香烟烟雾引起的氧化应激在肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤中的作用

香烟烟雾中含有自由基等大量的强氧化剂,因而可以导致氧化应激。氧化应激可对肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)造成损伤,但是其对AECⅡ造成损伤的机制至今还未完全清楚,近期这个领域研究的热点集中在三个方面:氧化应激诱导的AECⅡ凋亡、氧化应激与炎性反应的相互作用对AECⅡ的损伤以及氧化应激对AECⅡ结构和功能的直接损伤。AECⅡ损伤与肺部损伤有密切关系,对其损伤机制的研究,有助于呼吸道疾病的诊断和治疗。     

氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用及JNK信号转导机制

目的:探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cell,ATⅡ)存活、凋亡和JNK(c-jun NH2-terminal kinase)的调控机制.方法:采用过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)刺激原代大鼠ATⅡ细胞,复制活性氧(Reactive oxygen species,ROS)攻击ATⅡ细胞损伤模型.蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测ATⅡ细胞受500μmol/L H2O2刺激后磷酸化JNK的动态变化,四甲基偶氮唑盐反应比色法(MTT法)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,并观察JNK抑制剂SP600125干预前后存活率和凋亡率的变化.结果:ATⅡ细胞在受H2O2刺激后随作用时间的延长细胞存活率下降,凋亡率增加;H2O2刺激可导致JNK的磷酸化激活,使用SP600125后,细胞存活率增加,凋亡率降低.结论:H2O2以时间依赖的方式诱导ATⅡ细胞凋亡,抑制JNK信号激活对氧化应激状态下的ATⅡ细胞可能起到保护作用.     

肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在急性肺损伤中的作用

细胞凋亡 (Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ)又称为程序性细胞死亡(Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ ,ＰＣＤ) ,是一种由基因调控的主动而有序的细胞死亡过程 ,参与机体许多重要的生理及病理过程。目前认为许多参与全身炎症反应的细胞和介质均可对细胞凋亡产生影响 ,因此细胞凋亡已开始成为全身炎症性疾病的研究热点。急性肺损伤 (Ａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ ,ＡＬＩ)是指机体遭受严重感染、创伤、辐射、休克等打击后 ,出现的以弥漫性肺泡毛细血管膜损伤导致的肺水肿和微肺不张为病理特征的一种肺部炎症和通透性增加综合征 ,目前认为是机体…     

艾烟冷凝物对肺泡Ⅱ型上皮细胞A549活性及凋亡的影响

目的观察艾烟冷凝物(PM10采取人体可吸入的艾烟部分)对肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)活性及凋亡的影响。方法体外培养A549细胞,加入不同浓度的艾烟冷凝物,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、荧光显微镜来观察其对A549的细胞活性以及细胞凋亡的影响。结果 MTT法结果显示:与对照组相比,A549的细胞存活率随浓度和时间发生改变,具有明显的时间浓度依赖性;0.12g/L浓度的艾烟冷凝物作用于细胞12 h后可显著提高细胞存活率(P=0.005<0.01);荧光显微镜下观察发现艾烟冷凝物可以引起细胞发生凋亡,且具有浓度依赖性。结论 A549细胞随着艾烟冷凝物浓度的增加、刺激时间的增加而引起细胞活力逐渐下降,表明一定浓度的艾烟冷凝物和一定的刺激时间对细胞具有毒性作用;一定浓度的艾烟冷凝物在较短刺激时间内具有细胞增殖作用,故认为艾烟对细胞的增殖作用可能是艾烟发挥有效作用的重要因素之一;能够引起细胞的凋亡可能是毒性作用的重要因素之一。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺移植中的作用及其进展

随着医学的迅速发展 ,大器官的移植 (如肺移植等 )已成为世界医学研究的热点。到 90年代末 ,全世界已进行肺移植的患者达 35 0 0多人 ,1年存活率为 93% ,5年存活率为 4 0 % ,最长存活时间为 10年 ,显示了肺移植的诱人前景。但是 ,与其它器官移植一样 ,肺移植中同样存在移植肺的保存、缺血再灌注、术后感染、急慢性排斥反应等。1　肺移植与肺泡Ⅱ型上皮细胞[1]目前认为 ,脏器获取前血液动力学的不稳定状态、移植肺再灌注、术后感染、排斥都是导致肺移植后高死亡率的原因。肺移植后肺功能障碍、肺部免疫力低下和存活期较短的重要原因是肺部感…     

