离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原;经成骨培养液诱导培养后,对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定.结果 分离的骨髓间充质干细胞2 h后贴壁,贴壁细胞平均10 d[]形成克隆,细胞表型稳定.诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,Von.ossa染色可见矿化结节.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性.     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植修复关节软骨缺损的研究

目的:研究将体外培养的兔骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法, 探讨其作为组织工程化骨的种子细胞的可行性.方法:采用Percoll分离液,从兔的骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞,用低糖型的DMEM( Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸进行培养.诱导2周后钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达, 诱导4周后VonKos-sa染色检测钙结节形成.结果:第3代兔MSCs呈典型的成骨细胞形态,诱导2周ALP染色阳性率达80%,诱导4周后VonKossa染色可见钙结节形成.结论:经过分离纯化后的兔骨髓基质细胞在体外培养条件下可以分化为成骨细胞.     

犬骨髓间充质干细胞体外分离培养及分化鉴定

目的:建立犬骨髓间质干细胞(dog bone mesenehymal stem cells,dBMSCs)的体外分离、培养、纯化及鉴定的方法。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离d BMSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养。诱导dBMSCs向成骨、成脂细胞分化,并分别以矿化(钙)结节茜素红染色、油红O染色鉴定。结果:dBMSCs在体外分离培养扩增,形态呈长梭形成纤维细胞样,通过成骨、成脂诱导分化鉴定其为dBMSCs。结论:密度梯度离心法结合贴壁筛选法能有效的获取dBMSCs,所分离培养的d BMSCs同时具有多向分化潜能,是组织工程研究中理想的种子细胞。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

早期贴壁分离并机械刮除纯化法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系

①目的探讨早期（60-80分钟）贴壁分离法建立兔骨髓间充质干细胞体外培养体系，对细胞贴壁分离的时机以及传代后的形态变化的影响。②方法采用早期贴壁分离方法及机械刮除纯化法纯化问充质细胞，并用钙钴法染色检测细胞的ALP表达情况、使用成骨诱导荆诱导间充质细胞。用茜素红染色观察矿化结节的形成。③结果第一代细胞碱性磷酸酶染色呈阳性；经条件培养基定向培养5天的细胞呈集落生长，并形成钙结节，茜素红染色阳性。④结论采用早期贴壁分离法可以短期内得到大量较纯的免间充质干细胞。在诱导剂作用下可成功分化成为成骨细胞，是培养骨组织工程用途的种子细胞的理想方法。     

共培养大鼠内皮祖细胞对白体骨髓基质干细胞成骨作用的影响

目的探讨体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）与自体骨髓基质细胞（BMSCs）共培养时对BMSCs成骨作用的影响。方法采用密度梯度离心法分离、培养大鼠BMSCs和EPCs,培养细胞分为四组：A组（BMSCs组）、B组（EPCs组）、C组（BMSCs成骨诱导组）及D组（BMSCs和EPCs联合培养组）。通过观察细胞克隆形态、免疫细胞化学、细胞增殖、碱性磷酸酶活性,从酶学、组织学及生化等不同方面观察EPCs对BMSCs成骨活性及生长情况的影响。结果免疫细胞化学染色证实C组培养的细胞具有晚期EPCs的特性。倒置相差显微镜、HE染色均证实共培养的BMSCs和EPCs生长良好,并能够形成与单纯成骨诱导培养的BMSCs相似的钙结节。MTr检测结果：各组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）。碱性磷酸酶活性检测结果：C、D组显著高于A、B组（P〈0．05）。结论EPCs和BMSCs联合培养具有良好的细胞相容性,EPCs能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力。     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

