miR-205靶定YES1对肺癌细胞A549的增殖抑制作用

目的：利用实时定量RT-PCR技术和双荧光蛋白报告基因分析系统检测miR-205在肺癌组织及A549细胞系中的表达水平以及其直接靶基因YES1,探讨miR-205抑制肺癌细胞A549增殖的可能机制。方法: 实时定量RT-PCR技术检测10例肺癌组织和10例癌旁正常肺组织中miR-205的表达水平;miR-205 mimics和control mimics分别转染A549细胞,利用细胞计数和集落形成实验检测转染后A549细胞的增殖情况。选取表达绿色荧光蛋白的质粒 pcDNA3/EGFP,将YES1 3′UTR的一段特异性序列、YES1 3′UTR（miR-205互补位点）点突变后的序列分别插入该质粒中,构建YES1-3′UTR和mut-YES1-3′UTR的绿色荧光表达质粒。实验分为YES1-3′UTR、YES1-3′UTR与miR-205 mimics、YES1-3′UTR与control mimics、mut-YES1-3′UTR、mut-YES1-3′UTR与miR-205 mimics和mut-YES1-3′UTR与control mimics共6组,均与表达红色荧光蛋白pDsRed2-N1共同转染肺癌细胞系A549,荧光分光光度计进行蛋白定性和定量检测。结果：与癌旁正常肺组织比较,miR-205在肺癌组织及A549细胞中表达水平降低(P<0.05);miR-205mimics 转染组A549细胞增殖率明显低于转染control mimics对照组（P<0.05）;YES1-3′UTR与miR-205 mimics共转实验组荧光蛋白表达水平低于YES1-3′UTR与control mimics共转染组（P<0.01）;YES1蛋白高表达组A549细胞细胞克隆形成数高于细胞对照组（P<0.05）。结论： miR-205可能通过靶定靶基因YES1抑制了肺癌细胞A549的增殖,提示miR-205和YES1有可能成为肿瘤生物治疗的新靶点。     

miRNA let-7a靶向抑制ACVR1B表达

目的：探讨miRNA let-7a对ACVR1B表达的影响。方法：生物信息学分析表明activin receptor type 1B（ACVR1B）是一个let-7a的潜在靶基因。构建ACVR1B 3’UTR野生型（ACVR1B 3’UTR-WT）和ACVR1B 3’UTR突变型（ACVR1B 3’UTR-MUT）双荧光素酶报告载体,分别与let-7a模拟物（let-7a mimic）或let-7a阴性对照（let-7a NC）共同转染HEK293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组细胞的荧光素酶活性。分别转染let-7a mimic、let-7a inhibitor和let-7a NC至HEK293T细胞,采用qRT-PCR和Western blot分别检测ACVR1B的mRNA和蛋白表达水平。结果：ACVR1B 3’UTR含有let-7a潜在的高度保守的结合靶点（77～83位点）。在HEK293T细胞中共转染ACVR1B 3’UTR-WT报告载体的let-7a mimic组比let-7a NC组荧光素酶活性组明显降低（P＜0.05）;而共转染ACVR1B 3’UTR-MUT报告载体的let-7a mimic与let-7a NC组其荧光素酶活性差异无统计学意义（P＞0.05）。在HEK293T细胞中let-7a mimic转染组中ACVR1B的mRNA和蛋白水平均低于let-7a NC组和let-7a inhibitor组（P＜0.05）。结论：ACVR1B是let-7a潜在调控的靶基因,miRNA let-7a可以直接抑制HEK293T细胞中ACVR1B基因的表达。     

