光染色观察细胞核形态学改变;RT-PCR检测bax和bcl-2基因mRNA表达变化,Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达变化。结果：随着Aβ25-35浓度的增加,PC12细胞存活率逐渐降低;DNA电泳呈凋亡特异性梯状条带;荧光染色可见细胞核碎裂、核固缩等凋亡特征;bax mRNA及Bax蛋白表达增加,bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表达降低。结论：在Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡过程中,Bax和Bcl-2可能起重要作用。     

Wnt信号通路对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的作用研究

目的观察Wnt信号通路在Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡中的作用。方法 Aβ_(25-35)模拟PC12细胞氧化应激损伤,WST-1法检测PC12细胞的增殖活力,倒置显微镜观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western Blot检测Bax/Bcl-2表达量的变化。结果在一定浓度范围内,Wnt3a呈浓度依赖的增加PC12细胞存活率,改善细胞形态,减少早期凋亡细胞数目,升高细胞Bcl-2/Bax比值,且浓度100 ng/ml时达到最佳效应。结论 Wnt3a可能通过Wnt信号通路抑制过氧化氢(H_2O_2),诱导线粒体凋亡通路,进而发挥保护由Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞损伤。     

Aβ25-35对PC12细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响

目的：：观察Aβ25-35对PC12细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。方法：采用10μmol/L Aβ25-35与PC12细胞共孵育48h建立阿尔茨海默病细胞模型,对照组细胞不加Aβ25-35。采用Hoechst 33258核染色法检测PC12细胞的凋亡情况,免疫细胞化学染色法检测PC12细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果：与对照组相比,实验组细胞Bcl-2的表达明显降低,细胞凋亡率、Bax蛋白的表达和Bax/Bcl-2比值明显升高(P＜0.05）。结论：Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的机制可能与下调Bcl-2表达、上调Bax表达有关。     

姜黄素类似物对Aβ_(25-35)诱导的AD细胞模型细胞凋亡的影响

目的研究姜黄素类似物H8对Aβ_(25-35)(β-amyloid protein 25-35)诱导的PC12细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响。方法 CCK-8法检测Aβ_(25-35)及姜黄素类似物H8的细胞毒性,以Aβ_(25-35)诱导PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)建立AD细胞模型,并使用不同浓度的H8进行干预,通过RT-q PCR法检测各组凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达。结果 H8在实验浓度范围内几乎无细胞毒性,Aβ_(25-35)具有明显的细胞毒性并呈浓度依赖性,经过H8干预后细胞存活率明显升高,其中以20μmol/L的H8作用最明显(P0.001)。经过H8作用后能降低Aβ_(25-35)诱导的Caspase-3、Bax mRNA表达,升高Bcl-2 mRNA表达。结论姜黄素类似物H8能够抑制Aβ_(25-35)诱导的凋亡相关基因,发挥抗凋亡作用。     

原花青素对β-淀粉样肽25-35诱导PC12细胞par-4 和bcl-2基因表达的影响

目的探讨原花青素(PC)对β-淀粉样肽(Aβ25-35)诱导凋亡PC12细胞par-4和bcl-2基因mRNA和蛋白表达的影响。方法采用MTT比色法分析细胞存活率,Hoechst33258-PI荧光染色法检测细胞凋亡,RT-PCR方法检测PC12细胞par-4和bcl-2基因mRNA的表达,Westernblotting检测PC12细胞Par-4和Bcl-2蛋白表达。结果不同剂量(5、10、20、30mg/L)PC预处理PC12细胞1h可剂量依赖性对抗Aβ25-35引起的细胞凋亡,提高PC12细胞的存活率,减少Aβ25-35引起的PC12细胞核固缩、凝聚和碎裂,降低par-4基因mRNA表达及蛋白表达,增加bcl-2基因mRNA表达及蛋白表达。结论PC可剂量依赖性对抗Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用,其机制可能与下调凋亡基因par-4和上调抗凋亡基因bcl-2表达有关。     