益气养阴方影响Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的实验研究

目的 通过对Lewis肺癌移植鼠肿瘤生长及肿瘤组织中Notch信号表达、CD4+CD25+ Treg细胞变化的观察,探讨益气养阴方干预肺癌的量效关系及机制。 方法 将肺癌移植小鼠随机分为4组,模型组只行造模;中药组按小鼠体重按不同剂量灌胃给药分为等效剂量组、大剂量组;化疗组以CTX腹腔注射化疗。记录各组小鼠瘤体大小,观察期满后留取标本行Notch信号表达检测。 结果 ①肿瘤相对体积(RTV)及肿瘤相对抑制率:大剂量组RTV低于其他3组(P＜0.01),化疗组RTV低于等效剂量组(P＜0.05);大剂量组肿瘤抑制率较其他3组高(P＜0.05)。②肿瘤组织中Notch信号通路表达及CD4+CD25+ Treg细胞:等效剂量组Notch1 mRNA表达及CD4+CD25+ Treg细胞高于化疗组(P＜0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组低(P＜0.05);等效剂量组Notch3 mRNA表达与化疗组比较差异无统计学意义(P＞0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组Notch3 mRNA表达量降低(P＜0.05);等效剂量组、高剂量组、化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达均较模型组降低(P＜0.05),等效剂量组与化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达量降低(P＞0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达量降低(P＜0.05)。 结论 益气养阴方剂有抑制Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的作用,此种作用与益气养阴方剂的药物用量之间存在量效关系,且此种关系提示较大剂量的益气养阴方用量可能更有利于抑制Lewis肺癌细胞生长,而这种抑制作用与益气养阴方剂调控肿瘤组织中Notch1信号通路及CD4+CD25+ Treg细胞有关。      

抗原致敏树突细胞激活细胞毒性T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的 利用新型诱导剂钙离子载体(CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞(PBMC)生成树突细胞(DC),观察DC刺激细胞毒性T细胞(CTL)对人白血病细胞K562细胞产生的特异性杀伤作用.方法 采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分2组培养:传统方法组,加人rhGM-CSF+重组人白细胞介素4+重组人肿瘤坏死因子-α;新型诱导剂组,加入rhGM-CSF+CI A23187.培养开始前,予K562细胞冻融抗原致敏,培养96 h后收集负载抗原的DC.光镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测DC细胞的表面标志;四甲基偶氮唑盐比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力、DC对K562细胞的抑制作用和DC激活的CTL细胞对K562细胞的杀伤作用.结果 与传统方法相比,A23187联合rhGM-CSF 诱导培养的DC具有更加典型的树突形态;DC 表面分子CD83、CD1a、CD86、CD40表达(45.2%±1.8%、31.5%±3.9%、40.1%±7.8%、36.4%±6.3%)较传统方法组(16.9%±1.3%、20.4%±3.4%、26.5%±2.2%、22.3%±3.0%)明显高(均P<0.05),且CD14表达(5.7%±0.8%比19.0%±1.6%)明显低(P<0.05);负载K562细胞冻融抗原后的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖作用;对K562细胞有明显抑制作用,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.3±3.8)%比(15.6±2.4)%、(35.6±5.2)%比(22.9±3.2)%(均P<0.05);刺激的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(44.3±6.2)%比(29.9±2.8)%、(61.0±5.2)%比(43.1±4.8)%(均P<0.05).结论 新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟DC,K562细胞冻融抗原冲击该DC激活CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力.     

急性白血病患者外周血T淋巴细胞亚群检测的临床意义

目的探讨急性白血病患者外周血T淋巴细胞亚群变化的临床意义。方法选取确诊但未治疗的白血病患者30例为初治组;确诊并经系统化疗达到完全缓解的白血病患者30例为复治组;健康志愿者30例为正常对照组。采用APAAP法检测初治组、复治组及对照组受检者外周血的T淋巴细胞亚群,包括CD3 T淋巴细胞、CD4 T淋巴细胞、CD8 T淋巴细胞及CD4 /CD8 的比值。结果初治组的CD3 T淋巴细胞,CD4 T淋巴细胞,CD8 T淋巴细胞及CD4 /CD8 的比值较复治组和对照组的比较差异有统计学意义(P<0.05),而复治组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论初治白血病患者的T淋巴细胞亚群变化明显,治疗后T淋巴细胞亚群基本恢复正常,说明细胞免疫与白血病的发生、发展及转归有关。     