miR-135a/b逆转肺癌A549/CDDP细胞对顺铂耐药性及相关机制研究

目的:研究miR-135a/b对肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP顺铂耐药的影响?方法:运用实时荧光定量PCR检测miR-135a/b在A549和A549/CDDP 细胞株中的差异表达;MTT法检测转染后A549及A549/CDDP细胞对CDDP的敏感性;构建MCL1-3′-UTR荧光素酶报告质粒验证miR-135a/b的靶基因;Western blot检测转染前后细胞MCL1蛋白的表达差异;流式细胞术检测转染后耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响?结果:miR-135a/b在A549/CDDP细胞中表达量降低;在耐药株中上调miR-135a/b后显著增加细胞对顺铂的敏感性;荧光素酶实验证实MCL1是miR-135a/b的靶基因;抗凋亡蛋白MCL1在A549/CDDP细胞中呈高表达,上调miR-135a/b明显抑制耐药细胞中MCL1蛋白的表达;miR-135a/b显著增加A549/CDDP细胞对顺铂诱导的凋亡?结论:miR-135a/b通过靶向调控MCL1蛋白表达增加NSCLC细胞对顺铂的敏感性和凋亡?     

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。     

基于T7RNA聚合酶／启动子的细胞融合报导系统载体的构建

目的：建立T7RNA聚合酶／T7启动子载体系统,作为观察细胞融合是否成功的报导系统。方法：设计并合成引物从BL21细菌中扩增T7RNA聚合酶序列,并将其克隆进入真核表达载体pRc／CMV2中,作为RNA聚合酶的供体。T7RNA聚合酶特异性识别的r17启动子人工合成,构建于荧光素酶的表达载体pGL3中,利用其荧光素酶基因作为报导基因。两质粒共转染A549细胞和VeroE6细胞,检测荧光素酶的表达。结果：共转染pRc／CMV2。T7RNAP和pGL3-T7的A549细胞和VeroE6细胞的荧光强度分别为57745±7747和43679±8616,转染质粒pGL3-T7的细胞空白对照荧光强度1034±201和1091±157,分别与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：成功构建了T7RNA聚合酶/T7启动子载体的细胞融合报导系统,可应用于细胞融合的相关实验研究中。     

人miRNA let 7a2质粒的构建及其表达

目的构建人miRNA let 7a2真核表达质粒,检测其在肺癌细胞A549中的表达。方法以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板,将RT PCR扩增let 7a2的前体（pre let7a2）序列, 克隆至pSilencer4.1 CMV neo表达载体中,构建pSilencer4.1 let7a2重组质粒,转染A549细胞,采用RT PCR法检测pre let7a2的表达;构建let 7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR Report let7a2T,与pSilencer4.1 let7a2质粒共转染A549细胞,测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用;采用MTT比色法检测pSilencer4.1 let7a2转染对A549细胞增殖的影响。结果构建的人let 7a2真核表达质粒pSilencer4.1 let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIR Report let7a2T经酶切及测序鉴定正确;pSilencer4.1 let7a2质粒转染A549细胞后,RT PCR检测pre let7a2表达较对照组明显增强;MTT比色法显示let 7a2对A549细胞增殖有抑制作用。pSilencer4.1 let7a2 质粒和pMIR Report let7a2T质粒共转染A549细胞后,通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照组降低,显示let 7a2表达质粒转染A549细胞后,可有效表达let 7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let 7a2。 结论成功构建了人let 7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达。     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达对肺癌细胞顺铂耐药的影响

目的:研究miR-181a/b在肺癌细胞顺铂耐药形成中的作用?方法:运用miRNA实时定量PCR方法检测miR-181a/b在肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP与母代A549细胞中的表达差异,运用Western blot检测A549/CDDP细胞与母代细胞抗凋亡蛋白BCL2?MCL1和XIAP的表达差异,分别构建BCL2?MCL1和XIAP的3′UTR荧光素酶报告质粒验证miR-181a/b的靶基因,在耐药细胞中瞬时转染miR-181a/b模拟物以检测上调miR-181a/b对A549/CDDP细胞中BCL2?MCL1和XIAP蛋白表达及耐药性的影响,并运用流式细胞术检测转染后耐药细胞对CDDP(Cisplatin,顺铂)诱导凋亡的影响?结果:在A549/CDDP细胞中miR-181a/b均呈低表达,而抗凋亡蛋白BCL2?MCL1和XIAP则呈高表达,荧光素酶报告实验证实BCL2?MCL1和XIAP是直接受miR-181a/b调控的靶基因,在耐药细胞中上调miR-181a/b显著抑制BCL2?MCL1和XIAP蛋白表达水平,显著增加耐药细胞对顺铂的敏感性,并显著增加耐药细胞对顺铂诱导的凋亡?结论:miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达可显著增加A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性?     