周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞早期凋亡现象

目的应用细胞力学的方法探讨周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞,并观察其早期凋亡现象。方法周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,首先观察细胞在不同机械力作用下的凋亡情况,分为对照组和机械牵张组(5%、15%、30%应力,0.5 Hz,机械牵张4 h)。然后给予细胞应力15%、0.5 Hz、机械牵张0~8 h,观察在不同时间点的细胞凋亡。最后给予细胞应力15%,周期性牵张4 h,牵张频率分别为0、0.2、0.5和1 Hz,观察不同周期频率的机械牵张时细胞凋亡情况。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果周期性牵张肺泡上皮细胞A549、0.5 Hz和机械牵张4 h后,细胞早期凋亡随着牵张应力的增加而增加。当给予细胞15%应力和0.5 Hz的机械牵张后,随着牵张时间的延长,早期凋亡细胞的比率增加。给予细胞15%应力,周期性牵张4 h,随着牵张频率的增加早期凋亡的细胞也显著增加。结论机械应力刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞可导致细胞凋亡,这在细胞力学水平为机械通气所致肺损伤提供了实验依据。     

周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞早期凋亡现象

目的 应用细胞力学的方法探讨周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞,并观察其早期凋亡现象.方法 周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,首先观察细胞在不同机械力作用下的凋亡情况,分为对照组和机械牵张组(5%、15%、30%应力,0.5 Hz,机械牵张4 h).然后给予细胞应力15%、0.5 Hz、机械牵张0～8 h,观察在不同时间点的细胞凋亡.最后给予细胞应力15%,周期性牵张4 h,牵张频率分别为0、0.2、0.5和1 Hz,观察不同周期频率的机械牵张时细胞凋亡情况.采用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 周期性牵张肺泡上皮细胞A549、0.5 Hz和机械牵张4 h后,细胞早期凋亡随着牵张应力的增加而增加.当给予细胞15%应力和0.5 Hz的机械牵张后,随着牵张时间的延长,早期凋亡细胞的比率增加.给予细胞15%应力,周期性牵张4 h,随着牵张频率的增加早期凋亡的细胞也显著增加.结论 机械应力刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞可导致细胞凋亡,这在细胞力学水平为机械通气所致肺损伤提供了实验依据.     

肠缺血再灌注时肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡与肺损伤

目的 观察肠缺血再灌注中肺损伤与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的关系及其可能的发生机制。方法 Wistar大鼠,肠系膜上动脉夹闭后松夹造成肠缺血再灌注。不同时间点活杀动物,测肺通透指数、肺泡灌洗液（BALF）和血浆中NO、IL-2含量,分离肺泡Ⅱ型上皮细胞,观察凋亡率。结果与结论 肠缺血再灌注可能引起肺损伤;肠缺血再灌注后肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率上升,再灌注30 min 达高峰;缺血再灌注后血、BALF中NO、IL-2增加;肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率与肺通透指数显著相关,BALF中IL-2水平与肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率显著相关。     

脂多糖诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的机制研究

目的 研究脂多糖诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)凋亡的机制.方法 体外原代培养的AT-Ⅱ分为对照组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)损伤组(LPS浓度10μg/mL),培养24 h后分别进行两组细胞的Fas蛋白免疫组织化学检测和Annexin V/PI双染法流式细胞仪细胞凋亡检测.结果 LPS组Fas阳性率(35.16±2.37)%明显高于对照组(9.01±1.62)%(P《0.05);LPS组的细胞凋亡率(24.98±1.41)%明显高于对照组(6.16±1.03)%(P《0.05);坏死率(14.85±0.99)%亦明显高于对照组(4.00±0.72)%(P《0.0s).结论 Fas/FasL途径可能是LPS诱导AT-Ⅱ细胞凋亡的重要途径.     

氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞MAPKs的激活及N-乙酰半胱氨酸的干预作用

目的探讨氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar type Ⅱ epithelial cells,ATⅡ）丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases,MAPKs）活化的影响及N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC）对MAPKs活化及细胞存活凋亡的干预。方法原代培养大鼠ATⅡ,分为4组：正常对照组、NAC组、H2O2组和H2O2＋NAC组。电镜观察H2O2刺激后细胞形态改变;四甲基偶氮唑盐反应比色法（MTT法）检测各组细胞存活率;流式细胞术检测凋亡率和细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测p-ERK、p-p38和p-JNK的表达。结果与正常对照组比较,H2O2刺激后ATⅡ呈典型凋亡改变,细胞存活率下降（P〈0．05）,凋亡率和细胞内ROS水平上升（P〈0．05）,p-ERK、p-p38和p-JNK的表达也明显增加（P〈0．05）,而NAC干预后可提高细胞存活率,降低凋亡率和细胞内ROS水平,并抑制p-ERK、p-p38和p-JNK的表达。结论氧化应激能激活MAPKs并诱导ATⅡ凋亡,NAC通过清除细胞内ROS和抑制MAPKs的磷酸化而对ATⅡ起保护作用。     

Induction of type Ⅱ alveolar epithelial cells apoptosis in mouse by lipopolysaccharide does not require TNF-α

Objective To examine whether lipopolysaccharide (LPS)-induced apoptosis correlates with TNF-α release by type Ⅱ alveolar epithelial cells (AEC Ⅱ), whether TNF-α knockout (TNF KO) abrogates the induction of apoptosis by LPS and whether TNF-α is sufficient to induce apoptosis in this cell type.Methods AEC Ⅱ were isolated from wild type mice and TNF KO mice. Cells were stimulated with LPS or recombinant murine TNF-α for 24 h. TNF-α in culture supernatant was determined by ELISA following LPS stimulation. Apoptosis was determined by the terminal deoxynucleotidyl transferase end-labeling (TUNEL) assay after treatment with either LPS or TNF-α. Results LPS induced apoptosis in wild type AEC Ⅱ in a concentration-dependent manner. LPS-induced AEC Ⅱ apoptosis was accompanied by an 11-fold increase (from 0.073±0.065 ng/ml in control to 0.94±0.14 ng/ml in 50 μg/ml of LPS, P&lt;0.01) in TNF-α release. However, increasing concentrations (5 or 25 ng/ml) of recombinant murine TNF-α failed to induce AEC Ⅱ apoptosis. In addition, apoptosis did occur in AEC Ⅱ isolated from TNF KO mice following LPS stimulation.Conclusions This study confirms that LPS induces TNF-α release and apoptosis in murine AEC Ⅱ in vitro. Exogenous TNF-α failed to induce AEC Ⅱ apoptosis, and apoptosis occurred following LPS stimulation in cells lacking the ability to produce TNF-α. Taken together, these results suggest that LPS-induced AEC Ⅱ apoptosis occurs by a TNF-α-independent mechanism.     

脂多糖诱导大鼠肺泡II型上皮细胞凋亡的机制研究

目的研究脂多糖诱导大鼠肺泡II型上皮细胞(AT-II)凋亡的机制。方法体外原代培养的AT-II分为对照组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)损伤组(LPS浓度10μg/mL),培养24h后分别进行两组细胞的Fas蛋白免疫组织化学检测和Annexin V/PI双染法流式细胞仪细胞凋亡检测。结果LPS组Fas阳性率(35.16±2.37)%明显高于对照组(9.01±1.62)%(P<0.05);LPS组的细胞凋亡率(24.98±1.41)%明显高于对照组(6.16±1.03)%(P<0.05);坏死率(14.85±0.99)%亦明显高于对照组(4.00±0.72)%(P<0.05)。结论Fas/FasL途径可能是LPS诱导AT-II细胞凋亡的重要途径。     

Primary Culture of Alveolar Epithelial Type Ⅱ Cells and Its Bionomic Study

To establish a better method of primary culture for alveolar epithelial type Ⅱ cells (AEC Ⅱ) and to study its bionomics, alveolar epithelial type Ⅱ cells were isolated by digestion with tryp- sin and collagenase, which were then purified by plated into culture flask coated with rat immu- noglobulin G. The purified AEC Ⅱ were identified by alkaline phosphatase staining, electron mi- croscopy, immunocytochemical staining of pulmonary surfactant protein A (SPA). The SPA expres- sion and transfection characteristics were compared with those of A549 cell line. The results showed that AEC Ⅱ could be isolated by digestion with trysin and collagenase and purified by adhesive pu- rification by using IgG, with a yield of about 2–3×107, and a purity of about 75%–84 %. Cells could be quickly identified with AKP staining. AECⅡ were different from A549 cell line in terms of SPA expression and transfection characteristics. It is concluded that adhesive purification with IgG can improve the purity of AECⅡ, and AKP staining is simple in cell identification. AECⅡ can not be completely replaced by A549 cells in some studies because the differences between them, such as SPA expression.     