CD3AK细胞结合中药治疗原发性肝癌的疗效初步观察

目的;观察ＣＤ３ＡＫ细胞结合中药制剂－消癌胶囊治疗原发性肝癌的效果。方法：选择确诊为不能切除的中晚期肝癌患者１１９例,随机分为三组,Ａ组３０例采用ＣＤ３ＡＫ细胞结合消癌胶囊治疗,Ｂ组４４例单用ＣＤＡＫ细胞治疗,Ｃ组４５例单用化疗。结果：Ａ,Ｂ,Ｃ组部分缓解率分别为３０％,２０．５％,１７．７５,同时Ａ,Ｂ两组患者治疗后Ｔ细胞亚群ＣＤ＾＋３,ＣＤＥ＾＋４,ＣＤ＾＋８有不同程度提高。     

罗哌卡因硬膜外阻滞对T细胞亚群、NK细胞及免疫球蛋白的影响

目的观察无手术应激情况下罗哌卡因硬膜外阻滞对T细胞亚群、NK(natural killer)细胞及免疫球蛋白的影响。方法下腹或下肢手术病人45例,硬膜外穿刺后随机分为三组:H组,高浓度(1%罗哌卡因)组;L组,低浓度(0.5%罗哌卡因)组;N组,对照组,给以试验剂量和相同容量的生理盐水。应用流式细胞术和免疫扩散法测定阻滞前、阻滞后30min、60min、90min外周静脉血T细胞亚群、NK细胞及免疫球蛋白。结果与阻滞前比较,H组30min、60min时CD4 和(CD3 CD4 )/(CD3 CD8 )值显著升高(P<0.05),90min差异不显著(P>0.05);H和L组与阻滞前比较,30、60min时NK细胞显著降低(P<0.05),90min时差异不显著(P>0.05);各组免疫球蛋白IgG、IgA、IgM阻滞前后无显著变化(P>0.05)。结论无手术应激情况下罗哌卡因硬膜外阻滞对细胞免疫功能产生轻微、可逆的抑制作用,对体液免疫功能无影响。     

Dynamic observation and clinical assessment of integrated traditional chinese and western medicine on interleukin-2 system, T Cell and erythrocyte immune system in patients of lung cancer

Ｈｏｗｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｌｉｆｅｉｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｄｕｒｉｎｇｔｈｅｍｉｄｄｌｅａｄｖａｎｃｅｄｓｔａｇｅｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｓｕｂｊｅｃｔｓｆｏｒｍｅｄｉｃａｌｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｃ ｃｏｒｄｉｎｇｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｔｈｅｏｒｙｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）,ｗｈｉｃｈｈｏｌｄｔｈａｔｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｉｓｍａｉｎｌｙｄｕｅｔｏＤｅｆ…     

阿米福汀在非霍奇金淋巴瘤患者骨髓间充质干细胞体外化疗损伤中的保护作用

目的研究阿米福汀（WR-2721）在保护非霍奇金淋巴瘤（NHL）来源的骨髓间充质干细胞（MSC）免受化疗药物依托泊甙（VP-16）体外损伤中的作用,为临床细胞移植治疗提供依据。方法获取NHL患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增,后按处理因素分为空白对照组（A）、WR-2721组（B）、WR-2721＋VP-16组（C）和VP-16组（D）,分别计数细胞绘制生长曲线,流式细胞仪检测其免疫表型及凋亡,甲基纤维素半固体培养、MSC作为滋养层检测其支持造血能力,油红O染色和Von Kossa染色检测MSC向脂肪和骨的分化。结果各组因素对MSC免疫表型无影响。（B）组MSC的增殖、凋亡和支持造血能力较空白对照组差异无统计学意义（均P〉0．05）;（C）组MSC的增殖和凋亡较（D）组差异有统计学意义（均P〈0．05）,其支持造血能力均明显高于（D）组（P〈0．05）。各组MSC均能被诱导分化为骨和脂肪。结论WR-2721能显著降低MSC遭受化疗药物VP-16的体外损伤,其对NHL骨髓来源MSC体外的增殖、凋亡、免疫表型、造血支持能力和分化能力无明显影响。     