miR-196a2成熟区单核苷酸多态性对靶基因LSP1表达的影响

目的:研究miR-196a2成熟区单核苷酸多态性rs11614913(T/C)对预测靶基因LSP1表达的影响.方法:构建含有不同基因型miR-196a2的真核表达载体pCDNA3.1-miR196a2-C和pCDNA3.1-miR196a2-T;同时利用化学合成含有不同基因型的成熟miR-196a2探针miR-196a2-C和miR-196a2-U.将靶基因LSP1的3'UTR序列克隆至pMIR-REPORTTM Luciferase载体中而获得LSP1报告基因载体pMIR-LSP1.采用所构建的miR-196a2真核表达载体以及化学合成的成熟miR-196a2探针分别与靶基因LSP1报告基因载体组建两套转染体系.分别共转染于HEK293、A549和CHO 三种细胞后进行荧光素酶活性分析.结果:miR-196a2真核表达载体与靶基因LSP1报告基因表达载体共转染于HEK293、A549和CHO三种细胞后进行荧光素酶活性分析.pCDNA3.1-miR196a2-C等位基因荧光素酶相对活性与pCDNA3.1-miR196a2-T等位基因相比均有显著降低(P<0.05);含不同基因型的化学合成的成熟miR-196a2探针与靶基因LSP1报告质粒共转染HEK293、A549和CHO三种细胞,miR-196a2-C等佗基因荧光素酶活性与miR196a2-T等位基因相比也有显著降低(P<0.05).结论:荧光索酶活性强弱间接反映了miR-196a2与靶基因LSP1结合能力的大小.当miR-196a2成熟区rs11614913位点为C时,miR-196a2可能更为有效地与预测靶基因LSP1结合,从而在转录后水平调控靶基因表达.     

miR-129通过抑制T细胞因子4的表达影响肺癌A549细胞的上皮间质转化

目的: 探讨miR-129对肺腺癌细胞系A549中T细胞因子4（TCF4）的表达及上皮间质转化（EMT）进程的影响及其机制。方法: 将miR-129寡核苷酸片段miR-129 mimic转染A549细胞,实时定量PCR验证转染效率。实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测转染后A549细胞TCF4、E-钙黏蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平。设计合成miR-129 mimic,将其与TCF4 3′-UTR报告基因质粒共转染HEK-293细胞,检测miR-129对TCF4报告基因质粒荧光素酶活性的影响,证实TCF4是miR-129的靶基因。结果： 实时定量PCR及蛋白质印迹结果均表明,上调miR-129表达后,A549细胞TCF4、波形蛋白表达明显下调（P<0.05或P<0.01）,E-钙黏蛋白表达明显上调（P<0.01）。miR-129明显抑制TCF4报告基因质粒荧光素酶活性（P<0.01）。结论： miR-129通过抑制TCF4的表达阻遏A549细胞的EMT进程。     