蜜环菌多糖含药血清对Aβ25—35诱导PC12细胞损伤保护机制

目的：探讨蜜环菌多糖含药血清对Aβ25—35诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）损伤保护的作用机制。方法：在Aβ25—35诱导PC12细胞损伤模型的基础上加入蜜环茵多糖含药血清,采用比色法检测含药血清对Aβ25—35诱导PC12细胞损伤培养液中乳酸脱氢酶的活力、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力的影响。结果：不同浓度的含药血清对Aβ25—35损伤的PC12细胞的存活率有提高作用,含药血清浓度在5％时达最大值（P〈0．05或P〈0．01）;5％浓度的含药血清可明显降低模型细胞培养液中LDH活力、MDA含量,提高SOD活力。结论：蜜环菌多糖含药血清对Aβ25—35损伤的PC12细胞有保护作用．机制可能与提高细胞抗氧化能力有关。     

蜜环菌多糖含药血清对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤保护机制

目的 :探讨蜜环菌多糖含药血清对Aβ25-35诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)损伤保护的作用机制。方法 :在Aβ25-35诱导PC12细胞损伤模型的基础上加入蜜环菌多糖含药血清,采用比色法检测含药血清对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤培养液中乳酸脱氢酶的活力、丙二醛含量及超氧化物歧化酶活力的影响。结果 :不同浓度的含药血清对Aβ25-35损伤的PC12细胞的存活率有提高作用,含药血清浓度在5%时达最大值(P0.05或P0.01);5%浓度的含药血清可明显降低模型细胞培养液中LDH活力、MDA含量,提高SOD活力。结论 :蜜环菌多糖含药血清对Aβ25-35损伤的PC12细胞有保护作用,机制可能与提高细胞抗氧化能力有关。     

地黄活性成分梓醇抗Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡作用

目的探讨地黄活性成分梓醇对β淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导PC12细胞凋亡的保护作用。方法常规培养PC12细胞,加入不同浓度梓醇,24 h后加20μmol/L Aβ25-35,48 h后观察梓醇的作用,MTT法测定细胞存活率,TUNEL法测定细胞凋亡发生率,半定量RT-PCR检测细胞Bax和Bcl-2 mRNA表达。结果梓醇终浓度1×10-5mol/L和1×10-4mol/L显著提高PC12细胞存活率(P<0.05和P<0.01);1×10-4mol/L显著降低细胞凋亡发生率(P<0.01)。Aβ25-35损伤可引起凋亡相关蛋白BaxmRNA的表达增加,梓醇终浓度5×10-5mol/L和1×10-4mol/L有降低作用(P<0.05和P<0.01);同时Aβ25-35使Bcl-2 mRNA的表达降低,梓醇有提高作用(P<0.05和P<0.01)。结论地黄活性成分梓醇有对抗Aβ25-35损伤引起的PC12细胞凋亡作用。     

雷公藤甲素对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制研究

探讨雷公藤甲素对β- 淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）诱导PC12 细胞损伤的保护作用及其机制。方法通过噻唑蓝（MTT）法确立Aβ25-35诱导PC12 细胞损伤模型的工作浓度;同时利用MTT 法检测1×10-11、1×10-10和1×10-9 mol/L雷公藤甲素对细胞活性的影响,以及雷公藤甲素和Aβ25-35同时处理细胞后对细胞活性的影响。PC12细胞随机分为3组：对照组、Aβ25-35处理组、Aβ25-35和雷公藤甲素处理组。细胞处理24 h后,利用免疫荧光法检测细胞中活化Caspase-3的表达,同时采用逆转录聚合酶链反应检测凋亡相关基因-2 和的表达水平。结果Aβ25-35在10 μmol/L工作浓度下可诱导PC12 细胞复制阿尔茨海默病体外细胞损伤模型,其细胞存活率为（58±6）%;单纯雷公藤甲素在1×10-11、1×10-10和1×10-9 mol/L浓度下处理细胞对细胞活性无显著影响。Aβ25-35处理细胞后,细胞活性降低,活化Caspase-3在细胞中表达升高,同时Bax mRNA表达升高,而Bcl-2 mRNA 的表达下降。然而,雷公藤甲素和Aβ25-35同时处理细胞时,前者能够降低Aβ25-35对PC12 细胞的毒性损伤,且细胞活性随雷公藤甲素浓度的增加而升高;同时活化Caspase-3在细胞中的表达,Bcl-2 和Bax mRNA 表达水平也受抑制。结论雷公藤甲素可能通过调节-3、及-2 基因的表达以抑制细胞凋亡,从而对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤发挥保护作用。     