Ultrastructure of type II alveolar epithelial cells in rats with acute respiratory distress syndrome.

OBJECTIVE: To observe the ultrastructure of type II alveolar epithelium cells of rats with experimental acute respiratory distress syndrome (ARDS). METHODS: Rat models of ARDS were established via oleic acid injection, and the type II alveolar epithelium was isolated and purified to observe the changes in the ultrastructure of the cells under transmission electron microscope. RESULTS: Observation under transmission electron microscope revealed evidently decreased lamellar bodies in type II alveolar epithelial cells leading to vacuolation in rats with ARDS. CONCLUSION: After proper isolation and purification, the morphological changes in type II alveolar epithelial cells can be more easily observed, and the changes in the lamellar bodies suggest that type II cells play an important role in ARDS.     

Ⅱ型肺泡上皮细胞转染Napsin A基因对肺纤维化的干预作用

目的 探讨Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞对肺纤维化的作用和机制.方法 采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至Ⅱ型肺泡上皮细胞系细胞-A549细胞染色体中并鉴定.予转化生长因子β1(TGF-β1)刺激A549细胞构建体外肺纤维化模型,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化;用MTT法检测A549细胞转基因前后受TGF-β1刺激情况下增殖能力的变化,并绘制生长曲线;分别用RT-PCR和Western印迹方法检测未转基因和转基因A549细胞被TGF-β1干预后其表达E钙蛋白和纤维连接蛋白基因和蛋白水平的变化,以判断其发生上皮-间质转化(EMT)的情况;用Western印迹方法检测A549细胞转基因前后表达黏着斑激酶(FAK)蛋白量的变化,探讨Napsin A干预肺纤维化的机制.结果 重组质粒PLJM1-Napsin A测序结果与设计序列完全符合,转Napsin A基因A549细胞表达Napsin A基因和蛋白均显著高于非转基因细胞组(P＜0.01).细胞经TGF-β1刺激后形态上演变为间质细胞,提示体外构建肺纤维化模型成功.MTT法检测转基因细胞在TGF-β1诱导下其增殖速度减慢(P＜0.05);E钙蛋白的基因和蛋白表达水平在体外肺纤维化模型中明显下调(E钙蛋白mRNA:A549-PLJM1:0.77±0.09,A549-PLJM1-Napsin A:0.79±0.03,A549+TGF-β1:0.41±0.05,A549-PLJM1+TGF-β1:0.40±0.05;E钙蛋白分别为:0. 76±0.06,0.73±0.09,0.20±0.05,0. 22±0.03,P＜0.01),相反纤维连接蛋白则明显上调(P＜0.01),但转染Napsin A基因后其变化幅度减小(P＜0.01,P＜0.05).体外肺纤维化模型中,细胞FAK蛋白表达量增多(A549:0.49±0.04,A549-PLJM1:0.50±0.06;A549-PLJM1-NapsinA:0.48±0.08;A549+TGF-β1:3.49±0.61;A549-PLJMI+TGF-β1:3.54±0.25,P＜0.01),但转基因细胞上调趋势显著小于未转基因细胞组(P＜0.01).结论 转染Napsin A基因至Ⅱ型肺泡上皮细胞可以抑制肺纤维化,其作用机制可能与抑制整合素信号传导通路有关.     

慢病毒介导LOX-1基因RNA干扰抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡

摘要：目的构建大鼠凝集素养氧化低密度脂蛋白受体（LOX-1）RNA干扰慢病毒表达载体并观察LOX-1在氧化应激诱导心肌
细胞凋亡中的作用。方法设计针对大鼠LOX-1的shRNA序列,将shRNA序列插入到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒载体中,构
建慢病毒载体pLL3.7-LOX1。慢病毒载体及包装载体dR8.9、VSVG共转染293FT细胞包装慢病毒。慢病毒侵染H9C2大鼠心
肌细胞,RT-PCR鉴定对LOX-1抑制效率,CCK-8、Hochest33258染色检测LOX-1对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结
果通过双酶切鉴定,证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,抑制LOX-1能抑制H2O2诱导的细胞活
力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较均有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建靶向大鼠LOX-1基因RNAi
慢病毒载体,LOX-1激活可能在H2O2诱导心肌细胞凋亡中发挥重要作用。