5-杂氮-2＇-脱氧胞苷对肺癌细胞小分子RNA let-7a-2表达的影响

目的：观察去甲基化药物对人肺癌A549和H1299细胞增殖、凋亡以及小分子RNA let-7a-2表达的影响.方法：以不同浓度的5-杂氮-2＇-脱氧胞苷（DAC）对肺癌细胞进行处理后,CCK-8检测对细胞增殖的影响,AnnexinV-PI双染法检测对细胞凋亡的影响,qRT-PCR对let-7a-2的表达进行检测.结果：A549和H1299细胞经不同浓度DAC处理后细胞增殖受到明显抑制,以60μM浓度DAC处理后d5抑制率分别为（40.80±6.50）％和（47.24±4.95）％（均P＜0.05）,同时细胞呈现显著性早期凋亡,凋亡百分比分别达（64.58±4.21）和（59.61±5.69）（均P＜0.05）.20μM、40μM、60μM DAC处理后let-7a-2的表达量在A549中分别为（10.86±0.30）、（5.02±2.83）、（17.79±1.95）,比对照组（1.12±0.24）显著上调;在H1299中分别为（55.13±5.69）、（35.67±4.13）、（14.94±2.46）,比对照组（1.31±0.56）显著上调.结论：DAC处理可抑制肺癌A549和H1299细胞增殖、促进细胞凋亡,上调let-7a-2的表达,let-7a-2基因调控区域超甲基化可能是其在肺癌细胞中表达异常的机制之一.     

人 MicroRNA335的预测靶基因 CCL11 CCL26及 SOX4的鉴定

目的：验证人 MicroRNA335(hsa-miR-335)与嗜酸细胞趋化因子1(CCL11)、嗜酸细胞趋化因子3(CCL26)、SOX4的靶向调控关系。方法选择网络在线的生物信息学软件 miRanda 和 TargetScan 共同预测为 hsa-miR-335靶基因的 CCL11、CCL26、SOX4作为研究对象。构建 CCL11、CCL26、SOX4基因3′端非翻译区(3′UTR)双荧光素酶报告基因载体 pMIR-RE-PORT-CCL113′UTR、pMIR-REPORT-CCL263′UTR、pMIR-REPORT-SOX43′UTR;采用 Lipofectamine 2000将真核表达质粒pMIR-REPORT-CCL113′UTR、pMIR-REPORT-CCL263′UTR、pMIR-REPORT-SOX43′UTR、阳性对照质粒分别与 Pre-miRTM miRNA335 Precursor 或阴性对照质粒共转染到293 T7/17细胞;双荧光素酶报告基因检测系统检测 CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR 与 Hsa-mir-335共转染萤火虫(Firefly)和海洋腔肠(Renilla)荧光素酶活性,并与阴性对照对比。结果hsa-miR-335对SOX4的荧光表达有显著的抑制作用(P <0.01),但并不影响 CCL11、CCL26荧光素酶活性(P >0.05)。结论hsa-miR-335可靶向调控 SOX4,而对 CCL11、CCL26的表达无影响。     

雌激素受体Arg548／Cys548基因突变导致受体的高敏感性

目的：研究雌激素受体新突变Arg548／Cys548对受体介导的下游基因表达调控的影响,并探讨其机理和在女孩性早熟中的作用。方法：利用已构建的雌激素受体反应元件报道质粒pGL3-promoter-ERE,分别与野生型ESR1表达质粒PsG5-wtER和定点突变受体表达质粒PSG5-mutER共转染cMF-7和MDA—MB-231细胞,转染后加入雌激素、类似物和拮抗物处理,检测转染细胞的荧光素酶活性值。结果：转染突变型受体的CMF-7和MDA-MB-231细胞的荧光素酶活性值明显升高,在生理浓度雌激素及类似物植物类雌激素异黄酮刺激下,Cys548突变型受体基因转染比野生型受体转染的CMF-7和MDA231细胞均表现出显著强烈的增加萤火虫荧光素酶的活性,表现高敏感的特性;单独加入TAM后荧光素酶活性值没有变化,而同时加入E2和TAM后荧光素酶活性值比加入E2的荧光素酶活性值则明显下降。结论：Cys548突变受体在体外具有较高的敏感性,对药物雌二醇及类似物反应敏感,拮抗剂TAM对受体的活性没有抑制作用,却能竞争性降低雌激素及类似物的作用。     