Neuroprotective Effects of Raloxifene on Aβ25-35-induced Damages in PC12 Cells via Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Pathway

Objective To investigate the neuroprotective effects and the mechanism of this protection of raloxifene (RLX), a selective estrogen receptor modulator. Methods MTT assay and flow cytometry with annexin V-FITC/PI staining were performed to evaluate the neuroprotective effects of RLX on Ab25-35 -induced toxicity. The potential mechanisms were studied by Western blotting in cultured rat pheochromocytoma cells (PC12 cells). Results RLX(1 000 nmol/L), in combination with Ab25-35 (30 mmol/L), increased the cell viability (P<0.001), and reduced the number of apoptotic cells (P<0.05). RLX attenuated Ab25-35-induced loss of Dym (P<0.01). The changing of Dym was similar to the variation of apoptosis. PD98059 (inhibitor of ERK1/2) inhibited the effects of RLX on cell viability and phosphorylation of cleaved caspase-9. No significant difference of cell viability or phosphorylation of cleaved caspase-9 had been found when PC12 cells were incubated with SB203580 (inhibitor of p38MAPK) or SP600125 (inhibitor of JNK). Ab25-35 induced a time-dependent phosphorylation of p38MAPK and JNK. In PC12 cells treated solely with RLX, ERK1/2 was activated (P<0.01). In PC12 cells treated with Ab25-35 and RLX, Ab25-35-induced phosphorylation of p38MAPK and JNK were inhibited (P<0.01 and P<0.001, respectively). Conclusion RLX inhibited Ab25-35-induced cell apoptosis by activating the ERK1/2 pathway in PC12 cells. RLX also attenuated Ab25-35-induced activation of p38MAPK and JNK. The mitochondria pathway was involved in this inhibitory effect.     

中药更年春方通过ERβ及PI3K/Akt信号通路对Aβ25-35致大鼠胎鼠海马神经元损伤的保护作用

 目的 观察中药更年春方（Gengnianchun formula，GNC）通过雌激素受体β（estrogen receptor β，ERβ）及PI3K/Akt信号通路对β淀粉样蛋白25-35片段（Aβ_25-35）致大鼠胎鼠海马神经元细胞损伤的保护作用。方法 采用Aβ_25-35作用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系，通过CCK-8法检测细胞活力摸索Aβ_25-35及GNC含药血清（GNC serum，GS）处理神经细胞的合适浓度及时间。采用Aβ_25-35作用大鼠胎鼠海马神经元构建阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的体外模型，分为无血清对照组、模型组、GS组、空白血清对照（normal saline serum，NS）组和PHTPP（选择性ERβ拮抗剂）组。利用正置显微镜观察细胞形态、CCK-8法检测细胞活力及LDH释放法检测细胞损伤。利用Hoest33258/PI双重荧光染色实验、qRT-PCR及Western blot实验检测细胞凋亡相关指标。结果 与无血清对照组相比，模型组大鼠胎鼠海马神经元胞体及突触出现明显的收缩崩解和细胞碎片、细胞活力下降、LDH释放升高。与模型组和NS组相比，GS组大鼠胎鼠海马神经元胞体及突触的收缩崩解和细胞碎片减少、细胞活力上升、LDH释放减少、PI阳性神经元细胞数目下降、神经元bax/bcl-2 mRNA、cyt-c mRNA水平及bax/bcl-2、cleaved-caspase 3、cyt-c蛋白表达水平下降、p-Akt蛋白表达水平上升。与GS组相比，PHTPP组大鼠胎鼠海马神经元bax/bcl-2 mRNA、cyt-c mRNA水平及bax/bcl-2、cleaved-caspase 3、cyt-c蛋白表达水平上升、p-Akt蛋白表达水平下降。结论 GNC对Aβ_25-35致大鼠胎鼠海马神经元的损伤具有保护作用，此作用是通过ERβ及PI3K/Akt信号通路介导的。     

Propofol may protect PC12 cells from induced apoptosis through the signaling pathway