生长激素对腹部外科手术后患者机体免疫功能的影响

目的 :观察重组生长激素 ( rh GH)对手术后患者机体免疫功能的影响。方法 :选择 30例腹部外科手术病人 ,入院后随机分为 3组 ,1组 :肠外营养治疗加用生长激素 ;2组 :肠外营养治疗组 ;3组 :正常补液组。其中 1组在术后第 2天开始给予生长激素皮下肌注 ,连续 7d。分别于手术前 1d、手术后第 3、5、7d检测血清免疫球蛋白变化及 T细胞亚群的变化。结果 :手术后第 3天检测结果表明 3组患者免疫球蛋白、CD3+、CD4 +、CD4 +/CD8+等指标均有不同程度的下降 ,手术后第 5天检测结果表明 1、2两组检测指标有上升趋势 ,手术后 7天检测结果表明 1组患者检测指标基本恢复正常 ,1组与 2、3组比较差异有显著性 ( P<0 .0 1)。结论 :生长激素对手术后患者免疫功能的恢复有显著促进作用。     

颈动脉粥样硬化斑块中亲环素A/CD147表达及阿托伐他汀干预的影响

目的：探讨兔颈动脉粥样硬化不稳定斑块中亲环素A(cyclophilin A, CyPA)、基质金属蛋白酶诱导因子CD147表达机制及阿托伐他汀干预对其表达的影响。方法：24只新西兰大白兔分为3组,正常组(A组)8只,余16只给予球囊损伤颈总动脉和高胆固醇喂养12周,随机分成模型对照组(B组,n=8,不接受药物处理)和阿托伐他汀干预组[C组,n=8,阿托伐他汀2.5 mg/(kg.d)],干预4周后给予鲁塞尔氏蛙蛇毒和组胺药物触发斑块破裂。测定不同时间点血清TC,TG,HDL-C和LDL-C水平,对粥样斑块组织进行病理分析,免疫组织化学法检测斑块内巨噬细胞及CyPA和CD147蛋白表达,反转录聚合酶链反应检测斑块内CyPA和CD147 mRNA表达。结果：与A组比较,12周末B组和C组血清TC,HDL-C和LDL-C浓度显著增高(均P<0.01);与B组比较,干预4周后C组血清TC和LDL-C浓度显著降低(均P<0.01)。药物触发后B组存活的6只兔中有4只发生斑块破裂及血栓形成,C组存活的7只兔中有1只发生斑块破裂及血栓形成。与B组比较,C组颈动脉斑块中CyPA,CD147及巨噬细胞含量均显著减少(均P<0.01)。结论：CyPA/CD147可能参与了兔颈动脉不稳定粥样斑块的形成,阿托伐他汀可能可以抑制CyPA/CD147的表达而发挥稳定斑块的作用。     

匹多莫德口服液对急性加重期慢性阻塞性肺病患者细胞免疫的影响

目的:探讨匹多莫德口服液对慢性阻塞性肺病(COPD)急性发作期患者细胞免疫功能的影响.方法:将COPD急性发作期患者60例分为治疗组和对照组各30例,另选30例体检的健康老年人为正常对照组;对照组给予祛痰、平喘、抗炎、给氧常规治疗,治疗组除常规治疗外给予匹多莫德口服液,每天2次,每次0.4g,疗程14 d,比较两组治疗...