人同源盒基因Nkx3.1启动子的克隆及活性测定

目的：克隆Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段，构建pGL3-1．06kb载体，测定其启动子活性。方法：采用PCR方法从人基因组DNA中扩增Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL3-basic载体中，与内参照质粒pRL-Tk共转染前列腺癌LNCaP细胞，通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性。结果：PCR扩增的1．06kb片段经测序正确无误；pGL3-1．06kb转染LNCaP细胞48h后，双荧光素酶活性测定M1／M2=2．7，为pGL3-control活性的1．5倍，为pGL3-basic活性的50倍。结论：克隆的人Nkx3．1基因5’上游1．06kb片段具有较强的启动子活性。     

SARS-CoV 5''''UTR在基因转录中的启动子活性

目的了解SARS-CoV不同毒株5′UTR RNA的构成特点和差异及其空间结构；研究该序列在真核细胞中的启动子活性。方法用软件DNAStar-MegAlign和BLAST分析SARS-CoV5′UTR序列同源性、RNADraw3．0预测二级结构；构建5′-UTR cDNA序列驱动的荧光素酶基因表达质粒pGL3-5′-UTR，转染HepG2细胞，检测萤火虫荧光素酶的表达；构建一套缺失突变质粒，使其分别3′端残留三个、两个、一个和零个（完全缺失）茎环，检测报告基因的表达；采用5′RACE，查找转录起始位点；将pGt3-5′UTR转染A549、HepG2、VeroE6、HeLa和ECV304．检测报告基因的表达差异。结果SARS-CoV5′UTR全长为264nt，18株有缺失突变均位于5′端。101个SARS-CoV 5′UTR序列中．共发现5个点突变位置：SARS-Cov5′UTRRNA可形成稳定的二级结构。Stem-loop-Ⅱ含多个茎环结构，形成复杂的假结；pGL3-5′-UTR有明显的萤火虫荧光素酶表达；当4个茎环都具备时，荧光素酶相对活性是SV40启动子的约43％；失去第一个茎环后。是SV40启动子的约45％；而失去前两个后，则不表达荧光素酶；转录起始位点在SARS-CoV5′UTR的第56位核苷酸；在五种不同细胞中，表达强度由高到低依次是：A549、HepG2、ECV304、HeLa和VeroE6。结论①SARS-CoV5′UTR序列保守，二级结构可形成4个茎环结构域；②SARS-CoV5′UTR有启动子活性；③在二级结构中，与启动子活性有关的结构域在前两个茎环；④SARS-CoV5′UTR在调控基因转录时，第56位核苷酸及其下游的TRS具有重要作用；⑤多种组织或器官都可为SARS-CoV5′UTR发挥启动子功能提供辅助因子，而以肺源性细胞最为适合。     

FOXP3基因3＇-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的：构建FOXP3基因3＇-UTR双荧光素酶基因报告载体,并通过检测荧光素酶活性,初步分析可能调控FOXP3基因表达的miRNAs.方法：利用PCR方法,根据FOXP3基因3＇-UTR序列信息设计其扩增引物,以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增FOXP3基因的3’-UTR序列,将其克隆到pmiRB-REPORT双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与FOXP3基因3’-UTR相互作用的miRNAs;利用LipofectaminTM 2000试剂将miRNAs mimics与构建好的FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶报告载体共转染于常规培养的293T细胞中,然后使用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,并与空白对照相比较.结果：经酶切及基因测序验证,成功构建含有FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体;Targetscan软件预测显示,FOXP3基因3’-UTR可能是miR 608的作用靶位点;双荧光报告显示,miR 608 mimics组比空白对照组[（0.700 0±0.016 41）比（1.000±0.055 75） （P＜0.001）] FOXP3基因3’-UTR双荧光素酶基因报告载体的荧光素酶活性下降30％.结论：FOXP3基因3’-UTR段双荧光素酶基因报告载体构建成功,初步证实miR 608对FOXP3有调控作用.     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。