Background There are two major pathological hallmarks of AIzheimer's disease.One is the progressive accumulation of beta-amyloid (Aβ) in the form of senile plaques; the other is hyperphosphorylated tau,causing neuronal apoptosis.Some inhalation anesthetics,such as isoflurane and desflurane,have been suggested to induce Aβ accumulation and cause AD-like neuropathogenesis.Whether intravenous anesthetics have similar effects is still unclear.We therefore set out to determine the relationship between propofol and AD-like pathogenesis.Methods PC12 cells were cultured in serum-free medium for 12 hours prior to drug treatment.Various concentrations from 5 μmol/L to 80 μmol/L of aggregated Aβ25-35 were added to determine a proper concentration for further study.After exposure to 10 μmol/L Aβ25-35 alone or with 20 μmol/L propofol for 6 hours,PC12 cell viability was determined by MTT assay.Western blotting and immunocytochemical staining were performed to observe the protein expression of the Bcl-2 family,tau phosphorylation at different sites,and tau protein kinases and phosphatases.Results Aβ25-35 induced a decrease in PC12 cell viability in a dose-dependent manner.Exposure to 10 μmol/L Aβ25-35 for 6 hours resulted in the mild cell survival,accompanied by a decline in Bcl-2,and an increase in phosphorylation of GSK-3β and tau at different sites.Compared with the Aβ25-35 group,cells treated with propofol alone showed no significant difference,while cells co-incubated with propofol and Aβ25-35 showed a significantly higher survival rate (P ＜0.01 or P ＜0.05).Tau phosphorylation at Ser396,Ser404 and Thr231 and the level of GSK-3β in PC12 cells increased after exposure to 10 μmol/L Aβ25-35.Co-incubation with propofol attenuated cellular apoptosis by inhibiting tau phosphorylation.Conclusions These data indicate that propofol may protect PC12 cells from Aβ25-35-induced apoptosis and tau hyperphosphorylation through the GSK-3β pathway,therefore it may be a safer anesthesia for AD and elderly patients.     

Aβ25-35诱导PC12细胞周期紊乱及对P53和Cyclin D1基因表达的影响

目的:探讨Aβ25-35诱导体外去血清培养的PC12细胞周期变化及对P53和Cyclin D1基因表达的影响。方法:PC12细胞同步于G0期,采用终浓度为0-45μmol/L或浓度为25μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞,用MTT比色法分析细胞存活率;流式细胞仪检测分析细胞周期的改变;RT-PCR和Western blot从mRNA及蛋白水平检测P53和Cyclin D1基因的变化。结果:随着Aβ25-35剂量的增加,PC12细胞存活率降低(P<0.01);流式细胞仪分析表明去血清培养24 h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25μmol/L Aβ25-35诱导组8,16,24 h与对照组比较,S期百分率明显增加(P<0.01),16 h后细胞凋亡率明显增加(P<0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰);P53 mR-NA表达和P53蛋白表达降低、Cyclin D1 mRNA表达和Cyclin D1蛋白表达增高。结论:Aβ25-35降低去血清培养的PC12细胞存活率,诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期,并阻滞于S期,同时出现凋亡,可能与下调P53的表达,上调Cyclin D1的表达有关。     

水苏碱对阿尔茨海默病体外模型 Aβ25-35诱导 PC12 细胞凋亡的 影响

目的 探讨水苏碱对阿尔茨海默病体外模型Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制。方法 根据GSE85871数据分析水苏碱的差异基因，并使用STITCH数据库鉴定水苏碱的靶基因。用Aβ25-35处理的PC12细胞建立阿尔茨海默氏病体外模型，水苏碱处理PC12细胞后，MTT法测定细胞活力，通过流式细胞术检测细胞周期，并使用qRT-PCR和Western blot检测相关的基因或蛋白质的表达。结果 GSE85871数据显示，水苏碱的差异基因中有37个上调基因和48个下调基因。STITCH数据库的结果显示，RPS8和EED是水苏碱的靶基因。PC12细胞用Aβ25-35处理后，细胞的活力与对照组比较明显下降（61.06±3.32 vs 93.11±5.37，P<0.05），RPS8（0.52±0.11）和EED（0.47±0.12）基因表达水平与对照组比较明显下降下降（P<0.05），同时RPS8（0.62±0.14）和EED（0.60±0.13）蛋白表达水平与对照组（0.93±0.06）比较明显下降（P<0.05），抑制凋亡相关蛋白Bcl-2（0.36±0.02）和p53（0.35±0.03）表达降低（P<0.05）。水苏碱治疗可以改善Aβ25-35的作用，阻断G2/M期细胞周期，RPS8和EED基因表达水平明显升高（P<0.05），Bcl-2和p53的蛋白表达升高（P<0.05）。结论 水苏碱在抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡中起重要作用，其机制可能与调节RPS8和EED从而促进Bcl-2和p53表达并抑制细胞的凋亡有关。     

Protective effect of cyclophilin A against Alzheimer＇s amyloid beta-peptide （25-35）-induced oxidative stress in PC12 cells

Background β-amyloid peptide （Aβ） is considered responsible for the pathogenesis of Alzheimer＇s disease （AD）. Possible mechanisms underlying Aβ-induced neuronal cytotoxicity include excessive production of reactive oxidative species （ROS） and apoptosis. Cyclophilin A （CypA）, exhibits antioxidant properties and protects neurons against oxidative stress induced injury. This study was conducted to demonstrate whether CyPA added to cultured PC12 cells could alleviate Aβ-induced oxidative stress and protect them from apoptosis.
Methods PC12 cells were pre-incubated for 30 minutes with recombinant human cyclophilin A （rhCyPA） in 0.1 nmol/L, 1.0 nmol/L, 10 nmol/L and 100 nmol/L and then incubated with 10 μmol/L Aβ25-35. In every group, cell viability, apoptotic morphology, apoptotic rate, intracellular ROS accumulation, the activities of superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px） of PC12 cells and mitochondrial transmembrane potential were detected. Subsequently, the expression of the active form of caspase-3 was determined by Western blotting.
Results It was shown that cultures treated with 1.0 nmol/L, 1U nmol/L or 100 nmol/L rnL, rhCyPA＋Aβ25-35 had significantly higher cell viability and a lower rate of apoptosis compared with the cultures exposed only to Aβ25-35. In addition, rhCyPA attenuated Aβ25-35-induced overproduction of intracellular ROS and Aβ25.35-induced a decrease in activity of the key antioxidant enzymes SOD and GSH-Px. Furthermore, rhCyPA also attenuated Aβ25.35-induced mitochondrial dysfunction and the activation of caspase-3.
Conclusion CyPA may act as an ROS scavenger, and prevent Aβ25-35-induced neurotoxicity through attenuating oxidative stress induced by Aβ25-35.     

丁苯酞对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的作用及其机制

目的 探讨丁苯酞(NBP)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 不同浓度的NBP(0.1、1.0、10、100 μmol/L)作用到经Aβ诱导或未经诱导的PC12细胞上,然后分别采用细胞存活率检测(MTT)及PI单染、透射电镜方法检测细胞凋亡,采用western印迹法检测Bcl-2和Cyt-C蛋白的表达,进而观察NBP对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡的保护作用.结果 MTT显示不同浓度(0.1、1.0、10、100 μmol/L)NBP组细胞存活率分别为76.5%±1.1%、84.2%±1.3%、89.5%±1.3%、81.9%±1.9%,明显高于模型组(71.7%±1.4%),其中10 μmol/LNBP组最明显,差异有统计学意义(P＜0.05);流式细胞学结果显示10 μmol/L NBP组细胞凋亡率明显低于模型组(P＜0.05);电镜下模型组细胞凋亡特征明显,10 μtmol/L NBP组细胞形态接近正常;Western印迹显示:10 μmol/L NBP组Bcl-2蛋白表达增加,而模型组Bcl-2表达明显减少(P＜0.05);模型组胞质Cyt-C表达最强,而10μmol/L NBP组有较弱的Cyt-C表达(P＜0.05).结论 NBP对Aβ诱导的PC12细胞凋亡有保护作用,其机制可能和NBP增加Bcl-2蛋白水平,抑制Cyt-C从线粒体的释放有关.